close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY2196

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(19)
BY (11) 2196
(13)
C1
6
(51) G 01N 33/53,
(12)
G 01N 33/531
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ
КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ
(54)
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОМАГНИТОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ
АЛЬБУМИН-ПРОТЕИНОВЫХ МИКРОСФЕР, КОНЪЮГИРОВАННЫХ
С АНТИТЕЛАМИ
(21) Номер заявки: 1819
(22) 21.03.1994
(46) 30.06.1998
(71) Заявитель: Витебский медицинский институт (BY)
(72) Авторы: Бекиш О-Ян., Хулуп Г.Я., Панфилов А.С.,
Виленский Г.М. (BY)
(73) Патентообладатель: Витебский
медицинский
институт (BY)
(57)
1. Способ получения иммуномагниточувствительных альбумин-протеиновых микросфер, конъюгированных с антителами путем термической коагуляции растворов альбумина человека лиофилизированного и протеина A St. aureus с магнетитом, очистки взвеси микрокапсул диэтиловым эфиром, перевода взвеси из
диэтилового эфира в водную фазу и последующего конъюгирования микрокапсул с антителами, отличающийся тем, что при переводе взвеси микрокапсул из диэтилового эфира в водную фазу используют 0,1 %ный раствор твина-80.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что перед конъюгированием микрокапсул с антителами проводят предварительную обработку взвеси микрокапсул 0,3 %-ным раствором хлорида хрома (III).
(56)
1. Kanzia J., Sholz W., Anderson M.J.//J.Immunol. Meth, 1984.-Vol. 75.-Р.31-41.
Изобретение относится к медицинской биотехнологии, в частности к технологии получения магниточувствительных микрокапсулированных носителей, коньюгированных с антителами, для выделения биологически активных материалов посредством сепарации в магнитном поле.
Существует способ получения микрокапсул из альбумина человека лиофилизированного и протеина A St.
aureus, содержащий магнетит [1], посредством термической коагуляции. Однако, недостатком этого способа является то, что полученные с его помощью микрокапсулы обладают низкой иммунной специфичностью по отношению к выделяемым клеткам вследствие большой степени диффузии молекул антител с их поверхности. Этот
недостаток обуславливает низкую эффективность использования микрокапсул в процессе осуществления деплеции
клеток-мишеней. Вторым недостатком описанного способа изготовления иммуномагнитных микрокапсул является
сложность перевода взвеси микрокапсул в водную среду в процессе их отмывки от масляной фазы. Третьим недостатком вышеуказанного метода является использование значительных количеств протеина A St. aureus для изготовления иммуномагнитных микрокапсул.
Задачей изобретения является усовершенствование метода изготовления микрокапсул из протеина А и альбумина человека размерами 2-5 мкм с высокой степенью активности при коньюгации с антителами.
Сущность предлагаемого изобретения заключается в использовании растворов поверхностно активных
веществ, в частности 0,1% раствора твина-80, в процессе перевода взвеси микрокапсул из диэтилового эфира
в водную среду во время их отмывки от масляной фазы; и в предварительной обработке взвеси микрокапсул
свежеприготовленным раствором хлорида хрома (III) перед последующим добавлением антител, в результате чего образуются дополнительные хелатные связи антител с поверхностью микрокапсул. Создание дополнительных хелатных связей между поверхностью микрокапсул и лигандами антител позволяет эффективно
использовать протеин А, который является достаточно дорогостоящим компонентом микрокапсул, в количествах в 5 раз меньших, чем предложены авторами вышеуказанной работы [1].
BY 2196 C1
Синтез альбумин-протеиновых микрокапсул производят следующим образом: в стеклянную емкость отвешивают альбумин человека лиофилизированный и добавляют белок A Staphylococcus aureus в соотношении 1:5.
Магнитный компонент, в качестве которого используется мелкодисперсный магнетит Fe3O4, полученный щелочным соосаждением солей железа 2-х валентного (FeSO4) и 3-х валентного (FeCl3), вводят в белковую смесь в
количестве 20% от сухой массы компонентов. Затем для набухания смеси белков добавляют дистилированную
Н2О в соотношении 3:1 к общей массе компонентов и перемешивают до равномерного распределения ингредиентов в жидкости. К полученной смеси добавляют охлажденное оливковое масло в соотношении 10:1 по объему и диспергируют ультразвуком мощностью 40 Вт дробно по 30 секунд в течение 5 минут на приборе УЗДН-А
с использованием ледяной бани. Полученную эмульсию типа вода в масле струйным методом вводят при тщательном перемешивании в нагретое до 120°С оливковое масло, объем которого 10-тикратно превышает объем
эмульсии. Перемешивание продолжают в течение 20 минут. Суспензию микрокапсул в масле охлаждают до
комнатной температуры и центрифугируют при 300g. Затем надосадок сливают, а полученный осадок микрокапсул отмывают 5 раз безводным диэтиловым эфиром, взятым в количестве 10-кратно меньшем, чем удаленная масляная фаза, с последующим осаждением микрокапсул на магните с напряженностью магнитного поля
0,3 Тл в течение 15 минут. На стадии перевода взвеси микрокапсул из диэтилового эфира в водную среду микрокапсулы, осевшие под действием магнитного поля, диспергируют в 0,1% водном растворе твина-80, взятом
том же объеме, что и диэтиловый эфир. Затем микрокапсулы осаждают на магните с напряженностью магнитного поля 0,3 Тл и 5-кратно отмывают дистилированной водой, взятой в том же объеме, что и 0,1% раствор
твина-80 с последующим осаждением на магните. Затем осевшие микрокапсулы ресуспендируют при помощи
ультразвука мощностью 40 Вт в 0,3% растворе хлорида хрома (III), вятом в том же объеме, что и водная фаза,
для активации их поверхности, и инкубируют 30 минут при температуре 20°С, после чего суспензию осаждают
на магните в течение 10 минут. Инкубацию с антителами проводят в 0,2 М фосфатном буфере рН=7,4 при температуре 4°С в течение 12 часов (соотношение микрокапсул с антителами составляет 100:1 по массе). От избытка
неприсоединившихся антител и следовых количеств хлорида хрома (III) освобождаются осаждением суспензии
микрокапсул на магните в течение 10 минут с последующий 3-хкратной отмывкой 0,2 М фосфатным буферным
раствором рН=7,4.
Для сравнения эффективности активации поверхности микрокапсул при помощи хлорида (III) с другими
методами в качестве альтернативных методов выбраны:
1) Инкубация микрокапсул с антителами в 0,1 М фосфатном буфере рН=7,4 вследствие сохранения
свойств протеина А специфически связывать антитела;
2) Дополнительная активация белковой поверхности микрокапсул 2,5% раствором глутарового альдегида
в течение 30 минут.
Количественную оценку проведенной коньюгации производят постановкой иммуноферментной реакции с использованием антител, меченных пероксидазой хрена, следующим образом: исследуемые типы микрокапсул доводят до
стандартной концентрации, при которой оптическая плотность взвеси микрокапсул при длине волны 750 нм равна
1±0,05. В лунки 96-луночной плоскодонной планшеты для иммуноферментного анализа помещают микрокапсулы
каждой из вышеуказанных модификаций по 100 мкл в каждую лунку и добавляют раститрованные диагностические
антитела против иммуноглобулинов человека, меченные пероксидазой хрена. После проведения инкубации в течение
3 часов при температуре 20°С планшеты с микрокапсулами помещают на постоянный магнит с напряженностью магнитного поля 0,3 Тл на 10 мин. для осаждения микрокапсул и 3 раза отмывают от несвязавшихся антител 0,1 М фосфатным буферным раствором рН=7,4 с последующим осаждением микрокапсул на магните. После отмывки в каждую
лунку с осадком микрокапсул добавляют 150 мкл 0,1 м фосфатного буферного раствора (PBS) pH=7,4, добавляют 50
мкл 0,04% раствора ортофенилендиамина (OPD) в 0,1 М цитратно-фосфатном буфере рН=5,4. После инкубации в
темноте в течение 10 минут, для остановки реакции добавляют в каждую лунку по 50 мкл 0,5 М раствора серной кислоты, Ту же реакцию проводят с раститрованными антителами в лунках той же планшеты для построения калибровочной кривой. Планшеты центрифугируют и переносят окрашенный надосадок в соседнюю лунку планшеты для
замера оптической плотности. Оптическую плотность окрашенного субстрата измеряют на аппарате АИФ-Ц-01С.
В результате количественной оценки установлено, что связывающая способность микрокапсул, обработанных 0,3% раствором хлорида хрома (III), составляет 96,6%. Она не зависит от количества микрокапсул, но проявляет достоверную зависимость от количества используемых моноклональных антител (таблица).
2
BY 2196 C1
Связывающая способнсть микрокапсул, обработанных CrCL3 достоверно выше, чем обработанных глутаровым альдегидом или в 0,1 М фосфатном буфере, где микрокапсулы присоединяют моноклональные антитела за счет активных центров протеина А.
Результаты проведения иммуноферментного анализа по определению связывающей способности
микрокапсул (МКК) и монгоклональных антител (МКА) при различных способах активации.
МКК
МКК
МКК
МКК
МКК
МКК
МКК
Тип
+МКА
+МКА
+МКА
+МКА
+МКА
+МКА
+МКА
активации
1:1
1:2
1:4
1:8
1:16
1:32
1:64
Глутаровый
альдегид
1
1,89
1,85
1,98
1,78
1,73
1,73
1,66
2
2,02
1,98
1,93
1,83
1,79
1,80
1,74
3
1,86
1,84
1,89
1,79
1,74
1,81
1,72
4
1,80
1,76
1,82
1,76
1,66
1,69
1,68
5
1,92
2,09
2,02
1,86
1,82
1,86
1,74
6
1,84
1,80
1,83
1,73
1,63
1,60
1,63
7
1,80
1,70
1,78
1,71
1,55
1,65
1,65
M±m
1,87±0,07
1,85±0.12
1,89±0,09
1,78±0,05
1,70±0,09 1,701±0,092 1,696±0,045
Хлорид
хрома
1
2,13
2,11
2,07
2,05
2,01
1,94
2,02
2
2,17
2,13
2,08
2,08
2,03
1,99
2,02
3
2,16
2,15
2,14
2,10
2,09
2,03
2,04
4
2,14
2,11
2,12
2,07
2,04
2,01
2,00
5
2,06
2,05
2,05
2,04
2,01
2,01
2,01
6
2,07
2,04
2,04
2,02
2,09
2,00
2,00
7
2,05
2,02
2,03
2,03
2,00
2,00
1,99
M±m
2,11±0,053
2,09±0,04
2,08±0,03
2,05±0,02
2,03±0,03
2,00±0,02
2,01±0,01
Фосфатный
буфер
1
1,96
1,90
1,89
1,71
1,66
1,71
1,64
2
2,03
2,02
2,03
1,87
1,88
1,88
1,82
3
1,91
1,92
1,93
1,77
1,83
1,78
1,69
4
1,87
1,88
1,90
1,75
1,70
1,73
1,63
5
1,85
1,88
1,94
1,73
1,65
1,72
1,57
6
1,85
1,80
1,77
1,55
1,47
1,56
1,51
7
1,80
1,74
1,77
1,61
1,54
1,62
1,57
M±m
1,90±0,07
1,88±0,089 1,89±0,09
1,71±0,10
1,67±0,14
1,71±0,10
1,63±0,09
Синтезированные альбумин-протеиновые микрокапсулы имеют ряд преимуществ перед прототипом,
описанным в работе [1]: 1) приготовление и очистка их достаточно просты и быстры, 2) антитела могут быть
связаны лигандами как с протеином А, так и с дополнительными активными центрами, образовавшимися
после активации поверхности микрокапсул металлохелатным комплексообразующим агентом, что позволяет
получить высокий процент связывания и значительно уменьшить диффузию антител с поверхности микрокапсул, полученные микрокапсулы легко ресуспендируются в водных растворах, проявляют минимальное
неспецифическое связывание и обладают высокой иммунной специфичностью к клеткам-мишеням.
Микрокапсулы являются стабильными в диапазоне рН от 2 до 9. Микрокапсулы обладают серологической специфичностью антител совместно с сильным селективным ответом на магнитное поле и могут быть
эффективно использованы при выделении необходимых клеток из клеточных смесей в магнитном поле.
Cоставитель А.И. Сорокин
Редактор В.Н. Позняк
Корректор Т.Н. Никитина
Государственный патентный комитет Республики Беларусь.
220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66.
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
130 Кб
Теги
by2196, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа