close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY2078

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(19)
BY (11) 2078
(13)
C1
6
(51) C 12N 7/01, A 01N 63/00, C
(12)
12N 15/00
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ
КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ
(54)
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННОГО
БАКУЛОВИРУСА, ШТАММ ВИРУСА ЯДЕРНОГО ПОЛИЭДРОЗА,
СПОСОБ БОРЬБЫ С НАСЕКОМЫМИ, ИНСЕКТИЦИДНАЯ
КОМПОЗИЦИЯ
(21) Номер заявки: 790
(22) 05.08.1993
(86) РСТ 90/03758, 29.06.1990
(31)373952
(32) 29.06.1989
(33) US
(46) 30.12.1997
(71) Заявитель: ЮНИВЕРСИТИ
ОФ
ДЖОРДЖИА
РИСЕРЧ ФАУНДЕЙШН, ИНК (US)
(72) Авторы: Лоис К. Миллер (US), Девид Р.О'Рейлли
(IE)
(73) Патентообладатель: ЮНИВЕРСИТИ ОФ ДЖОРДЖИА РИСЕРЧ ФАУНДЕЙШН, ИНК (US)
(57)
1. Способ получения генетически модифицированного бакуловируса, отличающийся тем, что проводят инакти
Фиг. 1 А
Фиг. 1 В
Фиг. 1 С
BY 2078 C1
вацию гена вируса, кодирующего фермент экдистероид UDP-глюкозилтрансферазу.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный бакуловирус является вирусом ядерного полиэдроза.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что вирусом ядерного полиэдроза является вирус ядерного полиэдроза Autographa californica (Ас MNPV).
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в геном вируса дополнительно встраивают гетерологический
ген, определяющий синтез белка, влияющего на метаморфоз насекомых.
5. Штамм вируса ядерного полиэдроза Autographa californica АТСС № VR 2244, обладающий инсектицидной активностью.
6. Способ борьбы с насекомыми, предусматривающий нанесение вируса на растение, отличающийся
тем, что используют генетически модифицированный бакуловирус, ген которого кодирующий фермент экдистероид UDP-глюкозилтрансферазу, инактивирован.
7. Способ по п.6, отличающийся тем, что в качестве бакуловируса используют вирус ядерного полиэдроза.
8. Способ по п.7, отличающийся тем, что в качестве вируса ядерного полиэдроза используют штамм вируса ядерного полиэдроза Autographa californica АТСС № VR 2244.
9. Инсектицидная композиция, содержащая активное начало - вирус и агрономически приемлемый носитель, отличающаяся тем, что в качестве активного начала она содержит генетически модифицированный
бакуловирус с инактивированным геном, кодирующим фермент экдистероид UDP-глюкозилтрансферазу, в
эффективном количестве.
10. Инсектицидная композиция по п.9, отличающаяся тем, что в качестве бакуловируса она содержит
вирус ядерного полиэдроза.
11. Инсектицидная композиция по п.10, отличающаяся тем, что в качестве вируса ядерного полиэдроза она
содержит штамм вируса ядерного полиэдроза Autographa californica АТСС № VR 2244.
(56)
1. Биологические средства защиты растений.-М.: Колос, 1974.-C.335-345.
2. ЕР заявка 0225777, С 12 N 15/00, 1987 г.
Предлагаемое изобретение относится к способам и композициям для улучшенного биологического контроля
над насекомыми-вредителями. Более конкретно, данное изобретение относится к использованию палочковидного вируса с измененным геном, продукт которого эффективен в отношении регулирования роста и развития
насекомых. Данное изобретение относится также собственно к генетически видоизмененным палочковидным
вирусам и способам их получения.
Интерес к биологическому способу борьбы с насекомыми-вредителями обусловлен недостатками традиционных
химических пестицидов. Химические пестициды, как правило, воздействуют как на вредные, так и на полезные виды.
Имеется тенденция, что насекомые-вредители приобретают устойчивость к подобным химикалиям, так что быстро
может развиться популяция устойчивых к таким пестицидам насекомых. Далее, остатки химических веществ наносят
урон окружающей среде и, потенциально, здоровью людей. Биологический контроль представляет собой альтернативный способ воздействия на насекомых, который позволяет уменьшить зависимость от химических пестицидов.
Основная стратегия биологического контроля включает использование встречающихся в природе организмов, патогенных по отношению к насекомым (энтомопатогены), и разведение более устойчивых по отношению к насекомым-вредителям культур. Подход к решению этих задач включает идентификацию и
характеристику генов насекомых или продуктов генов, которые могут служить подходящей основой для получения агентов контроля, идентификацию и эксплуатацию ранее не использовавшихся микроорганизмов
(сюда относится также модифицирование существующих в природе непатогенных микроорганизмов с целью
превращения их в патогенные по отношению к насекомым) , модифицирование и улучшение используемых в
настоящее время энтомопатогенов, а также создание методами генной инженерии культур, обладающих
большей устойчивостью к насекомым-вредителям.
К энтомопатогенам, предложенным в качестве биологических пестицидов, относятся вирусы, вызывающие естественные эпизоотии в популяциях насекомых (Heimpel A.M., Japan seminar on microbial control, 1968, p. 51-62) [1]
в том числе бакуловирусы. Палочковидные вирусы (бакуловирусы) представляют большую группу вирусов, инфицирующих только членистоногих насекомых (Miller L.K.(1981), в Genetic Engineering in the Plant Sciences, N. Panopoulous, (ed.) Praeger Publ., New York, pp. 203-224; Carstens (1980) Frends in Biochemical Science 52:107-110; Harrap
& Payne (1979) в Advances in Virus Research. Vol. 25, Lawfer et al., (eds.) Academic Press. N.Y., pp. 273-355). Многие
2
BY 2078 C1
бакуловирусы инфицируют насекомых, являющихся вредителями промышленно важных сельскохозяйственных и лесных культур. Такие бакуловирусы потенциально представляют собой ценные агенты биологического
контроля. Агентством США по охране окружающей среды (U.S. Environmental Protection Agency) рекомендовано к
использованию в качестве инсектицидов четыре палочковидных вируса. Одним из преимуществ бакуловирусов
как биологических пестицидов является их специфичность по отношению к насекомому-хозяину. Бакуловирусы
как группа инфицируют только членистоногих, а каждый индивидуальный штамм палочковидного вируса обычно
инфицирует только один или несколько видов насекомых. Таким образом, они не представляют угрозы ни для
окружающей среды, ни для человека и могут быть использованы без вреда для полезных видов насекомых.
Группа бакуловирусов включает подгруппы вирусов ядерного полиэдроза (ЯПВ), вирусов ядерного гранулеза (ГВ) и палочковидных вирусов, не образующих тела включения. У окклюдирующих форм палочковидных вирусов вирионы (заключенные в оболочку нуклеокапсиды) помещаются внутри кристаллической
белковой матрицы. Такая структура, так называемое тело включения или тело "вкрапления", - это форма нахождения вируса в природе вне организма, которая обуславливает передачу инфекции от организма к организму. Отличительной чертой вирусов ЯП является то, что в каждом теле включения содержатся много
вирионов. Тела включения ЯП вирусов обладают относительно большими размерами (до 5 микрометров).
Тела включения ГВ мельче и содержат по одному вириону. У обеих форм кристаллическая белковая матрица
тел включения состоит главным образом из одного полипептида от 25000 до 33000 дальтон, называемого полиэдрином или соответственно гранулином. Палочковидные вирусы неокклюдирующих форм не производят белок
полиэдрин или гранулин и не образуют тел включения.
В природе инфекция инициируется, когда насекомое глотает загрязненную частицами палочковидных
вирусов пищу, как правило, в виде тел включения. В щелочной среде среднего кишечника насекомого тела
включения диссоциируют, высвобождая обособленные вирусные частицы, которые затем проникают в выстилающие стенки кишечника эпителиальные клетки. Внутри клетки-хозяина палочковидный вирус мигрирует к ядру, где производит процесс репликации. Первоначально в инфицированной клетке синтезируются
некоторые специфичные вирусные белки путем транскрипции и трансляции так называемых "ранних генов".
Эти белки необходимы, кроме других функций, для репликации вирусной ДНК, которая начинается 4-6 часов спустя после проникновения вируса в клетку. Интенсивная репликация вирусной ДНК продолжается
примерно в течение 12 часов после заражения (post - in - fection = pi). Примерно через 8-10 часов pi инфицированная клетка производит большие количества так называемых "поздних продуктов вирусных генов". К
ним относятся компоненты нуклеокапсида, окружающего вирусную ДНК в процессе образования дочерних
вирусных частиц. Дочерние вирусные частицы начинают образовываться примерно через 12 часов pi. Первоначально дочерние вирусы мигрируют к клеточной мембране, где, после выхода на поверхность клетки,
они приобретают оболочку. Подобный неокклюдированный вирус может затем инфицировать другие клетки
насекомого-хозяина. Синтез полиэдрина начинается через 12-18 часов после заражения и к 24 часам pi он
быстро нарастает до очень высокого уровня. В это время наблюдается снижение количества вышедших из
клетки вирусных частиц, и затем дочерний вирус образует тела включения. Образование тел включения продолжается до гибели или распада клетки. Некоторые палочковидные вирусы инфицируют все ткани насекомого-хозяина, так что по завершении процесса развития инфекции все насекомое превращается в жидкость,
при этом выделяется большое количество тел включения, которые далее распространяют инфекцию на другие особи. (Обзор приводится в Thе Biology of Baculoviruses, Vol. I and II, Granados and Federici (eds), CRC
Press, Boca Raton, Florida, 1986).
Одним из существенных недостатков применения палочковидных вирусов в качестве пестицидов является
продолжительный период времени между моментом, когда насекомое заглатывает вирус, и его смертью. В течение
этого времени вредитель продолжает питаться и вредит урожаю. В связи с этим определяющим представляется
уменьшение времени питания насекомого до минимума, т.е. создание пестицида, снижающего питание насекомого
до наступления гибели. Желательно также, чтобы смерть насекомого наступала быстрее. Такие результаты могут
быть получены путем воздействия на вирусный геном, осуществить которое в частности позволяют методы
генной инженерии [2].
Данное изобретение выявляет ген палочковидного вируса и продукт этого гена, влияющий на рост, развитие или
поведение насекомых. Оно обеспечивает способы использования этого гена и продукта этого гена, а также способы
инактивации этого гена или продукта этого гена в целях контроля над насекомыми. В предпочтительном варианте воплощения используют ген egt , который кодирует экдистероид-UDP-глюкозилтрансферазу (ЕGT) вируса AcMNPV.
Экспрессия гена egt палочковидных вирусов вызывает образование ЕGT, которая инактивирует гормоны, обслуживающие линьку насекомых, предотвращая этим линьку или окукливание личинки. Инактивирование гена egt
палочковидных вирусов обеспечивает нормальное протекание линьки и окукливания личинки.
3
BY 2078 C1
Предлагаемое изобретение включает целый ряд агентов контроля над насекомыми с использованием генов egt и
продуктов функционирования этих генов. Эти агенты контроля либо вызывают у насекомого-вредителя несоответствующий синтез белка ЕGT, либо подавляют нормальное функционирование или проявление белка ЕGT, так
что нормальное развитие насекомого нарушается.
Предпочтительно, чтобы организм, содержащий ген egt, представлял собой специфичный для данного насекомого вирус, и чтобы ген egt вируса был инактивирован, что обеспечило бы увеличение продолжительности развития инфицированного этим вирусом насекомого-хозяина. Длительное развитие насекомого-хозяина связано с
изменением его поведения, в частности с понижением питания, и следующим за этим снижением роста насекомого
и более быстрым наступлением смерти. Данное изобретение включает также способ производства улучшенного
вирусного пестицида. Кроме того, оно включает способ контроля над насекомыми-вредителями, который заключается в том, что насекомое-вредитель подвергается воздействию улучшенного вирусного пестицида.
Предлагаемые данным изобретением генетически измененные вирусы являются более эффективными
пестицидами по сравнению с использовавшимися до сих пор вирусами. У палочковидных вирусов, таких,
например, как вирус ядерного полиэдроза Autographa californica (AcMNPV) или вирус ядерного полиэдроза
Orgyia pseudotsugata (OpMNPV), естественно проявляется ген egt. Экспрессия его увеличивает период времени, в продолжение которого инфицированная личинка питается, не страдая от вирусной инфекции. Данное
изобретение включает инактивирование гена egt в геноме вируса. Ген egt можно инактивировать введением
на его место или внутрь него другого гена, например, гена-маркера, кодирующего синтез β-галактозидазы.
Должно быть ясно, что для нарушения гена egt может использоваться любая последовательность ДНК, поскольку она нарушает проявление кодирующей последовательности egt. Можно, напротив, удалить из генома все части гена egt с помощью делеции соответствующего кодирующего сегмента ДНК или удалить либо
изменить регуляторные элементы генома, контролирующие экспрессию гена egt. Палочковидные вирусы с
делециями, инактивирующими ген egt, могут быть также получены последовательным пропусканием вируса
через культуру клеток насекомого. Полученные при этом вирусы с делециями имеют следующее преимущество: они не содержат чужеродной ДНК и отличаются от вирусов дикого типа только отсутствием функционального гена egt. Подобные модифицированные бакуловирусы эффективнее в качестве агентов контроля
над вредителями, чем те, которые применяются в настоящее время. Как простые делеционные мутанты делеции так и пестициды, полученные путем генной инженерии, они должны быть приемлемы для регулирующих ведомств (например, U.S. EРА), поскольку в них не содержится негомологичная ДНК.
Палочковидные вирусы, в которых не проявляется функциональный ген egt, дополнительно могут быть видоизменены за счет введения отличных от egt генов, которые могут воздействовать на развитие насекомого,
повышая этим эффективность таких вирусов как агентов контроля насекомых.
Данное изобретение включает также способ контролирования развития насекомых-вредителей путем инфицирования личинок насекомых мутантным вирусом, в котором интактный ген egt отсутствует или не способен производить функциональный продукт EGT. Личинки, инфицированные мутантным вирусом, стремятся линять и
окукливаться, и, следовательно, период их питания сокращается по сравнению с личинками, инфицированными
диким типом или другими известными в настоящее время вирусами. Зараженные мутантным вирусом личинки
также умирают быстрее, чем инфицированные диким типом или другими применяемыми в настоящее время
вирусами.
Задачей данного изобретения является создание рекомбинантного вируса, который является более эффективным по сравнению с вирусами дикого типа и другими формами, применяемыми в настоящее время. Примером
данного изобретения является рекомбинантный вирус AcMNPV, обозначаемый как vEGTZ, в котором часть гена
egt заменена на lac Z-бактериальный ген, кодирующий образование β-галактозидазы. Как понятно специалистам в
данной области, может быть заменена любая последовательность ДНК, инактивирующая ген egt. Примером реализации данного изобретения является также рекомбинантный палочковидный вирус, обозначаемый vEGTDEL, в котором часть гена egt удалена. Примером осуществления данного изобретения является пестицид на основе
палочковидного вируса с удаленным геном egt. Сюда относятся также палочковидные вирусы, у которых к инактивации гена egt привели мутации, произошедшие естественным путем.
Другой задачей данного изобретения является создание с помощью генной инженерии вируса, который
не только представляет собой эффективный пестицид, но одновременно и безвреден для окружающей среды.
Еще один предмет изобретения - рекомбинантный вирусный пестицид, в котором отсутствует функциональный ген egt и проявляется второй ген, влияющий на развитие насекомых, причем в естественном виде
этот второй ген не присутствует в организме. Указанный второй ген кодирует синтез влияющего на метаморфоз продукта. Таким продуктом гена может быть гормон насекомых, влияющий на развитие насекомого,
или фермент, который инактивирует регулирующий метаморфоз гормон. Особые примеры включают прото4
BY 2078 C1
ракотропный гормон, гормон вылупления и эстеразу ювенильного гормона. Если требуется с целью получения агента контроля ввести в вирус насекомых кодирующие эти белки гены, то этот вирус либо не должен
содержать гена egt, либо ген egt в нем должен быть инактивирован.
Далее задачей данного изобретения является создание инсектицидных композиций, пригодных для использования в сельском хозяйстве. В состав таких композиций входят, как известно, приемлемый в сельскохозяйственном смысле носитель и вирус насекомых, например, палочковидный вирус, предварительно модифицированный
генетически таким образом, что ген egt указанного вируса инактивирован. Такие egt-бакуловирусы могут далее
быть подвергнуты генетическим изменениям, вызывающим экспрессию гетерологичного гена, который кодирует
гормон насекомых, влияющий на метаморфоз, или фермент, инактивирующий такой оказывающий влияние на метаморфоз гормон насекомых. К гетерологичным генам, продукты которых влияют на метаморфоз, относятся, но
не исчерпывают их, проторакотропный гормон, гормон вылупления и эстераза ювенильного гормона. В предпочтительном исполнении инсектицидные композиции, включающие генетически измененные палочковидные
вирусы, предназначены для распыления.
Любая из вышеупомянутых инсектицидных композиций может также включать ингредиенты, стимулирующие питание насекомых. Инсектицидные композиции по данному изобретению насекомое-вредитель
может глотать при нанесении его на растения, и насекомые-вредители, чувствительные к активному агенту
данной композиции, будут демонстрировать пониженное питание и погибнут.
Также задачей данного изобретения является обеспечение модифицированного биологического пестицида, который ингибирует проявление гена egt или функционирование продукта этого гена.
Фиг.1 схематически представляет геном AcMNPV с указанием локализации гена egt. Геном АсMNPV
представлен в единицах карты и в виде карты рестрикции EcoRI и Hind III.
На фиг.2 схематически представлены результаты исследования последовательности гена egt и анализа
этой последовательности. На фиг.2А изображена рестрикционная карта данной области генома. На фиг.2В
показаны результаты компьютерного анализа последовательности на наличие открытых рамок считывания.
Вертикальными линиями показаны терминирующие кодоны, являющиеся сигналами остановки синтеза полипептидной цепи. Последовательность "транслируется" во всех трех потенциальных открытых рамках считывания в каждой нити ДНК (1, 2, 3, 1', 2', 3'). Соответствующая egt открытая рамка считывания (2)
обозначена как EGT.
Фиг.3 представляет схематически структуры областей гена egt вируса AcMNPV (А) и рекомбинантных
вирусов vEGTZ (В) и vEGTDEL (С). Заштрихованный прямоугольник представляет собой ген lac Z.
На фиг.4 схематически представлены электрофорез в геле агарозы и анализ пятен по Саузерну, проводимые для идентификации гена egt палочковидного вируса OpMNPV.
Фиг.5 схематически представляет карту рестрикции вирусного генома OpMNPV.
Фиг.6 представляет график прибыли веса контрольных неинфицированных личинок или личинок четвертого возраста после заражения вирусами AcMNPV дикого типа или vEGTZ.
На фиг.7 приведен график смертности личинок после заражения личинок 4-го возраста вирусами
AcMNPV дикого типа или vEGTZ.
Фиг.8 представляет собой график прибыли веса после инфицирования личинок 5-го возраста вирусами
AcMNPV дикого типа или vEGTZ.
На фиг.9 приведен график смертности личинок после инфицирования личинок 5-го возраста вирусами
дикого типа AcMNPV или vEGTZ.
На фиг.10 приведен график смертности личинок после инфицирования личинок первого возраста вирусами дикого типа AcMNPV или vEGTZ c концентрацией полиэдрических тел включения (ПТВ) 4,8х10
ПТВ/мл.
На фиг.11 показан график смертности личинок после инфицирования личинок первого возраста вирусами
дикого типа AcMNPV или vEGTZ с концентрацией 2,4х10 ПТВ/мл.
Чешуекрылые насекомые в процессе развития от яйца до взрослой особи претерпевают хорошо охарактеризованную последовательность превращений (детальное описание см. Comprеhensive Insect Physiology,
Biochemistry and Pharmacology, Vols, 7 и 8, Kerkut and Gilbert (eds), Pergamon Press, Oxford, 1984).
После выхода из яйца у личинки насекомого начинается период интенсивного питания, в течение которого она
будет несколько раз линять, что обеспечивает ей непрерывный рост. Промежутки времени между последовательными линьками называются возрастными (личиночными) стадиями. По завершении периода роста личинка окукливается и в конце концов превращается во взрослое насекомое. Процессы линьки и окукливания (называемые
собирательно метаморфозом) регулируются совместным действием гормонов нескольких различных групп. Первоначальным стимулом является выделение определенными клетками мозга проторакотропного гормона (РТТН).
5
BY 2078 C1
Это стимулирует секрецию проторакальными железами экдистероидов, которые часто называют гормонами линьки насекомых. Присутствие ювенильного гормона обеспечивает линьку личинки, тогда как в его отсутствии личинка будет окукливаться. Гормон вылупления также представляется важным для осуществления некоторых
связанных с метаморфозом поведенческих изменений.
Палочковидный вирус AcMNPV, используемый в качестве модельной системы для многих исследований
палочковидных вирусов, совершенно неожиданным образом вмешивается в описанный выше процесс развития насекомого. Инфицированные AcMNPV личинки насекомых не способны более линять или окукливаться
в связи с тем, что AcMNPV направляет синтез фермента, известного как экдистероид-UDPглюкозилтрансфераза (EGT), который избирательно инактивирует экдистероиды насекомых.
Авторами данного изобретения идентифицирован кодирующий EGT ген, он простирается от 8,4 до 9,6 единиц
карты генома AcMNPV (фиг.1 и 2). Как показано на фиг.1С, содержащие ген egt фрагменты вирусной ДНК были клонированы в плазмиды puc 19, Bluescript M 13+ и Bluescript M 13-.
На фиг.2 показаны карты рестрикции области egt генома и компьютерный анализ на наличие в данной
области открытых рамок считывания. Только рамка 2 содержит относительно длинную открытую последовательность считывания, которая была идентифицирована как область кодирования гена egt. В таблице 1
приведена последовательность нуклеотидов гена egt и выведенная из нее последовательность из 506 аминокислот. Кодирующая последовательность гена egt простирается примерно от нуклеотида 149 до нуклеотида
1670.
В предпочтительном воплощении данного изобретения ген egt бакуловируса AcMNPV инактивируется
путем замещения его части на бактериальную последовательность, кодирующую синтез β-галактозидазы.
Такой рекомбинантный бакуловирус был обозначен vEGTZ. Во втором варианте предпочтительного воплощения, как показано на фиг.3, часть гена egt вируса AcMNPV удаляется без замены. Сравнение белков, синтезируемых при инфицировании AcMNPV дикого типа и vEGTZ, выявило, что белок EGT представляет
собой пептидную цепь с молекулярной массой 60 КДа, выделяемую инфицированными клетками. Альтернативным механизмом инактивации гена egt вируса насекомых является внедрение гена, который кодирует
синтез влияющего на метаморфоз гормона или инактивирующего такой гормон фермента и который проявляется в инфицированной указанным вирусом насекомых клетке.
Обследования базы данных Генобанка выявило, что от 21 до 22% последовательности аминокислот egt
гомологично UDP-глюкозилтрансферазам млекопитающих. Была выявлена также гомология с UDPглюкозилтрансферазой растений. Сопоставление последовательности аминокислот egt и некоторых этих
ферментов показано в табл. 2.
6
BY 2078 C1
Таблица 1
Последовательность нуклеотидов и предсказанная
последовательность аминокислот гена egt вируса AcMNPV
7
BY 2078 C1
Таблица 1 (продолжение)
8
BY 2078 C1
Таблица 2
Таблица 2 иллюстрирует сопоставление последовательности аминокислот egt и ряда UDPглюкозилтрансфераз других биологических видов. Предсказанная последовательность аминокислот egt
сравнивается с человеческой (HUMUDPGAT) (Jackson et al. (1987) Biochem. J, 242:581; мышиной
9
BY 2078 C1
(MUSUDPGAT) Kimura and Owens (1987) Eur. J. Biochem. 168:515) и крысиной (RATUDPGAT) (Mackenzie
(1987) J. Biol. Chem. 262:9744) UDP-глюкуронозилтрансферазами и с UDP-глюкозилтрансферазой кукурузы
(ZMAYUDPGT) (Ralston et al. (1988) Genetics 119:185) с помощью алгоритма FASTER (Lipman and Pearson
(1985), предлагаемого International Biotechnologies Inc. Буквы верхнего регистра указывают точное совпадение: буквы нижнего регистра определяют замещения, часто встречающиеся среди родственных белков (Dayhoff (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Rescarch Foundation, Vol. 5,
Supplement. 3, Silver Spring, MD; точки обозначают редко встречающиеся замещения, знак дефиса указывает
пропуски в последовательности, знак вставки приводится в местах делеции аминокислот из последовательности. В vEGTZ и vEGTDEL аминокислоты гена egt в промежутке между стрелками удалены. Гомологичность гена AcMNPV известным трасферазе UDP-глюкозы и UDP-глюкуронозилтрасферазе подтверждает
идентификацию этой последовательности AcMNPV как кодирующей последовательности гена egt.
У млекопитающих UDP-глюкуронозилтрансферазы катализируют перенос глюкуроновой кислоты к целому ряду как экзогенных, так и эндогенных липофильных субстратов (смотри обзор в Glucuronidation of
Drugs and Other Compounds, Dutton (ed.), CRC Press, Bcca Raton, Florida, 1986). Эта реакция присоединения
играет существенную роль в детоксикации и безопасном выведении определенных лекарственных препаратов и канцерогенов. Кроме того, через соединения с глюкуроновой кислотой протекают процессы нормального метаболизма и размещения различных эндогенных соединений, таких, как билирубин и стероидные
гормоны. Имеющиеся по системам насекомых данные указывают, что подобные реакции присоединения сахаров включают перенос глюкозы, а не глюкуроновой кислоты (обзор смотри Smith (1977) в Durug Metabolism - From Microbe to Man, Parke and Smith (eds), Тaylor and Francis Ltd, London, pp. 219-232). Как и у
млекопитающих, у насекомых в подобные реакции присоединения вступают разнообразные экзогенные и
эндогенные соединения.
Авторы данного изобретения показали, что EGT-белок вируса AcMNPV представляет собой UDPглюкозилтрансферазу, которая избирательно соединяет глюкозу с экдистероидами, такими как экдизон, 20гидроксиэкдизон и макистерон А (см. табл. 3). Ни лизаты, ни внеклеточная среда неинфицированных клеток
или инфицированных vEGTZ клеток не модифицируют экдизон. Большая часть активной экдистероидглюкозилтрансферазы, вырабатываемой инфицированными AcMNPV клетками, выделяется в межклеточную
среду; только относительно низкий уровень ее активности наблюдается в лизатах инфицированных AcMNPV
клеток.
С использованием гена egt вируса AcMNPV в качестве метки ген egt был идентифицирован, как показано
на фиг.4, и в другом палочковидном вирусе, а именно в вирусе ядерного полиэдроза и Ordyia pseudotsugata
(OpMNPV). Для специалистов должны быть понятны преимущества, предоставляемые этим открытием, то
есть что ген egt любого палочковидного вируса, другого вируса насекомых или самого насекомого может
быть локализован, охарактеризован и выделен аналогичным способом. Гены egt, нуклеотидная последовательность которых не менее чем на 70% гомологична последовательности, приведенной в табл. 1, считаются
эквивалентными этой последовательности, при условии, что гомологичные гены кодируют фермент, представляющий собой экдистероид-UDP-глюкозилтрансферазу.
Функциональными эквивалентами гена egt являются эквиваленты, которые также катализируют инактивацию экдистероидов, таких как экдизон, путем переноса половины глюкозы от UDP-глюкозы к экдистероиду (экдистероидам). Такие функциональные egt-эквиваленты могут быть идентифицированы описанными
здесь методами.
Путем локализации, идентификации и выделения гена egt специалист может, используя положения данного открытия и известные методики, инактивировать этот ген и получить агент, обеспечивающий более
эффективный контроль над развитием и ростом насекомого.
Сравнивая свойства vEGTZ со свойствами AcMNPV дикого типа (wt), авторы данного изобретения показали, что экспрессия гена egt предотвращает линьку или окукливание насекомого. Инфицированные wt AcMNPV
насекомые не линяют и не окукливаются, тогда как насекомые, инфицированные vEGTZ, линяют и стремятся
окукливаться (смотри табл. 4 в примере 11).
За счет подавления линьки и окукливания инфицирование вирусом AcMNPV дикого типа действительно
может удлинить период питания личинки. Личинки, зараженные вирусом дикого типа в начале пятой возрастной стадии (последняя возрастная стадия), продолжают питаться до момента гибели, который наступает на
5 или 6 день после заражения. Однако
неинфицированные личинки прекращают питаться, готовясь к окукливанию, через 2-3 дня после вступления в пятую возрастную стадию (смотри фиг.8). Аналогичный эффект наблюдается при обследовании личинок более ранних возрастных стадий. Во время линьки неинфицированные личинки прекращают питаться
10
BY 2078 C1
на период около 24 часов, тогда как зараженные wt AcMNPV личинки не линяют и, соответственно, продолжают питаться (смотри фиг.6).
Рекомбинантные палочковидные вирусы с отсутствующим функциональным геном egt не увеличивают
продолжительность периода питания личинки. Таким образом, личинки, инфицированные vEGTZ в начальный период пятой возрастной стадии, прекращают питаться через два дня после заражения и готовятся к
окукливанию (смотри фиг.8). Однако они не окукливаются и вместо этого погибают от вирусной инфекции
даже быстрее, как показано на фиг.9, чем личинки, инфицированные вирусом дикого типа. Аналогичным
образом личинки, инфицированные вирусом в ранней четвертой возрастной стадии, прекращают питаться
спустя два дня после инфицирования и умирают затем быстрее, чем зараженные вирусом дикого типа (смотри фиг.6 и 7). То, что палочковидный вирус отсутствующим функциональным геном egt убивает насекомых
быстрее, наиболее ярко видно, когда, как показано на фиг.10 и 11, вирусом vEGTZ инфицируются только
что вышедшие из яиц личинки первой возрастной стадии. Зараженные vEGTZ личинки умирают от вирусной
инфекции на 3-4 дня раньше по сравнению с теми, которые были заражены wt АсМNРV. Следовательно, рекомибинантные палочковидные вирусы с отсутствующим функциональным геном egt значительно более эффективны как агенты контроля развития насекомых, чем палочковидные вирусы дикого типа. Для
специалистов в данной области должны быть очевидны преимущества данного открытия, заключающегося в
том, что ген egt может быть сделан нефункциональным в любом палочковидном вирусе или вирусе насекомых любым известным способом.
Эффект, описанный выше и в последующих примерах, на полях будет еще более сильным. Инфицированные vEGTZ личинки испытывают затруднения при линьке, которая все-таки происходит только в тщательно контролируемых лабораторных условиях. В условиях отсутствия жесткого контроля температуры и
освещенности многие личинки не могут завершить линьку. Такие насекомые не начинают снова питаться и
вскоре после этого погибают.
Несмотря на то, что несколько сокращается продолжительность времени, в течение которого потомство
вируса может накапливаться в личинке, зараженной палочковидовым вирусом, у которого отсутствует функциональный ген egt, и питание инфицированного насекомого снижается, наблюдается значительное продуцирование дочернего вируса. Количество вируса в расчете на одну личинку, полученное после заражения
vEGTZ личинок поздних возрастных стадий, составляет примерно половину от полученного при заражении
вирусом дикого типа. Этого достаточно для обеспечения переноса вируса в поле и эффективного в смысле
стоимости получения больших количеств вирусных частиц.
В другом варианте воплощения данного изобретения вирус насекомых с отсутствующим функциональным геном egt модифицируют с помощью генной инженерии таким образом, что его эффективность как
агента биологического контроля повышается за счет введения второго гена, продукт которого оказывает
влияние на развитие насекомого.
Ген, кодирующий РТТН (пептидный гормон) может быть введен в геном вируса с отсутствующим геном
egt и экспрессия РТТН при этом будет достаточно высока, чтобы оказывать влияние на процессы линьки. У
инфицированных таким вирусом личинок в высшей степени нарушен гормональный контроль развития. Такие насекомые быстро заболевают, что влечет за собой ущербное развитие и рост, снижение питания и ускорение смерти.
Гормон вылупления также представляет собой мелкий пептидный гормон, ген которого может быть введен с помощью известных методов в вирусный геном с нефункциональным геном egt. В связи с тем, что
гормоном вылупления определяются многие связанные с метаморфозом поведенческие изменения, насекомое, зараженное вирусом Egt-, продуцирующим этот гормон в достаточно больших количествах, будет демонстрировать аномальное поведение и/или развитие, например пониженное питание.
Первичным регулятором активности ювенильного гормона в насекомом является фермент эстераза,
инактивирующая ювенильный гормон. Рекомбинантный вирус, лишенный функционального гена egt и продуцирующий достаточно высокий уровень эстеразы ювенильного гормона, может оказывать неблагоприятное воздействие на поведение и/или развитие насекомого.
Важно отметить, что, хотя все вышеупомянутые гены могут быть введены в геном вирусов дикого типа,
нельзя ожидать, что в этом случае они в значительной степени будут влиять на поведение насекомого, поскольку экспрессия гена egt вирусами дикого типа инактивирует экдистероидные гормоны линьки и это
препятствует, несмотря на продуцирование других гормонов, нормальному протеканию метаморфоза. Таким
образом, успешная стратегия должна включать, как описано в данном изобретении, генерирование вирусов,
предназначенных для изменения протекания метаморфоза в зависимости от предшествующего инактивирования гена egt.
11
BY 2078 C1
В данном изобретении агент контроля над ростом и развитием насекомых представляет собой композицию или активный ингредиент композиции, которая оказывает неблагоприятное воздействие на насекомоевредитель. Реакцией на агент контроля насекомых является снижение питания, нарушается нормальный метаморфоз, в результате чего смерть насекомого становится неизбежной. Активным ингредиентом композиции по данному изобретению является вирус насекомых, в частности бакуловирус, генетически измененный
с целью инактивации гена, кодирующего синтез обусловливающего модифицирование экдистероида фермента или вирус насекомых, подвергнутый дальнейшим генетическим изменениям, результатом которых является экспрессия гетерологичного гена, оказывающего влияние на метаморфоз.
Инсектицидные композиции, годные для нанесения на растения с целью контроля насекомых-вредителей, содержат кроме активного ингредиента приемлемый в сельскохозяйственном отношении носитель. Нанесение инсектицидной композиции данного изобретения может предохранить растения от насекомых-вредителей за счет
снижения питания и гибели восприимчивых насекомых.
Специалисты знают, каким образом выбрать активное начало композиции, а именно вирус, подходящий
для определенного насекомого-вредителя.
Для специалистов ясно, что насекомые-вредители могут быть подвергнуты воздействию контролирующего агента данного изобретения любым традиционным способом, включая глотание, вдыхание или прямой
контакт.
Описанные в данном изобретении подвергнутые генетическим изменениям палочковидные вирусы найдут основное применение именно как компоненты сельскохозяйственных композиций, предназначенных для
нанесения на растения с целью биологического контроля насекомых, являющихся вредителями растений.
Известны разнообразные способы приготовления таких приемлемых для сельского хозяйства композиций.
Концентрация основного ингредиента, которая требуется для получения эффективных инсектицидных композиций, применяемых в сельском хозяйстве для защиты растений, зависит от типа организма, используемой
мутации и от формулы композиции. Как понятно специалисту, эффективные значения концентраций контролирующего агента в инсектицидной композиции можно легко определить экспериментально. Например, концентрацию вируса, дающую инсектицидный эффект, можно легко определить описанными в любом из примеров 611 способами.
Сельскохозяйственные композиции должны подходить для применения в сельском хозяйстве и хорошо диспергироваться в поле. В общем случае компоненты композиции не должны быть фитотоксичными и наносить вред
всему сообществу окклюдирующих вирусов . Нанесение на листья не должно приносить вреда листьям или повреждать их. Кроме соответствующих твердых или, что является более предпочтительным, жидких носителей,
сельскохозяйственные композиции могут включать компоненты, повышающие липучесть или адгезию, эмульгаторы или увлажнители, но не компоненты, снижающие питание насекомых или функционирование вируса. Может
оказаться также желательным введение компонентов, предохраняющих контролирующий агент от инактивации
под действием ультрафиолетового излучения. Сельскохозяйственные композиции для контроля насекомыхвредителей могут также включать агенты, стимулирующие питание насекомых.
Имеются обзоры, описывающие способы нанесения агентов биологического контроля насекомых и применение их в сельском хозяйстве. Смотри, например, Cоuch and Jgnoffo (1981) в Microbial Control of Pests
and Plant Disease 1970-1980, Burges (ed) chapter 34, pp. 621-634; Corke and Rishbeth, ibid, chapter 39, pp. 717732; Brockwell (1980) в Methods for Evaluating Nitrogen Fixation; Bergersen (ed) pp. 417-488; Burton (1982) в
Biological Nitrogen Fixation Technology for Tropical Agriculture, Graham and Harris (eds) pp. 105-114; и
Roughley (1982) ibid, pp. 115-127; The Biology of Baculoviruses, vol. II Supra.
Данное изобретение иллюстрируется приводимыми ниже примерами, которые ни в коей мере нельзя рассматривать как ограничения области данного изобретения. Ясно, что специалистам могут представиться различные варианты конкретного воплощения, модификации и эквиваленты изобретения, не выходящие за
пределы идеи данного изобретения и/или прилагаемой формулы изобретения.
Пример 1.
Положение гена egt в геноме AcMNPV показано на фиг.1, над картой генома AcMNPV показан масштаб
в единицах карты.
Для определения нуклеотидной последовательности этого типа и соседних с ним областей, что позволило
бы осуществить последующие генетические манипуляции, необходимо вначале клонировать некоторые
фрагменты ДНК, фланкирующие данную область, в плазмидных векторах (стандартные методики клонирования смотри: T. Maniatis et al. (1982) в Molecular Cloning: А Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor. N.Y.).
12
BY 2078 C1
На панели А фиг.1 показана линейная карта генома АсМNPV после расщепления его рестриктазами Eco
RI и Hind III. На панели В представлена в увеличенном масштабе область генома от 7,6 до 11,1 единиц карты, показывающая положение гена egt. В качестве исходного АсМNPV использовался штамм L1 (Lee and
Miller (1978) J.Virol. 27:754).
Подвергаемые клонированию фрагменты ДНК и названия полученных плазмид показаны на фиг.1. Панель С. Фрагмент 1, который занимает область от сайта PstI, расположенного в точке 7,6 у.е., до сайта
DamHI (11,1 у.е.), клонируется в плазмидный вектор pUC19; оба фрагмента 2 и 3 [от PstI (7,6 у.е.) до EcoRI
(8,65 у.е.) и от EcoRI (8,65 у.е.) до Sal I (10,5 y.е.), соответственно] клонируются в векторы Bluescript М13+ и
Bluescript М13 - (Stratagene, San Diego, California). Фрагмент 5 [расположен от Bst EII - сайта (8,35 у.е.) до
Bst EI - cайта (8,7 у.е.)] клонируется в Bluescript М13+ .
Затем генерируется большое количество субклонов плазмид ВСРSЕ и ВСЕS (Henikoff (1984) Jene 28:351).
Эти подклоны отличаются последовательно увеличивающимися делециями вирусных вставок, так что
они содержат различные количества вирусной ДНК, от менее чем 50 пар оснований для полного вирусного
фрагмента. Многие такие субклоны и плазмиды ВСB затем наращиваются (Sanger et al. (1977) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 74:5463), так что в обоих направлениях восстанавливается последовательность целого гена
egt. Затем полученная нуклеотидная последовательность анализируется на предмет наличия открытых рамок
считывания, которые могут кодировать протеин, с помощью компьютерных программ Pustell and Kefatas
(1984), Nucl. Acids Res. 12:643-655 и Devereaux et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12:387-396.
Такой анализ показывает, что ген egt кодирует протеин, состоящий из 506 аминокислот. Последовательность нуклеотидов гена egt и предсказанная аминокислотная последовательность продукта этого гена приведена в таблице 1.
Пример 2.
Для того чтобы сконструировать рекомбинантные вирусы, неспособные к экспрессии функционального
гена egt, необходимо произвести дальнейшие манипуляции с описанными в примере 1 клонами плазмид.
Плазмиду pUсBсPsB расщепляют с помощью эндонуклеаз рестрикции EcoRI и XbaI (сайты рестрикции
внутри гена egt, смотри фиг.3) и отбрасывают маленький фрагмент. Ген lac Z Escherichia coli, отщепленный
от pSKS 104 (Casadaban et al. (1983) Methods Enzymol. 100:293-303) с помощью рестриктаз Eco RI и Аha III,
внедряется между сайтами Eco RI и XbaI после того, как свободные концы XbaI заполняются с помощью
ДНК-полимеразы фага Т4. Полученную плазмиду обозначают pEGTZ. В этой плазмиде внедренный ген lac Z
находится в пределах рамки вместе с предшествующей кодирующей последовательностью egt. Плазмиду
pEGTDEL, напротив, конструируют простым связыванием сайтов EcoRI и XbaI (после того, как концы обоих
сайтов заполняются), не вставляя между ними какой-либо нуклеотидной последовательности. Все вирусы
являются производными от исходного штамма L-I AcMNPV (Lee and Miller (1978) Supra), очищаются через
бляшки и размножаются на культуре линии клеток Spodoptera frugiperda IPLBST 21 (SF-клетки) Vaughn et al.
(1977) In vitro 13:213-217) с использованием описанных ранее методов (Lee and Muller (1978); Miller et al.,
(1986) Genetic Engineering, Principles and Methods, vol. 8 (eds. J. Sitlow and A. Hollaender). Plenum Press, N.Y.,
277-298, 1986).
Затем плазмиду pEGTZ переносят вместе с ДНК АсМNРV дикого типа в SF-клетки, как описано в Miller
et al. (1986) supra. Эта процедура обеспечивает гомологичную рекомбинацию между последовательностями
вирусной и плазмидной ДНК, что приводит к замещению гена вируса egt на связку генов плазмиды egt - lacZ.
Поскольку остающаяся кодирующая последовательность egt находится в рамке считывания вместе с последовательностью lacZ, такой рекомбинантный вирус будет продуцировать слитый белок, представляющий собой первые 84 аминокислоты egt, соединенные с β-галактозидазой. Рекомбинантный вирус, обозначенный
VEGTZ., поддается идентификации, так как экспрессия β-галактозидазы приводит к образованию голубых
вирусных бляшек в присутствии хромогенного индикатора, такого, как 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-Dгалактопиранозида (Х-gal). Диаграмма гена egt вируса VEGTZ приведена на панели В фиг.2.
Рекомбинантный вирус VEGTDEL получают перенесением плазмиды рEGTDEL и ДНК из вируса
VEGTZ в SF клетки. Гомологичная рекомбинация приводит к замещению в VEGTZ генной связки egt - lacZ
на ген egt с делецией. Рекомбинантный вирус VEGTDEL идентифицируют по его неспособности образовывать голубые бляшки в присутствии Х-gal. Структура гена egt вируса vEGTDEL показана на фиг.3, С.
Пример 3.
Продукт гена egt-идентифицируют путем сравнения белков, синтезируемых вирусом AcMNPV дикого
типа (который продуцирует EGT), и синтезируемых вирусами VEGTZ или VEGTDEL (не способны продуцировать ЕGТ). SF-клетки инфицируют либо АсМNPV дикого типа, либо VEGTZ с множественностью заражений (МОI) 20, как описано O’Reilli and Miller (1990) J, Virol, 64:1321-1328. Инфицированные клетки
13
BY 2078 C1
также анализируют. Спустя 6 часов после заражения клетки инкубируют в течение 1 часа в присутствии
[35S]-метионина с целью внесения радиоактивных меток во все белки. Клетки затем подвергают лизису и
отделяют белки электрофорезом в геле SDS -полиакриламида (SDS-PAGE) (Laemmli et al. (1970) Nature
227:680-685). Все секретированные клетками белки также собираются и анализируются. После проведения
SDS-РАGЕ меченные радиоизотопами белки определяются с помощью авторадиографии. Инфицированные
wt AcМNPV клетки секретировали белок с молекулярной массой 60 КДа , чего не произошло в случае инфицированных VEGTZ или неинфицированных клеток. Этот белок однако не определяется в лизатах клеток,
инфицированных диким типом АсМNPV, что доказывает его секрецию клетками. Эти данные показывают,
что продуктом гена egt является синтезируемый 60 KДа-протеин, что хорошо согласуется с данными по последовательности нуклеотидов и аминокислот.
Пример 4.
Ферментивную активность белка ЕGТ определяли путем сравнения SF-клеток, инфицированных wt
АсМNPV или VEGTZ.
SF-клетки, инфицированные wt АсМNPV или VEGTZ описаны в примере 3. Через двенадцать часов "pi"
клетки и межклеточную среду собрали и обработали по отдельности. Параллельно обрабатывали неинфицированные клетки. Клеточный лизат или межклеточную среду инкубировали в присутствии 1 мМ UDPглюкозы и 0,25 µCi [3H] экдизона, как описано у О’Rеilly and Miller (1989) Science 245:1110-1112.
Активность экдистероид-UDP-глюкозилтрансферазы в клеточных лизатах или межклеточной жидкости
будет катализировать перенос глюкозы от UDP-глюкозы к экдизону с образованием соединения (конъюгата)
экдизон-глюкоза. Экдизон и экдизон-глюкоза разделяются тонкослойной хроматографией на силикагеле
(Bansal and Gessner (1988) Anal. Biochem. 109-321) и визуализируются с помощью авторадиографии. Комплекс
экдизон-глюкоза (G) образуется только при тестировании инфицированных АсМNPV клеточных лизатов или межклеточной жидкости. Его не наблюдается при использовании неинфицированных или инфицированных VEGTZ
клеток или межклеточной жидкости, что доказывает, что активность обусловлена экспрессией egt. Большая часть
активности сосредоточена в межклеточной среде, что находится в соответствии с обсуждаемыми в примере 3 данными. Доказательство присоединения глюкозы к экдизону получают при тестировании wt-инфицированных лизатов описанным выше способом, за исключением того, что UDР-глюкозу заменяют на меченную радиоактивными
изотопами UDР [U-14С]-глюкозу. Реакции, протекающие с участием немеченной UDP-глюкозы или меченной UDР
[U-14С]-глюкозы, с присутствующим в обеих реакциях [3H]-экдизоном, и подсчет импульсов образующихся соединений показывает, что может быть определен и 3Н из экдинона, и 14С из глюкозы. Эти данные доказывают, что
продуктом гена egt является UDP-глюкозилтрансфераза, которая является катализатором переноса глюкозы от
UDР-глюкозы к экдизону.
Далее проводили эксперименты с целью более тщательного определения субстратной специфичности EGT.
В этих экспериментах инкубировали различные субстраты (1 мM) в присутствии межклеточной среды, извлеченной из инфицированных wt- АсМNPV клеток, в которых наблюдалась довольно высокая активность egt. Для
обеспечения уверенности в том, что все наблюдаемые случаи образования соединения обусловлены EGT, каждый субстрат инкубировали также со средой, извлеченной из неинфицированных и инфицированных VEGTZ
клеток, которые не способны продуцировать ЕGT. В каждом случае в реакцию вводили 0,05 µCi UDP-[U-14С]глюкозы. Все соединения, выступающие по отношению к ЕGТ как субстраты, должны присоединять глюкозу,
они поддаются определению, поскольку глюкоза помечена радиоизотопами.
Таблица 3.
Субстратная специфичность EGT
Субстрат
р-аминобензойная кислота
билирубин
хлорамфеникоп
диэтилстилбестрол
экдизон
β-эстрадиол
20-гидроксиэкдизон
гидроксихинолин
макистерон А
(-) ментол
метилумбеллиферол
α-нафтол
Контроль (пикомоли перенесенной
глюкозы)
14
Дикий тип (пикомоли перенесенной глюкозы)
155,7
87
89,6
-
BY 2078 C1
Субстрат
Контроль (пикомоли перенесенной Дикий тип (пикомоли перенесенглюкозы)
ной глюкозы)
р-нитрофенол
фенолфталеин
тестостерон
α-тетралол
Субстраты инкубируют в присутствии среды, полученной из соответствующим образом инфицированных
клеток и 0,05 µCi UDP-[U-14С]-глюкозы. Количество перенесенной глюкозы вычисляется исходя из числа импульсов от соответствующих областей хроматографических пластинок.
Для дальнейшего контроля вводили UDP-[U-14С]-глюкуроновую кислоту в отдельные системы реакций
со средами, полученными из инфицированных вирусом дикого типа клеток, в целях демонстрации того, что
глюкуроновая кислота в этих реакциях не переносится. Полученные данные представлены в табл. 3. В качестве субстратов идентифицированы только экдизон, 20-гидроксиэкдизон и макистерон А (все - экдистероиды). В средах, извлеченных из ложно инфицированных или инфицированных VEGTZ клеток, конъюгаты не
обнаружены, что подтверждает обусловленность наблюдаемой активности экспрессией egt. При использовании UDP-[U-14С] - глюкуроновой кислоты конъюгаты не наблюдаются, что является демонстрацией того, что
глюкуроновая кислота не переносится с помощью EGT.
Пример 5.
Для того чтобы получить доказательства наличия также и у других бакуловирусов генов, гомологичных в
значительной степени гену egt АсМNPV, отделили ДНК вируса OpMNPV и подвергли ее по отдельности
воздействию эндонуклеаз рестрикции EcoRI, BamHI и Hind III. Эти ферменты расщепляют вирусную ДНК
на несколько сегментов различного размера, положение которых в геноме ОрМNPV уже известно (Leisy et
al. (1984) J. Virol, 52:699). Затем провели гибридизацию по Саузерну описанным I.Maniatis et al. (1982) supra
способом. Вырезали внутренний сегмент гена egt АсМNPV из плазмиды ВСЕS с помощью ферментов EcoRI
и XbaI (см. фиг.1). Этот фрагмент пометили радиоактивным изотопом 32p и использовали как средство идентификации любых родственных последовательностей в геноме ОрМNPV. Ясно, что в соответствующих условиях фрагмент ДНК присоединит другой фрагмент, в составе которого имеется аналогичная или
идентичная последовательность. Таким образом, на нейлоновой мембране происходит присоединение метки-гена egt АсМNPV к любому фрагменту ДНК OpMNPV, в котором содержатся родственные последовательности ДНК. Место присоединения метки можно визуализировать с помощью экспозиции мембраны
рентгеновским лучам. Вначале происходит гибридизация метки - egt с нейлоновой мембраной в нежестких
условиях (1 М хлорида натрия, 0,3 М цитрата натрия, 5% сульфата декстрана, 5 х раствор Denhardt’a, 0,25%
SDS при 37°С). Это допускает гибридизацию метки с относительно удаленными родственными последовательностями. Далее постепенно увеличивают жесткость гибридизации, поднимая температуру гибридизации
или вводя в раствор гибридизации формамид, до тех пор, пока не возникнут специфические гибридизационные связи. Гибридизация, показанная на фиг.4, протекает в следующих условиях: 1 М хлорида натрия, 0,3 М
цитрата натрия, 5% сульфата декстрана, 5 х раствор Denhardt’a, 0,25% SDS; температура 68°С, продолжительность 15 ч. Затем мембрану дважды промывают, каждый раз в течение 15 минут, в растворе 0,3 М хлорида натрия, 0,1 М цитрата натрия и 0,1% SDS при 68°С. На фиг.4 показано, что метка egt AcMNPV
присоединяется к определенным фрагментам ДНК ОрМNPV, а именно к фрагменту В EcoRI, фрагменту А
ВаmHI и к фрагментам N и S Hind III. Отметим, что ген egt занимает в геноме ОрMNPV такое же относительное положение, что и ген AcMNPV (фиг.5). Аналогичная пропись используется для идентификации egtгомологичных генов у других энтомопатогенов. Понятно, что для подтверждения ЕGТ-активности в случае
сильно расходящихся последовательностей потребуется метод рестрикции, описанный в примере 4. Тогда для
выделения гена, кодирующего фермент EGT, потребуется молекулярно-генетический анализ, методология которого известна.
Для обнаружения гена, кодирующего ЕGТ в других организмах, используется, в отличие от вышеописанного,
специфический способ тестирования на активность UDР-глюкозилтрансферазы, описанной в примере 4. Этот тест
используется для определения энзима в процессе очистки стандартными биологическими методами. После очистки определяется частичная аминокислотная последовательность белка ЕGТ. Полученную информацию используют для создания олигонуклеотидной метки, с помощью которой затем определяют положение гена EGT в
геноме.
Пример 6.
Титр экдистероида в гемолимфе изменяется циклически, регулируя превращения и личинка-личинка, и
личинка-куколка, и поскольку предполагается, что присоединение глюкозы инактивирует экдистероиды
(Warren et al. (1986) J. Liq. Chromatogr. 9:1759; Thompson et al. (1987) Arch. Insect. Biochem. Physiol. 4:1;
Thompson et al. (1988) Arch. Insect. Biochem. Physiol. 7:157), тo представляется возможной взаимосвязь нарушения процесса нормального развития насекомого при инфицировании вирусом АсМNPV с экспрессией
egt. Нарушение развития демонстрируют следующим образом: только что перенесшие линьку личинки чет15
BY 2078 C1
вертого возраста S.frugiperda инфицировали вирусами wt AcMNPV или VEGTZ путем впрыскивания и ежедневно наблюдали за возможными изменениями их развития. Для отрицательного контроля одной группе личинок ввели жидкость культуры ткани. Результаты эксперимента приведены в табл. 4, смотри ниже. Все
личинки, которым ввели культуру ткани (ложное инфицирование), как и ожидалось, перелиняли, превратившись в личинки пятого возраста. Из шестнадцати личинок, инфицированных вирусом дикого типа подобная
трансформация наблюдалась только у одной. Напротив, все личинки, инфицированные мутантным вирусом
VEGTZ, перелиняли из четвертой в пятую возрастную стадию. Таким образом, экспрессия гена egt вируса wt
AcMNPV явно и специфично подавляет линьку насекомого-хозяина. Впоследствии обе инфицированные
группы личинок погибли от вирусной инфекции, что доказывает, что нарушение функции egt вируса VEGTZ
не препятствует ему убивать хозяина.
Таблица 4.
Подавление линьки при инфицировании вирусом wt AcMNPV
Вирус
Линька
Смертность
Ложное инфицирование
16
0
Дикий тип
1
16
vEGTZ
16
16
Личинкам S.frugiperda четвертого возраста ввели lxl05 pfu wt AcMNPV или VEGTZ в 5 µл. Ложноинфицированным личинкам ввели 5 µл жидкой культуры ткани. Каждая группа состояла из 16 личинок, которые
содержались в следующих условиях: искусственная диета (R.L.Burton (1969) ARS publication pp. 33-134), температура 28°С с циклом "свет:темнота" = 14:10 часов. Личинки каждый день осматривались на предмет линьки, и на 7й день регистрировалась смертность.
При инъекции вируса личинкам ранней пятой стадии получены аналогичные результаты. Ни одна из
только что перелинявших личинок пятого возраста, инфицированных вирусом дикого типа, не обнаружила
каких-либо признаков окукливания, тогда как большинство инфицированных VEGTZ личинок проявили некоторые поведенческие отклонения (прекращение питания, беспокойство и плетение кокона), что является
показателем приближения превращения из личинки в куколку. Однако все личинки, которым была введена
вирусная инфекция, погибли до окукливания. Эти данные показывают, что инфицирование АсМNРV препятствует линьке или окукливанию личинок. Они показывают также, что подобное нарушение развития насекомых обусловлено экспрессией гена egt.
Пример 7.
Биоанализ in vivo АсМNРV дикого типа ( wt) и VEGTZ выявил, что экспрессия гена egt увеличивает время, в течение которого личинка питается, и что нарушение функции egt улучшает характеристики вируса как
пестицида. При проведении данных исследований личинкам S.frugiperda делали инъекции либо wt АсМNРV,
либо VEGTZ на ранней 4-й стадии. Для сравнения контрольным личинкам вводили среду культуры ткани,
которая не содержала вируса. У личинок каждый день проверяли прибыль веса, признаки линьки или окукливания и смертность. На фиг.6 и 7, соответственно, приведен средний дневной привес личинок различных
групп, а также процент смертности. Контрольные личинки в течение первых двух дней показали умеренный
рост. В течение второго дня все они перелиняли в пятую стадию. Далее личинки резко выросли за два дня,
после чего прекратили питаться и приготовились к окукливанию. Только одна из 16 личинок, инфицированных wt АсМNРV, перелиняла, вместо чего остальные в течение трех дней после заражения личинки непрерывно росли. На этой стадии они заболевают, но вплоть до 5 дня ни одна личинка не погибла. К 6-му дню
погибли все инфицированные wt АсМNРV личинки. Напротив, все личинки, инфицированные VEGTZ, перенесли линьку из четвертой в пятую возрастную стадию и в течение этого периода времени они не питались. Этим объясняется отсутствие привеса с 1-го по 2-й день. После линьки они возобновляют питание, но к
3-му дню они начинают проявлять признаки болезни. Четыре дня спустя после заражения они начинают
умирать и к 5-му дню все погибают. Личинки, инфицированные производным от АсМNPV вирусом, у которого отсутствует функциональный ген egt, меньше питаются и погибают после заражения быстрее по сравнению с личинками, инфицированными диким типом АсМVPV.
При инфицировании личинок 5-й возрастной стадии эти явления наблюдаются еще более четко (фиг.8 и
9). Как и ожидалось, контрольные личинки за два дня значительно выросли, после чего прекратили питаться,
готовясь к окукливанию. Прекращение питания сопровождается резким падением веса. Личинки, инфицированные wt АсМNРV, не проявили признаков прекращения питания, они продолжали питаться и прибавлять в
весе в течение еще двух дней, а затем начали проявляться признаки заболевания. Смертность до седьмого
дня после заражения не была полной.
Можно сделать следующий вывод. Личинки, инфицированные vEGTZ, как и контрольные, питаются только в течение первых двух дней после заражения. Затем наблюдается, поскольку они готовятся к окукливанию, резкая потеря
веса. Однако, ни одна из этих личинок не окукливается; к третьему дню наблюдаются признаки болезни, а через шесть
дней после заражения все они погибают.
16
BY 2078 C1
Пример 8
Сравнивается воздействие заражения VEGTZ и wt АсМNРV на только что вылупившиеся личинки
S.frugiperda первого возраста. Новорожденным личинкам и, S.frugiperda дают корм, в котором содержатся в
различных количествах полиэдрические тела включения VEGTZ или wt АсМNРV, и ежедневно наблюдают
смертность. На фиг.10 и 11 приведены результаты, полученные для двух различных доз. Можно видеть, что
в обоих случаях у инфицированных VEGTZ личинок значительная степень смертности наступает намного
раньше по сравнению с личинками, инфицированными вирусом дикого типа. Вообще, личинки, зараженные
рекомбинантным вирусом, погибают на три-четыре дня раньше, чем зараженные wt-вирусом. Этот результат
является дополнительным доказательством того, что бакуловирусы, содержащие инактивированные гены
egt, лучше действуют в качестве биологических пестицидов, чем бакуловирусы дикого типа с интактными
генами egt.
Пример 9.
Для конструирования рекомбинантных вирусов, с экспрессией проторакотропного гормона (РТТН), ген
РТТН клонируют в плазмидный вектор переноса pEV mod ХIV, который описан в U.S. Patent Application Serial. № 07/353,847 от 17 мая 1989г., заявка включена здесь в качестве ссылки. Эта плазмида содержит восходящую и нисходящую последовательности гена полиэдрина АсМNРV, который является медиатором
гомологической рекомбинации экспрессируемого гена РТТН с геномом вируса EGT-. Сайт множественного
клонирования располагается у обычного сайта инициирования трансляции полиэдрина, вниз от LS ХIVмодифицированного промотора полиэдрина (Rankin et al., Gene 70:39 (1988). Ген РТТН Bombiх mori выделяется из плазмиды рВс22к-С19 (Kawakami еt al., Science 247:1333 (1990)) с помощью рестрикционного фермента Hind III. Связующие концы Hind III заполняются с помощью ДНК-полимеразы фага Т4, а затем
плазмиду расщепляют с помощью EcoRI. Плазмиду pEV mod ХIV расщепляют с помощью Kpn I. "Липкий" конец Kpn I удаляют ДНК-полимеразой фага Т4 и расщепляют плазмиду с помощью ЕсоRI. Фрагмент, в котором
содержится ген РТТН, клонируют через эти сайты в плазмиду переноса. В полученной рекомбинантной плазмиде, обозначаемой рЕVРТТН, ген РТТН расположен сразу после LS ХIV-модифицированного промотора полиэдрина.
Рекомбинантные вирусы с экспрессией РТТН получают путем контрасфекции рЕV РТТН в SF-клетки с
ДНК вирусов wt АсМNРV или VЕGТDЕL. Рекомбинация между последовательностями, фланкирующими
полиэдрин в вирусной ДНК, и последовательностями, фланкирующими ген РTТН в плазмиде рЕVРТТН,
приводит к замещению гена полиэдрина на ген РТТН. Вирусы, в геноме которых имела место такая рекомбинация, идентифицируют по отрицательному по окклюзии фенотипу (Miller et al., в Genetic Engineering,
Principles and Methods, Vol. 8, J. Setlow and A. Hollaender, eds., Plenum Press N.Y., 1986, p.p. 277-298). Соответствующие рекомбинантные вирусы обозначаются VEGTPTTH и VWTPTTH.
Аналогичным образом получают рекомбинантные вирусы с экспрессией эстеразы ювенильного гормона.
Сначала вырезают ген эстеразы ювенильного гормона Heliothis virescens Hanzlik et al., (1989) J. Biol. Chem.
264:12419) из плазмиды рСНЕ16В (Hammock et al. (1990) Nature 344:458) посредством расщепления EcoRI и
Kpn I. Плазмиду переноса pEV mod ХIV также отщепляют посредством EcoRI и Кpn I и фрагмент, включающий ген эстеразы ювенильного гормона внедряют между этими сайтами. Таким образом, pEVIHE включает последовательности гена полиэдрина, фланкирующие ген эстеразы ювенильного гормона. Рекомбинантные
вирусы EGT-IHE и VWTIHE получают котрансфекцией pЕVIHE с ДНК VEGTZ или wt AcMNPV, соответственно, и отбором бляшек без тел включения.
Для конструирования рекомбинантных вирусов с экспрессией гормона вылупления вырезают ген гормона вылупления Manduca sexta из плазмиды рF 5-3 (Horodyski et. al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8123)
путем расщепления EcoRI и Hpal. pEv mod. XIV расщепляют с помощью Kpn I, свободный конец Kpn I удаляют посредством ДНК полимеразы фага Т4, а затем расщепляют с помощью EcoRI. Внедрение фрагмента,
содержащего ген гормона вылупления, в плазмиду перемещения дает рекомбинант рЕVЕН, в котором ген
гормона вылупления располагается вниз от промотора LS XIV-модифицирования полиэдрина. Контрансфекция
этой плазмиды с ДНК vEGTZ или VDA26Z позволяет выделить, соответственно, рекомбинантные вирусы
VEGT- ЕH и VDА26Z EH. VDА26Z представляет собой рекомбинантный вирус со вставкой гена lac Z E. coli
внутри гена DА26 (O’Reilly et al., J.Gene Virol. in Press). Функция гена DА26 неизвестна, а по фенотипу, что касается метаморфоза, VDА26Z представляет собой дикий тип. Из-за присутствия гена laс Z производные
VDА26Z дают голубые бляшки в присутствии X-gal.
Пример 10.
Чтобы оценить in vivo эффект таких рекомбинантных вирусов, личинкам S. frugiperda ввели 2xl05 pfu вирусов VEGTDEL, VEGT- РТТН, VWTPTTH или одновременно VEGT- РТТН и VEGT- IHE (по 1xl05 pfu каждого); личинки находились в поздней 3-й возрастной стадии или в ранней 4-й. При введении всех EGT-вирусов инфицированные насекомые перенесли линьку и пережили 4-ю стадию, а к 3-му дню обнаружили
соскальзывание головной капсулы, что указывает на приближающуюся линьку. После инфицирования одним
VEGT- РТТН или совместно VEGT- PTTH и VЕGT- IНЕ экспрессия РТТН приводит к быстрому заболеванию
17
BY 2078 C1
насекомых, а к 4-му дню наблюдается значительная смертность. Напротив, насекомые, инфицированные
VЕGTDEL, вплоть до 5-го дня не обнаруживают значительной смертности. Как и ожидалось, насекомые,
инфицированные вирусом VWРТTН, никогда не проявляют признаков перехода на 5-ю стадию. Соскальзывания головной капсулы не наблюдается и до 6-го дня не замечено значительной смертности. Таким образом, экспрессия РТТН в отсутствие EGT приближает на 1 день по сравнению с инфекцией VEGTDEL срок
гибели насекомых в результате заражения. Эти данные демонстрируют улучшение пестицидных свойств бакуловирусов за счет экспрессии генов, влияющих на метаморфоз насекомых, и показывают, что эффективность такой стратегии возможна только при инактивировании гена egt.
Таблица 5
Процент смертности
Вирус
VEGTDEL
VWTPTTH
VЕGT-РТТН
VEGT-PTTH и vEGT-IHE
3
4,5
0
4,2
8,7
4
4,5
0
62,5
60,9
5
68,2
13,0
87,5
91,3
6
90,9
39,1
100,0
95,7
7
90,9
78,3
8
95,5
95,7
100,0
Пример 11.
Генерирование положительных по признаку образования тел включения вирусов с экспрессией гетерологичных белков, влияющих на развитие насекомых, может осуществляться по следующей схеме. Во-первых,
конструируется отрицательный по признаку окклюзии вирус с экспрессией β-галактозидазы. Ген lac Z E.coli,
кодирующий фермент β-галактозидазу, клонируют в вектор переноса рSynVI-, описанный в U.S. Patent Application Serial № 07/353,847 от 17 мая 1989г. Вектор рSynVI- включает последовательности, расположенные
в геноме АсМNPV по восходящей и по нисходящей от гена полиэдрина, причем сайт множественного клонирования расположен непосредственно по нисходящей от синтетического модифицированного промотора
полиэдрина. Ген lac Z вырезают из плазмиды PSKS 105 (Casadabani et al. 1983) supra посредством расщепления Pst I. Выступающий конец удаляется с помощью нуклеазы mung bean, и плазмиду расщепляют посредством Sst II. рSynVI- расщепляют по сайтам ЕсоRV и Sst II и клонируют ген lac Z в эти сайты. Полученная
плазмида обозначается рSynVI- gal, в ней ген lac Z располагается непосредственно по нисходящей от синтетического модифицированного промотора полиэдрина. рSynVI- gal переносится в SF- клетки с ДНК вируса
vEGTDEL, после чего отделяются отрицательные по признаку окклюзии бляшки с экспрессией βгалактозидазы, которые представляют собой вирус VEGT- SynVI- gal.
Для построения положительного по признаку образования тел включения рекомбинантного вируса, у которого
имеет место экспрессия РТТН, ген РТТН клонируют в вектор переноса pSp ХIVVI+Х3.
При конструировании рSр ХIVVI+Х3 сначала строится промежуточная плазмида рSр ХIVVI+. Плазмида
pSpLSХIVVI+CAT, (описанная в заявке на патент США серийный номер 07/353,847 от 17 мая 1989г.) разрезается по Bgl II и концы заполняются ДНК-полимеразой. Плазмиду pSynVI+wtp (описана в заявке на патент
США серийный номер 07/353,847 от 17 мая 1989г.) разрезают по ЕсоRV и SacI и маленький фрагмент
ЕсоRV-SасI очищают. Фрагменты двух плазмид связывают и отбирают pSр ХIVVI+САТ. Плазмида pSp
ХIVVI+ идентична плазмиде pSp LSVIVVI+CAT за исключением того, что сайт множественного клонирования в промежутке от сайта Bgl II до сайта SасI совпадает с pSynVI+wtp. Для конструирования сайта множественного клонирования V3 (описано в заявке на патент США сер. номер 07/353,847 от 17 мая 1989г) между
сайтами EcoRI-SacI плазмиды рSр ХIVVI+ вводится полилинкер. Последовательность сайта множественного
клонирования в рSр ХIVVI+Х3 от сайта Bgl II до сайта SacI такова AGATCATC GAATTCTCGAG
CTGCAGATCT GTCGACCCGGG ААТААА GAGCTC.
EcoRV/Bgl EcoRI-XhoI PstI-BglI SalI-SmaI poly A SacI. Эта плазмида содержит интактный ген полиэдрина
под контролем промотора полиэдрина дикого типа. Синтетический модифицированный промотор полиэдрина
расположен по восходящей от гена полиэдрина и с противоположной ориентацией. Положение сайта множественного клонирования обеспечивает возможность внедрения генов, экспрессия которых должна осуществляться под
контролем синтетического модифицированного промотора полиэдрина. Ген РТТН вырезают из плазмиды рВс22к.
(Kawasaki et al. (1990) supra) путем расщепления по Hind III. Свободный конец Hind III заполняют ДНКполимеразой фага Т4, и расщепляют плазмиду по ЕсоRI. рSp ХIVVI+Х3 расщепляют по EcoRI и SmaI и клонируют
ген РТТН в эти сайты, что дает плазмиду pSp PTTH. Ген РТТН в этой плазмиде расположен по нисходящей ветви
от синтетического промотора модифицированного полиэдрина, но по соседству и с противоположной ориентацией
относительно промотора полиэдрина дикого типа и кодирующих последовательностей. Оба гена, ген РТТН и полиэдрина, фланкируются и по восходящей, и по нисходящей последовательностями гена полиэдрина генома
АсМNPV.
pSp РТТН переносится в SF-клетки совместно с ДНК vEGT- SynVI- gal. Рекомбинация между восходящими и нисходящими последовательностями полиэдрина в вирусной ДНК и последовательностями, фланкирующими гены РТТН и полиэдрина в рSр РТТН, приводит к замещению гена lac Z EGT- SynVI- gal на гены
18
BY 2078 C1
РТТН и полиэдрина из pSp РТТН. Рекомбинантный вирус ЕGT- SpPTTH идентифицируют по фенотипу, отрицательному по признаку β -галактозидазы и положительному по признаку окклюзии.
Для конструирования положительного по признаку окклюзии вируса с экспрессией экстеразы ювенильного
гормона вырезали ген эстеразы ювенильного гормона из плазмиды pJHE16B (Hammock et al. (1990) supra) посредством расщепления по Kpn I, удаления свободного конца посредством ДНК-полимеразы фага Т4 и рассекания по EcoRI. Затем клонировали ген экстеразы ювенильного гормона в плазмиду рSр ХIVVI+Х3, которую
расщепили по ЕсоRI и SmaI. Полученную плазмиду, pSp JHE, подвергают контрансфекции с ДНК VEGTSynVI- gal, получая рекомбинантный вирус VEGT- Sp JHE. У такого положительного по окклюзии вируса экспрессия эстеразы ювенильного гормона происходит под контролем синтетического промотора модифицированного полиэдрина.
Аналогичным образом вырезают ген гормона вылупления из плазмилы pF 5-3 (Horodyski et al. (1990) supra) посредством рассекания по EcoRI и HpaI и клонирования в рSр ХIVVI+Х3, которая затем расщепляется
по EcoRI и SmaI. В результате контрансфекции полученной плазмиды, pSpEH, с ДНК vEGT- SynVI- gal получают рекомбинантный вирус vEGT- pЕH.
Положительные по признаку образования тел включения ЕGT- вирусы подвергают далее генетическим
изменениям, вызывающим экспрессию белка, который влияет на метамофроз насекомых (пептидный гормон
насекомых или фермент, инактивирующий гормоны насекомых), в результате чего они снижают питание и
ускоряют гибель инфицированных личинок насекомых эффективнее по сравнению с бакуловирусами дикого
типа или с бакуловирусами, генетические изменения в которых вызвали только инактивирование гена еgt.
Поскольку регуляторы роста и развития насекомых примера 11 образуют тела включения, эти вирусы могут вводиться в эффективные инсектицидные, приемлемые для сельского хозяйства композиции, которые
можно наносить на инфицированные посевы. Глотание таких окклюдированных вирусных частиц насекомыми приведет к распространению вирусов по полям и, тем самым, к распространению контролирующего
агента. Инфекция вызовет гибель насекомых и, следовательно, защитит посевы от насекомых-вредителей.
Фиг. 2 А
Фиг. 2 В
Фиг. 3
Фиг. 4
19
BY 2078 C1
Фиг. 5
Cоставитель А.И. Сорокин
Редактор В.Н. Позняк
Корректор Т.В. Бабанина
Государственный патентный комитет Республики Беларусь.
220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66.
20
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
452 Кб
Теги
by2078, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа