close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY2120

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(19)
BY (11) 2120
(13)
C1
(51)
(12)
6
C 12N 15/58,
C 07K 14/745,
C 12N 9/88,
A 61K 37/47
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ
КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ
(54)
ФРАГМЕНТ ДНК, КОДИРУЮЩИЙ ПОЛИПЕПТИД К2Р СО
СВОЙСТВАМИ АКТИВАТОРА ПЛАЗМИНОГЕНА, ПОЛИПЕПТИД К2Р
СО СВОЙСТВАМИ АКТИВАТОРА ПЛАЗМИНОГЕНА,
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК рА27.3, КОДИРУЮЩАЯ
ПОЛИПЕПТИД К2Р СО СВОЙСТВАМИ АКТИВАТОРА ПЛАЗМИНОГЕНА
И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, ОБЛАДАЮЩАЯ
ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ
(21) Номер заявки: 1345
(22) 22.11.1993
(86) РСТ/ЕР90/00194, 06.02.1990
(31) P3903581.6
(32) 07.02.1989
(33) DE
(46) 30.06.1998
(71) Заявитель: БЕРИНГЕР МАННХАЙМ ГМБХ
(DE)
(72) Авторы: Анне Штерн, Ульрих Конерт, Райнер
Рудольф, Штефен Фишер, Ульрих Мартин (DE)
(73) Патентообладатель: БЕРИНГЕР
МАННХАЙМ
ГМБХ (DE)
(57)
Фиг. 1
BY 2120 C1
1. Фрагмент ДНК, кодирующий полипептид К2Р со свойствами активатора плазминогена, имеющии нуклеотидную последовательность:
1
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
901
961
1021
АТGТСТТАССААGGАААСАGТGАСТGСТАСТТТGGGААТGGGТСАGССTACCGTGGCACG 60
CACAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATСATCCTGATAGGC 120
AAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGСАААСАТААТТАС 180
TGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTG 240
ACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGАCAGTACAGCCAG 300
ССТСАGТТТСGСАТСAAAGGAGGGCТСТТСGССGАСАТСGССТСССАССCCTGGCAGGCT 360
GCCATCTTTGCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGСGGGGGCATACTC 420
ATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCAC 480
CACCTGACGGTGATCTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGАGGАGСАGАAА 540
ТТТGААGТСGААAAAТАСАТТGТССАТААGGААТТСGАТGАТGАСАСТТACGACAATGAC 600
АТТGССGТGСТGСАGСТGAAТСGGАТТСGТСССGСТGТGСССАGGАGАGCAGCGTGGTC 660
CGCACTGTGTGCCTTCCCCCGGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTC 720
TCCGGCTACGGCAAGCATGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCT 780
CATGTCAGACTGTACCCATCCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTТAACAGAACAGTC 840
ACCGACAACATGCTGTGTGCTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGСАААСТТGСАС 900
GACGCCTGCCAGGGCGATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGAТGGCCGCATGACT 960
TTGGTGGGCATCATCAGCTGGGGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTСCCGGGTGTGTAC 1020
АСАААGGТТАССААСТАССТАGАСТGGАТТСGТGАСААСАТGСGАССG 1068
содержащий АТС стартовый кодон.
2. Полипептид К2Р со свойствами активатора плазминогена, полученный путем трансформации бактериального штамма рекомбинантным вектором, включающим фрагмент ДНК с последовательностью, приведенной в п. 1 или аналогичной последовательностью, определяемой вырожденностью кода со следующими
свойствами:
- фибринолитическая активность 550000-200000 Ед/мг;
- молекулярный вес 38500+2000 Да;
- увеличенный период полураспада по сравнению с природным аналогом;
- фибринзависимая стимуляция;
- тромболитическая активность;
- растворимость в растворе аргинина в концентрации 10-1000 ммоль/л при чистоте продукта 95%.
3. Рекомбинантная плазмидная ДНК рА27.3, кодирующая полипептид К2Р со свойствами активатора
плазминогена, содержащая EcoRI-EcoRI фрагмент ДНК плазмиды pREM 7685;
- 5 ТG ТСТТАС САА GGA ААС AGT GA 3' - синтетический фрагмент ДНК,
xhoI – xhoI - фрагмент ДНК плазмиды pREM 7685, три участка расщепления рестриктазы EcoRI, один
участок расщепления рестриктазы xhoI,
Ptac - промотор, генетические маркеры;
ApR - ген устойчивости к ампицилину,
KmR - ген устойчивости к канамицину.
4. Фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, содержащая активатор
плазминогена и фармакологически приемлемый носитель, отличающаяся тем, что в качестве активатора
плазминогена она содержит полипептид К2Р по п. 2 в эффективном количестве.
(56)
1. ЕР, А, № 0302456, МКИ C12N, 1989.
Изобретение относится к новому t-PA-производному, ДНК-последовательности, которая кодирует новое t-РА-производное, плазмидам экспрессии, которые обладают кодирующей t-РА-производное ДНКпоследовательностью, а также к средству растворения сгустков, содержащему t-РА-производное.
Свернувшаяся кровь содержит в качестве основной компоненты протеиновой матрицы полимерный фибрин. Фибрин растворяется благодаря фибринолитической системе при физиологических условиях в последовательности реакций, которая подобна последовательности свертывания крови. Центральной реакцией при
этом является активирование плазминогена в плазмин, которое вызывается, например, активатором плазминогена ткани t-PA (ткань типа активатора плазминогена). Плазмин снова растворяет фибрин, который представляет собой основную компоненту протеиновой матрицы свернутой крови. Ферментативная активность
природного или полученного гентехнологически из эукарионтов t-PA, а именно каталитическое активирование плазминогена в плазмин, в отсутствие фибрина или продуктов расщепления фибриногена очень незначи2
BY 2120 C1
тельна, однако, в присутствии этих протеинов может отчетливо повышаться, а именно более, чем на фактор
10 (патент ЕПВ № 0302456).
t-PA расщепляется в крови благодаря имеющимся протеазам на А- и В-цепь. Обе образовавшиеся цепи
остаются связанными через цистеиновый мостик. Стимулируемость активности t-PA представляет собой
решающее преимущество по сравнению с другими известными активаторами плазминогенов, как, например,
урокиназа или стрептокиназа (см., например, M. Hoylaerts и др., J. Biol. Chem., 257 (1982), 2912-2919; Nieuwenhuizen и др. Biochem. Biophys Acta 755, (1983/531-533).
Механизм действия t-PA ин виво описан, например, Korniger и Collen, Ehromb. Hamostasis, 46,
(1981), 561-565. Сфокусированная на поверхности фибрина активность фермента позволяет ему вести
себя как пригодное средство для борьбы с патологическими закупорками вен (например, при инфаркте
сердца), что большей частью может быть подтверждено клиническими испытаниями (Collen и др., Circulatioin, 70 (1984), 1012; Circulation, 73 (1986/511).
В качестве надостатка t-РА, однако, нужно рассматривать его быстрое уменьшение концентрации в плазме
(клиренс). Следствием этого является то, что необходимо относительно большое количество t-РА, чтобы достичь ин виво эффективного лизирования тромбов. Высокие лечебные дозы опять же имеют следствием побочные действия, как, например, кровотечения.
В европейском патенте 0196920 описан природный продукт разрушения t-РА, который содержит только еще
домены протеазы и крингель-П и N-конец которого начинается с аланина 160 (в расчете на указанную Pennica и др.
в Nature 301 (1983) 214-221 последовательность аминокислот).
Скорость клиренса этого продукта разрушения t-РА, однако, несущественно отличается от таковой
природного t-РА. Лишь благодаря химической модификации каталитической области за счет введения
блокирующей группы можно здесь достичь улучшения.
Поэтому задачей изобретения является изменение t-РА таким образом, чтобы образовавшееся производное обладало сильно сниженной скоростью клиренса и таким образом более длительным временем полураспада в плазме крови. При этом должны сохраняться лизирующее тромбы действие, а также стимулируемость
фибрином.
Активатор плазминогена ткани (t-РА-производное), который отличается тем, что он не гликозилирован,
состоит из следующей последовательности аминокислот:
1
SYQGNSDCYF GNGSAYRGTH SLTESGASCL PWNSMILIGK VYTAQNPSAQ
51
АLGLGКНNYС RNPDGDAKPW CHVLKNRRLT WEYCDVPSCS TCGLRQYSQP
101
QFRIKGGLFA DIASHPWQAA IFAKHRRSPG ERFLCGGILI SSCWILSAAH
151
CFQERFPPHH LTVILGRTYR VVPGEEEQKF EVEKYIVHKE FDDDTYDNDI
201
АLLQLKSDSS RCAQESSVVR TVCLPPADLQ LPDWTECELS GYGКНЕАLSP
251
FYSERLKEAH VRLYPSSRCT SQHLLNRTVT DNMLCAGDTR SGGPQANLHD
301
ACQGDSGGPL VCLNDGRMTL VGIISWGLGC GQKDVPGVYT KVTNYLDWIR
351
DNMRP
(A)
которая на амино-конце, т.е. на аминокислоте N I=S может быть еще продлена за счет М.
Неожиданно установлено, что делеция остальных, имеющихся в нативном t-РА областей не оказывает никакого влияния на тромболитическую эффективность протеина и зависящая от бирина стимулируемость мутеина
сравнима с таковой нативного t-РА. Правда, установлено, что в предлагаемом согласно изобретению t-РАпроизводном отсутствует свойство связывания фибрина, однако, несмотря на это, неожиданно обнаружена ин
виво эффективность тромболиза, которая даже существенно улучшена по сравнению с таковой нативного t-PA.
Также неожиданным является тот факт, что при введении тромболитически достаточной эффективной дозы
производного почти не оказывается влияния на системный фибринолиз. Следовательно, оказалось, что предлагаемое согласно изобретению t-РА-производное обладает типичным для нативного t-РА свойством специфичности к фибрину при физиологических условиях. Эти результаты получены из фармакологических исследований предлагаемого согласно изобретению t-PA-производного (см. примеры 6 и 7). Кроме того, предлагаемый в
изобретении протеин обладает очень высокой удельной (специфической) активностью. При применении описанного ренатурирования уже определены активности 500-800 IU/мг.
Предметом изобретения является ДНК-последовательность, которая кодирует полипептид К2Р со свойствами активатора плазминогена и содержит следующую нуклеотидную последовательность:
1
61
121
181
241
АТGТСТТАССААGGАААСАGТGАСТGСТАСТТТGGGААТGGGТСАGССTACCGTGGCACG
CACAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATСATCCTGATAGGC
AAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGСАААСАТААТТАС
TGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTG
ACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGАCAGTACAGCCAG
3
60
120
180
240
300
BY 2120 C1
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
901
961
1021
ССТСАGТТТСGСАТСAAAGGAGGGCТСТТСGССGАСАТСGССТСССАССCCTGGCAGGCT
GCCATCTTTGCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGСGGGGGCATACTC
ATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCAC
CACCTGACGGTGATCTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGАGGАGСАGАAА
ТТТGААGТСGААAAAТАСАТТGТССАТААGGААТТСGАТGАТGАСАСТТACGACAATGAC
АТТGССGТGСТGСАGСТGAAТСGGАТТСGТСССGСТGТGСССАGGАGАGCAGCGTGGTC
CGCACTGTGTGCCTTCCCCCGGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTC
TCCGGCTACGGCAAGCATGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCT
CATGTCAGACTGTACCCATCCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTТAACAGAACAGTC
ACCGACAACATGCTGTGTGCTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGСАААСТТGСАС
GACGCCTGCCAGGGCGATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGAТGGCCGCATGACT
TTGGTGGGCATCATCAGCTGGGGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTСCCGGGTGTGTAC
АСАААGGТТАССААСТАССТАGАСТGGАТТСGТGАСААСАТGСGАССG 1068
360
420
480
540(Б)
600
660
720
780
840
900
960
1020
Выбор плазмиды, в которую внедряется кодирующая предлагаемое в изобретении t-РА-производное ДНКпоследовательность, зависит от используемых позднее для экспрессии производного клеток-хозяев. Пригодные
плазмиды, а также минимальные требования, которые предъявляются к такого рода плазмиде (например, источник
репликации, место рестрикционного разреза) известны специалисту. В рамках изобретения, однако, вместо плазмиды также можно применять космиду, репликативные, двунитевой формы фаги (λ, M13) и другие, известные
специалисту векторы. Методы направленного мутагенеза (определяемый сайтом мутагенез) описаны Morinaga и
др., Biotechnology, 21 (1984), 634, и осуществляется по существу как там описано.
Далее, следующим предметом изобретения является способ получения предлагаемого в изобретении t-PAпроизводного, отличающийся тем, что одна из предлагаемых в изобретении плазмид экспримируется в пригодные клетки-хозяева и продукт получается из питательной среды, в случае необходимости после разрушения
клеток-хозяев. Предпочтительно для получения предлагаемого в изобретении t-РА-производного в качестве
клеток-хозяев применяют прокарионтные клетки. При этом опять же особенно предпочтительно, чтобы образующиеся при этом так называемые "внутриклеточные тельца" (нерастворимые протеиновые агрегаты) сначала
отделялись от растворимых частиц клеток, содержащие t-РА внутриклеточные тельца солюбилизировались
(растворялись) при восстанавливающих условиях путем обработки гуанидин-гидрохлоридом, затем их нужно
дериватизировать с помощью GSSG и, наконец, ренатурировать t-РА-производное путем добавки L-аргинина и
GSH. Точные методики активирования t-РА из "внутриклеточных телец" описаны, например, в европейских патентах А-0 219 874 и А-0 241 022. Однако согласно изобретению, также можно использовать любые другие
способы получения активного протеина из "внутриклеточных телец".
В случае предлагаемого в изобретении способа для очистки К2Р предпочтительно работают в присутствии L-аргинина, в особенности при концентрации 10-1000 ммоль/л.
Предлагаемое в изобретении отделение от чужеродного протеина путем аффинной хроматографии осуществляется в предпочтительном варианте осуществления изобретения через ETI-адсорбирующую колонну
(ЕТI = эритрина-трипсин-ингибитор). При этом ЕТI фиксируется на материале носителя (абсорбер), как, например, сефароза. Очистка через ЕТI-адсорбирующую колонну имеет то преимущество, что материал ЕТIадсорбирующей колонны может загружаться непосредственно из концентрированной смеси ренатурирования даже в присутствии таких высоких концентраций аргинина, как 0,8 моль/л аргинина. Агрегации К2Р, которая имеет место при низких концентрациях аргинина ниже 10 ммоль/л, благодаря этому избегают. Особенно предпочтительно поэтому осуществлять очистку К2Р через ЕТI адсорбирующую колонну в
присутствии 0,6-0,8 моль/л аргинина. Содержащий К2Р раствор при этом предпочтительно имеет рН выше 7,
особенно предпочтительно 7,5-8,6.
Элюирование из ЕТI-колонны осуществляется путем снижения рН как в присутствии, так и также в отсутствие
аргинина, при условиях, которые обеспечивают хорошую растворимость К2Р. Предпочтительно рН-значение при
элюировании лежит в кислой области, особенно предпочтительно в области 3-5,5.
Полученный согласно изобретению К2Р обладает удельной t-РА-активностью 550.000±200.000
IU/мг при чистоте свыше 95%, предпочтительно выше 99%.
Согласно изобретению, следовательно, получается t-РА-производное, которое обладает отчетливо более
продолжительным временем полураспада плазмы на основании пониженной скорости клиренса. Предлагаемое согласно изобретению производное, однако, благодаря этому не теряет никаких своих свойств, делающих его пригодным в качестве лекарственного средства для тромболиза артериальных и венозных сгустков.
Напротив, необходимые для тромболитической терапии с помощью К2Р дозы снижается по крайней мере на
четверть обычной в случае нативного t-РА дозы. В случае одинаковых доз К2Р и нативного t-РА система
свертывания за счет К2Р затрагивается менее, чем благодаря нативному t-РА, и время кровотечения удлиняется незначительно в отличие от нативного t-РА, так что осложнения за счет кровотечения при терапии с
помощью К2Р могут по возможности уменьшаться.
4
BY 2120 C1
Предлагаемое согласно изобретению t-РА-производное поэтому особенно пригодно для использования в
лекарственном средстве, что опять же составляет следующий предмет изобретения. При применении предлагаемого в изобретении t-РА-производного в лекарственных средствах для достижения одинаковой эффективности
требуется только еще отчетливо сниженная доза введения, чем это имеет место в случае применения нативного,
продуцированного в СНО t-РА.
Следующие примеры далее поясняют изобретение в сочетании с рисунками.
Фиг. 1 показывает схематически получение плазмиды рА27.3;
Фиг. 2 показывает сравнение связи фибрина предлагаемого в изобретении t-РА-производного (кривая I) с экспримированным в СНО-клетках нативным t-РА (двунитевой t-РА из СНО-клеток, расщепленных на физиологическом месте расщепления Arg275-Ile 276 (кривая 2) и однонитевой t-РА из СНО-клеток (кривая 3).
Фиг. 3 и фиг. 4 показывает диаграммы фармакокинетики t-РА-активности предлагаемого согласно изобретению t-РА-производного, по сравнению с выпускаемым в продажу t-РА-препаратом Аctilyse): (кривая
1:К2Р, доза 200 000 ед./кг = 0,25 мг/кг; внутривенное вливание через 30 минут; число исследованных животных (кролики):4. Кривая 2: Actilyse доза 200 000 ед/кг внутривенное вливание, через 30 минут, число исследованных животных (кролики):6).
Фиг. 5 показывает кривые действия доз (для кроликов) на тромболиз предлагаемого согласно изобретению tРА-производного, по сравнению с Actilyse. (показано среднее значение + SEM, IU=1000 IU; кривая 1:К2Р; кривая
2: Actilyse).
Фиг. 6: показывает ход во времени Simplats времени кровотечения (ВТ) до и после внутривенной инъекции пилюли (Bolus) (Actilyse) плацебо или повышающихся доз находящийся под наркозом собакам.
Фиг. 7 показывает ход во времени Simplats времени кровотечения (ВТ) до и после внутривенной инъекции пилюли плацебо или повышающихся доз К2Р находящимся под наркозом собакам.
Пример 1.
Конструкция плазмиды рА27.3.
Исходная плазмида рREM7685, описанная в европейском патенте А-0 242 836, содержит следующие
компоненты: tac-промотор, регион Iас-оператора с АТС-стартовым кодоном, кодирующий регион для t-РАпроизводного FК2Р, терминатор транскрипции из рКК223-3, ген β-лактамазы, ген резистентности к канамицину и область начала плазмиды рАСУС177, плазмиды, которая находится в клетке в низком числе копий.
Последовательность t-РА-производного FК2Р складывается вместе из нуклеотидов 180-336 (F-домены), 7151809 (К2-домены, протеазы, меньшая доля 3`-UТ) и АТG-стартового кодона. Положения нуклеотидов даны
согласно последовательности, описанной Nature и др., 301 (1983) 214-221.
Для делеции F-доменов из FК2Р-конструкции в плазмид рREM7685 по существу используют метод Morinaga и
сотр. Biotechnology 21(1984) 634. Для образования гетеро-дуплекса из рREM7685 изолируют два фрагмента.
Фрагмент А: рREM7685 расщепляют с помощью рестрикционного фермента ЕсоRI. Продукты расщепления разделяют с помощью гель-электрофореза и больший фрагмент ЕсоRI элюируют из геля. Фрагмент В: плазмиду
рREM7685 линеаризируют с помощью рестрикционного фермента ХhoI. Линеаризированную плазмиду также получают препаративно гель-электрофорезом. Для мутагенеза готовят синтетически следующий олигонуклеотид:
5 ТG ТСТ ТАС САА GGA ААС АGТ GA 3`
Для образования гетеродуплекса фрагмент А, фрагмент В (по 450 f моль) и олигонуклеотид (75моль) смешивают и в присутствии 50 ммоль/л NaCl, 10 ммоль/л Трис/HCl, рН = 7,5 и 10 ммоль/л MgSО4 инкубируют сначала
три минуты при 100°C и тотчас переносят на лед. Ренатурация ДНК происходит за 30 минут при 60°С. Для репаратурного синтеза к гетеродуплексу добавляют следующее: дезоксинуклеотидтрифосфаты (0,2 ммоль/л, АТР
(1 ммоль/л, NaCl (100 ммоль/л), Tрис-HCl, pH = 7,5 (6,5 ммоль/л), MgCl2 (8 ммоль/л), в-меркаптоэтанол (1
ммоль/л), фрагмент Кленова ДНК-полимеразы из E.coli (0,125 ед/мкл смеси) и Т4-лигазу (0,1 ед/мкл смеси). Репаратурный синтез осуществляют в течение 4-х часов при 16° С. Затем эту смесь трансформируют в клетки
Е.соli (RМ 82, DSМ 3689) с помощью Iас Ig-плазмиды и трансформанты селекционируют путем добавки 25
мкг/мл канамицина к питательной среде.
С помощью способа гибридизации колоний при применении вышеописанного олигонуклеотида мутагенеза в качестве зонда можно выбирать те клоны, которые несут плазмиду рА27.3, которая кодирует предлагаемое в изобретении t-РА-производное К2Р. Эта плазмида отличается от исходной плазмиды рREM7685,
между прочим, отсутствием мест разреза Рst I, соответственно Ssp I. Эти оба места разреза содержатся в любой области исходного плазмида, которая кодирует F-домены. Конструкция плазмиды рА27.3 схематически
представлена на рис.1.
Пример 2.
Получение активного t-РА-производного К2Р из Е.соIi Zellyse и получение внутриклеточных телец (IВ).
1,6 кг влажной клеточной массы Е.Соli DSМ3689, трансформирована с помощью плазмида рА27.3 (суспендируют
в 10 л 0,1 моль/л Трис-НС1, 20 ммоль/л ЭДТК, рН-6,5, при 4°С). К этой смеси добавляют 2,5 г лизоцима и инкубируют 30 минут при 4°С; затем полное переведение клеток в удобную для переработки форму осуществляют путем диспергирования при высоком давлении. К полученному раствору примешивают 5 л 0,1 ммоль/л Трис-НС1, 20 ммоль/л
5
BY 2120 C1
ЭДТК, 6% Тритона Х 100 и 1,5 ммоль/л NaС1, рН=6,5, и инкубируют следующие 30 минут при 4°С. Затем осуществляют отделение нерастворимых составных частей (IB) путем центрифугирования с помощью центрифуги Рadberg.
Осадок после центрифугирования суспендируют в 10 л 0,1 ммоль/л Трис-НС1, 20 ммоль/л ЭДТК, рН
=6,5, инкубируют 30 минут при 4°С и IВ -препарат выделяют путем последующего центрифугирования.
Солюбилизация IВ.
100 г IВ (мокрый вес) суспендируют в 450 мл 0,1 ммоль/л Трис-НС1, 6 ммоль/л гуанидин-гидрохлорида,
0,2 ммоль/л ДТЕ (1,4-дитиоэритрит 1 ммоль/л ЭДТК, рН=8,6, и перемешивают при 25°С 2,5 часа).
После установления рН-значения=3 с помощью НС1 (25%) осуществляют диализ против 10 ммоль/л
НС1 (Х х 50 л, 24 часа, 4°C).
Дериватизация.
Вводят гуанидин-гидрохлорид (твердый) так, чтобы после конечного разбавления вышеуказанного диализата с
помощью 10 ммоль/л HC1 концентрация гуанидин-гидрохлорида составляла 6 ммоль/л.
Реакционную смесь предварительно инкубируют при 25°С в течение 1,5 часов, затем вводят окисленный глютатион (GSSG) до 0,1 ммоль/л и Трис-HC1 до 0,05 ммоль/л и рН-значение доводят по титру до pH=9,3 с помощью 5
ммоль/л NaOH. Смесь перемешивают в течение 3,5 часов при 25°С.
После установления рН-значения=3 с помощью HC1 (25%) осуществляют диализ против 10 ммоль/л
HC1 (3 х 100 л 48 часов, 4°С). После диализа центрифугируют и прозрачную надосадочную жидкость
обрабатывают далее.
Натурирование.
Реакционный сосуд емкостью 10 л заполняют 0,1 ммоль/л Трис-HC1, 0,8 ммоль/л L-аргинина, 2 ммоль/л
GSH (гентатион, восстановленная форма), 1 ммоль/л ЭДТК, pH=8,5. Ренатурирование проводят при 20°С
путем трехкратной добавки, смотря по обстоятельствам, 100 мл производного (смешанный дисульфид, см.
выше) в отрезок времени 24 часа.
После ренатурирования получают материал с удельной активностью 1500-10.000 IU (мг) определение
см. пример 4б). Единица IU = единица активности по определению WHO, Национального Института по биологическим стандартам и контролю.
Концентрирование ренатурированной реакционной смеси.
Ренатурированную смесь при необходимости можно концентрировать через гемодиализатор.
Пример 3.
Очистка К2Р из Е.Соli.
1. Очистка К2Р из Е.Соli путем аффинной хроматографии на ЕТI-сефарозе после предварительного концентрирования.
а) Элюирование с помощью лимонной кислоты.
Смесь после ренатурирования концентрируют через Меmo-диализатор (Asahi АМ 300) 1:23 и дополняют
с помощью 0,5 ммоль/л NаС1. Уравновешенную с помощью 0,1 ммоль/л Трис-НС1, рН=7,5, 0,8 ммоль/л аргинина, 0,5 ммоль/л NаС1 колонну с ЕТI (эритрина-трипсин-ингибитор)-сефарозой (объем = 50 мл) нагружают 550 мл концентрата подвергнутой повторному окислению смеси (10 колоночных объемов /час. 10SV
(час) и промывают уравновешивающим буфером до тех пор, пока абсорбция элюата при 280 нм не достигнет
холостого значения буфера. Элюирование связанного материала осуществляют с помощью 20 ммоль/л лимонной кислоты, рН=3,2.
объем
активность
Спрот мг/мл
SA1/
мл
IU/мл
IU/мг
Концентрат
550
57.162
14
4,083
ЕТI-элюат
90
330. 000
0,71
465,000
1) Удельная активность, активность в хромогенном тесте (см. пример 4б) разделена по содержанию протеина в пробе.
б) Элюирование с помощью 0,3 ммоль/л аргинина рН=4,5.
Ренатурированную реакционную смесь концентрируют как описано в примере 3.1.а. (Уравновешенную с помощью 0,1 ммоль/л ТрисHC1 pH=7,5, 0,8 ммоль/л аргинина, 0,5 ммоль/л) NaC1 колонну с ETI-ceфapoзoй (25 мл)
нагружают 800 мл концентрата (12SV/час) и промывают уравновешивающим буфером до тех пор, пока экстинкция элюата при 280 нм не достигнет экстинкции буфера. Связанный материал элюируют с помощью 0,3 ммоль/л
аргинина, рН=4,5.
объем
активность
Спрот
SA
мл
IU/мл
мг/мл
IU/мг
Концентрат
800
20,000
11,3
1170
ЕТI-элюат
55
280,000
0,6
550,000
2. Очистка К2Р из E.coIi путем аффинной хроматографии на ЕТI-сефарозе без предварительного концентрирования.
6
BY 2120 C1
Уравновешенную с помощью 0,1 ммоль/л Трис-HC1, pH=7,5, 0,8 ммоль/л аргинина, 0,5 ммоль/л NaC1
колонну с ETI-ceфapозой (объем = 10 мл) загружают 12 л повторно окисленно смеси и промывают уравновешивающим буфером до тех пор, пока экстинкция элюата при 280 нм не достигнет экстинкции буфера. Элюирование связанного материала осуществляют с помощью 0,8 ммоль/л аргинина, pH=5.
объем
активность
Спрот
SA
I/F
мл
IU/мл
мг/мл
IU/мг
Повторно окисленная смесь
12.000
615
0,135
544556
25
ЕТI-элюат
42
105,000
0,185
568000
35
I/F: стимулирование путем фибрина = активность в присутствии фибрина отдельно от активности без
фибрина.
Пример 4.
Характеристика очищенного К2Р из E.соIi.
а) Протеин-химическая характеристика.
SDS-РАGЕ и обратная фаза жидкостной хроматографии высокого давления.
Гомогенность очищенного с помощью аффинной хроматографии с ЕТI сефарозой материала показана благодаря SDS-РАGE и обратной фазы жидкостной хроматографии высокого давления (R Р-НРLC). Из относительной длины пробега рассчитывается для К2Р из прокарионтов молекулярный вес 38.500 + 2.000 Да. Денситометрическая оценка дает чистоту препарата выше 95%.
R Р-НРL С основана на различном взаимодействии протеинов с гидрофобной матрицей. Это свойство используется в качестве аналитического метода для квалификации степени чистоты.
Анализ очищенного К2Р из Е.соli осуществляют через разделительную колонну с Нуклеозилом 300
(Knauer) с помощью градиентов трифторуксусная кислота (ацетонитрил) буфер А: 1,2 мл трифторуксусной кислоты в 1000 мл воды; буфер В: 300 мл воды, 700 мл ацетонитрила, 1 мл трифторуксусной кислоты; 0-100% Интегрирование хроматографического анализа дает чистоту выше 95%.
-N-терминальная последовательность аминокислот.
N-Терминальная последовательность аминокислот определяется с помощью АВI 470 - секвенатора со
стандартной программой и линейным РТН-детекрированием. Найденная последовательность SI-Y2-Q3-G4N5-S6-D7-С8-Y9 совпадает с ожидаемой, происходящей из ДНК-последовательности, последовательностью.
б) определение активности.
Ин витро активность К2Р из Е.соli определяется по описанию теста в Zeitschrift furdie gesamti innere
Medizen (LGIMAL) 42 (17) 478-486 (1987). Удельная активность составляет 550.000 IU/мг ± 200.000 IU/мг.
Стимулируемость К2Р из Е.соli благодаря Br CN -фрагментам фибриногена (активность в присутствии
фибриногеновых фрагментов отдельно от активности без фибриногеновых фрагментов) в этой тест-системе
составляет более 25.
в) ин витро-связывание с фибрином.
Ин витро-связывание К2Р из Е.соli с фибрином определяют по описанному Higgins и Vehar методу. (Higgins D.Z., Vehar G.A. (1987), Biochem., 26, 7786-7791).
На рис. 2 показано, что К2Р из Е.соli в противоположность t-РА из СНО или t-РА из Е.соli не обладает
никаким достойным внимания фиориновым связыванием.
Пример 5.
Для увеличения выхода экспрессии кодирующую К2Р-ген последовательность переклонируют в плазмид
с более высоким числом копий. Для этой цели используют плазмиду реРа 126.1, описанную в патенте ФРГ
38 38 378.0. Эта плазмида составляется главным образом из вектора рКК223-3 и кодирующей последовательности для t-РА, как описано в европейском патенте А-0 242 835.
В эту плазмиду прежде всего интегрируют последовательность fd-терминатора. Для этой цели плазмиду
реРа 126.1 линеаризируют с помощью рестрикционного фермента Hind. Таким образом расщепленную
плазмиду разделяют с помощью гель-электрофореза и получают препаративно. Плазмиду pLBHL (Beek и др.
(1978), Nucl. Acids Res., 5, 4495-4503; Zentz и др. (1981), PNAS 78(8): 4963) подвергают рестрикции с помощью Hind III и препаративно получают величиной примерно 360 вр Hind-фрагмент, который содержит fdтерминатop, путем гель-элетрофореза и гель-элюирования. Линеаризированный плазмид реРа 126.1 и длиной
360 вр Hind III-фрагмент из pLBHL лигируют. Смесь после лигирования котрансформируют с описанной в
заявке на патент ФPГ 38 38 378.0 плазмидой рuBS 500 в E.coIi DSM2102. Из клонов выбирают те, которые
содержат желательную плазмиду pePa 126 fd, которая отличается от исходной плазмиды реРа 126.1 тем, что
она содержит второе место разреза Hind III.
Из плазмиды реРа 126 fd получают два фрагмента: величиной 3,4 кв BamHI (Рvu I - фрагмент и величиной примерно 1,3 кв PvuI) XmaI -фрагмент. Оба указанных фрагмента лигируют с помощью величиной примерно 1,3 кв BamHI (XmaI-фрагмента из плазмиды рА 27.3 и трансформируют в E.coIi с помощью плазмиды
pUBS 500. Результирующая плазмида получает название рА 27 fd и может отличаться от реРа 126. с тем, что у
7
BY 2120 C1
подвергнутой рестрикции смеси с помощью EcoR I имеется второй очень маленький EcoR I -фрагмент из реРа 126 fd длиной примерно 610 вр в рА 27 fd, сокращенный примерно на 515 вр.
Пример 6.
Фармакологические данные экспримированного в прокарионтах t-РА-производного К2Р.
1. Фармакокинетика К2Р на кроликах.
К2Р на белых новозеландских кроликах сравнивают с Actilyse по их фармакокинетическим свойствам. Оба
фибринолитика настаивают в дозе 200 000 IU/кг КG в течение 30 минут. Пробы плазмы получают в определенные
моменты времени до, во время и после вливания. t-РА-Активность измеряется с помощью спектрофотометрического теста по J.H.Verheijen и др. Chromb. Haemostas, 48, 266 (1982)) модифицированному по H. Zill/Z. ges. I/пп
Меd 42, 478 (1987)).
Для расчета фармакокинетических параметров используют расчетную программу нелинейной регрессии,
модифицированную по H.J.Huang Aero-Astronautics-Report 64, Rici University, 1-30, 1969). Параметры рассчитывают индивидуально с помощью биэкспоненциальной фармакокинетической модели.
К2Р показывает в пять раз более длительное время полураспада (t1/2α =10,3 мин., уменьшение концентрации в плазме), чем Actilyse (t-РА-препарат фирмы Ehomal (таблица 1, рис. 5 и 6). По окончании вливания
(спустя 30 минут) в случае К2Р-рrо измеряют концентрации в плазмиде активности t-РА (Синф.), равной 1986
IU/мл, которая таким образом в шесть раз выше, чем в случае Actilyse. Распределительный объем центрального отделения (Ve) составляет для К2Р 46,8 мл/кг по сравнению с 73,7 мл/кг для Actilyse. Клиренс
всей плазмы (СIобщ.) по сравнению с Actilyse (СIобщ.= 22,2 мл/мин/кг) в случае К2Р-Рrо снижен на 1/7
(СIобщ.=3,2 мл/мин/кг). Для применения фибронолитика для инъекции пилюли особенно интересна "область
под кривой" (АUС), так как она допускает сравнение концентрации, главенствующей во времени в плазме.
К2Р показывает АUС в 8 раз выше (1064 1/мл.час) чем Аctilyse (133.3 IU/мл.час).
В целом, К2Р по сравнению с Actilyse в настоящее время единственный продажный рекомбинантный tРА-протеин, при равной дозе показывает улучшенный в 5-8 раз фармакокинетический профиль.
2. Фармакодинамика К2Р на кроликах.
Для испытания тромболитической эффективности используют основанную D. Collen и др. модель на кроликах по тромбозу яремной вены (J. Clin Invest, 71, 368, 1983). К2Р и Actilyse исследуют в трех, смотря по
обстоятельствам, дозах. Фибринолитики вливают в течение 4-х часов и затем определяют скорость тромболиза (таблица 2, рис. 5).
Рассчитанная с помощью линейной степени регрессии доза для скорости тромболиза 50% (ЭД50) составляет, для К2Р 124.000 IU/кг КG и для Actilyse 520.000 IU/кг КG, К2Р показывает, таким образом, в 4 раза
более высокое тромболитическое действие, чем Actilyse К2Р достигает, в зависимости от дозы, концентрации в плазме, активности t-РА, которая при четырехкратно сниженной дозе сравнима с Actilyse.
Сравнимая по тромболитическому действию с 800 кU Actilyse/кг KG-доза в 200 кU К2Р/кг КG приводит
к незначительным воздействиям на параметры получения фибриногена, плазминогена и α2-антиплазмина,
которые, однако, не отличаются от воздействий дозы 800 кU Actilyse/кг КG.
К2Р представляет собой t-РА-Mутеин, который на модели тромбоза яремной вены кролика при четырехчасовом вливании фибринолитиков при понижении дозы на 1/4 дозы Actilyse проявляет такое же тромболитическое
действие, как и Actilyse, К2Р не отличается при пониженной дозе от Actilyse по воздействиям на систему свертывания и по концентрации в плазме t-РА-активности.
Пример 7.
Фармакологические свойства К2Р из Е.соli на используемoй в качестве модели собаке с тромбозом коронарной артерии.
Для того, чтобы изучить тромболитическое действие К2Р из Е.соli на артериальных тромбах, в качестве
примера выбрана экспериментальной моделью животное с острым инфарктом миокарда. В качестве вида животных исследовали собаку. Метод образования тромба коронарной артерии представляет собой модификацию
способа Romson и др. (Chromb. Res. 17, 841 (1980). В открытой грудной клетке в случае находящихся наркозом
и при искусственном дыхании собак электрически раздражают поверхности интимы окружающей ветви A.
coronaria sinistra (= left circumflen coronaryartery = ZCK) (150mA) и благодаря этому возникает тромбоз. Дистально тромбоз прежде был вызван спиралью, чтобы удалить путем экспериментального стеноза реактивную
гиперемию. Проксимально коронарный тромбоз прежде был вызван спиралью, чтобы удалить путем экспериментального стеноза реактивную гиперемию. Проксимально коронарный тромбоз был инструментирован ZСХ
с электромагнитной плавающей (Flow) измерительной головкой, чтобы можно было измерять реперное слияние.
При изучении нахождения доз находящимся под действием гепарина собакам в течение 1 минуты вводили
путем иньекции ВМ 06.022 с эукариотным t-РА (Altephase, Actilyse и др. Karl Chomal ГмбХ, Biberach, ФРГ) в
виде четырех различных доз, и с плацебо, смотря по обстоятельствам, 6-ти животным на дозу в виде внутри8
BY 2120 C1
венной одноразовой начальной пилюли. До и в определенные моменты времени после инъекции получали пробы плазмы, чтобы определить концентрацию в плазме t-РА-активности и фибриногена, плазминогена и α2антиплазмина, а также, чтобы определить число тромбоцитов во всей крови. Фибриноген измеряют коагулометрически по Клаусу (Acta Haemal., 17, 237, 1957), плазминоген и α2-антиплазмин измеряют, как описано у
Collen и др.) J. Clin. Invest. 71. 368. 1983), спектрометрически.
Таблица 1
Фармакокинетические параметры, полученные из компьютерных расчетов концентрации t-РА в
плазме временные данные на основе t-РА-активности
Средство/
доза:
200000 IU/кг
К2Р (n=4)
(n=6)
t1/2α:
bw/:
(мин.)
10,3±1,7
2,1±0,6
t1/2β:
Синф.
Ve
Ciобщ.
(мин.)
14,9±4,6
10,9±2,4
(IU/мл)
1986,6±762,6
326,6±118,1
(мл/кг)
46,8±14,7
73,7±19,7
(мл/мин/кг)
3,2±1,1
22,2±7,6
AUC
экстрапол.
(1/мл час)
1064,4±443,2
133,3±44,1
Таблица 2
Тромболиз, уровень активности t-PA в плазме по окончании вливания в течение 4-х часов/ и параметры гемостазиса
 и растворителя
(30 минут по окончании вливания) К2Р Actilyse
К2Р
200 кU/кг
79±9 (n=3)
К2Р
100 кU/кг
32±6 (n=5)
К2Р
50 кU/кг
29±1 (n=2)
Растворитель
NaCl/твин
11±1 (n=6)
Actilyse
800 кU/кг
64±6 (n=7)
Тромболиз (%)
t-РА-активность плазмы /1./мл/
93:7±18,2
44±3
7±0
107±27
фибриноген (%)
74±2
90±6
86,5±6
92±3
77±6
плазминоген (%)
79±2
75±6
87±11
98±10
77±4
λ2-антиплазмин (%)
70±1
70±4
93±4
98±8
74±6
±SEM; кU=1000 I; патраметры гемостазиса (%), рассчитанный на основную линию).
Actilyse
400 кU/кг
46±3 (n=6)
47±9
90±3
88±4
87±3
Далее, "Simplati время кровотечения" измеряли на задней ноге собаки с помощью стопора (защелки)
Simplati I, Organon Cekhika, Eppelheim, ФРГ) во время застоя 40 мм Hg (j. Surg. Res, 27, 244, 1979). Статистическое сравнение измеренных величин после инъекции с контрольным значением до инъекции осуществляют с помощью теста Wilcoxon для разниц пар.
Для того, чтобы можно было описать тромболитический успех, указывается число обоснованных репером
на "дозе-группа" животных (=скорость слияния реперов), а также время вплоть до слияния реперов (=время
слияния реперов). Далее, определяют мокрый вес еще имеющегося спустя 2 часа после инъекции остаточного
тромба, и определяют количество животных с новой закупоркой после слияния реперов (= скорость повторной
окклюзии). С помощью полулогарифмического регрессионного анализа действия доз (отношение скоростей
слияния реперов) для каждого вещества рассчитывается эффективная доза для 50%-ной скорости реперного
слияния (=ЭД50). Статистическое сравнение веса остаточного тромба осуществляют с помощью теста Wilcoxon
Мапп-whithey для несвязанных проб на выдержку.
Концентрация в плазме t-РА-активности измеряется с помощью спектрофотометрического теста по Verheijen и др. (Chromb. Haemost., 48, 266, 1982), модифицированного по Zill/Z, desamte Inn. Med, 42, 478, 1987). Для
расчета фармакокинетических параметров используется расчетная программа нелинейной регрессии, модифицированная по Н.У. Huang (Aero-Astronautics Report, 64, Rice University, США, 1-30, 1969). Параметры рассчитываются индивидуально после снижения свойственного организму базального уровня t-РА-активности нижеследующих измеренных значений с помощью би-экспоненциальной фармакокинетической модели.
Получаются следующие результаты:
1. Фармакодинамика на собаке.
К2Р после внутривенной инъекции приводит к зависящей от дозы скорости слияния реперов. Максимальный
эффект (скорость слияния реперов 100%) достигается после инъекции 200 кU/кг КG. Доза со 100% успеха слияния
реперов в случае Actilyse составляет 1600 кU/кг КG. Сравнение значений ЭД50 для К2Р (ЭД50=83 кU/кг КG) дает
сниженное в 11,5 раз значение, чем для Actilyse (ЭД50=961 кU/кг КG). Введение плацебо на ведет ни к какому
9
BY 2120 C1
слиянию реперов. Вес остаточного тромба у животных с введенным плацебо составляет 9,6±1,1 мг (среднее значение ±SЕМ); как К2Р, так и также Actilyse приводят с увеличением доз к статистически значительному снижению
веса остаточного тромба по сравнению с плацебо-контролем. Слияние реперов происходит в случае обоих фибринолитиков в среднем у всех животных спустя 25,9±3,5 мин (К2Р), соответственно, спустя 24,2±6,2 мин (Actilyse).
Большинство обработанных К2Р или Actilyse собак повторно окклюдируют после слияния реперов (таблица 3).
2. Фармакокинетика на собаке.
После внутривенной инъекции 200 кU/кг К2Р или Actilyse на наркотизированной собаке показано, что быстрая фаза уменьшения концентрации в плазме, выраженная в виде t1/2α в случае К2Р с 7,2±1,1 мин на фактор 4,5
длиннее, чем в случае Actilyse с 1,6±0,2 мин (таблица 4). Найденная непосредственно после окончания инъекции
концентрация в плазме К2Р примерно вдвое выше, чем в случае Аctilyse. Удаление К2Р из плазмы (клиренс
плазмы = СIобщ.) осуществляется в девять раз медленнее, чем в случае Aсtilyse. Соответственно, площадь под
кривой концентрации в плазме К2Р примерно в 9,5 раз больше, чем таковая в случае Actilyse.
3. Специфичность фибрина на собаке.
Спустя 2 часа после инъекции К2Р находят зависящее от дозы в небольшой степени снижение остаточной концентрации фибриногена до 81±10% в случае самой высокой дозы (200 кU/кг КG).
В противоположность этому концентрация фибриногена после введения самой высокой дозы Actilyse
(1600 кU/кг КG) почти полностью снижена до 3±0% (таблица 5). Если осуществляют полулогарифмический
регрессионный анализ доза-побочное действие (соотношение снижения фибрина) и определяют тромболитическое для ЭД50 действие в отношении остаточной концентрации фибриногена, то для эквипотентных доз в случае К2Р остаточное содержание фибриногена получается 92,5% по сравнению с 38,6% в случае Actilyse. Также для плазминогена и α2-антиплазмина находят зависящее от дозы снижение остаточного содержания спустя 2
часа после инъекции, которое в случае Actilyse более ярко выражено, чем в случае К2Р. Лишь концентрация
тромбоцитов в случае обоих веществ почти не затрагивается.
4. Влияние на время кровотечения у собаки.
Внутривенная инъекция К2Р не дает никакого статистически значительного удлинения времени кровотечения по сравнению с контрольным значением перед инъекцией во всех 4-х различных дозах. В противоположность этому Actilyse в дозах 1130 и 1600 кU/кг КG статистически значительно удлиняет время кровотечения (рис. 6 и 7).
5. Общая оценка.
На описанной модели-собаке тромбоза коронарных артерий К2Р показывает себя как тромболитик, который после внутривенной инъекции пилюли (Bolus) может достигать 100%-ной скорости слияния реперов,
не влияя сильно на концентрацию фибриногена и без заметного удлинения времени кровотечения. По сравнению с Actilyse в качестве уровня техники К2Р в тромболитической потенции после внутривенной инъекции пилюли оказался отчетливо превосходящим (фактор 11,5). Исследование фармакокинетического профиля К2Р, далее, дает, что по сравнению с Actilyse клиренс К2Р, как выражение для более продолжительного
удаления из плазмы, в девять раз длительнее.
Фиг. 2
10
BY 2120 C1
Фиг. 3
Фиг. 4
Фиг. 5
11
BY 2120 C1
Фиг. 6
Фиг. 7
Cоставитель А.И. Сорокин
Редактор В.Н. Позняк
Корректор Т.Н. Никитина
Государственный патентный комитет Республики Беларусь.
220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66.
12
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
262 Кб
Теги
by2120, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа