close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY2489

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(19)
BY (11) 2489
(13)
C1
6
(51) G 01N 33/574
(12)
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ
КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ
(54)
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОПУХОЛЕВОГО РОСТА И ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ТИПА ОПУХОЛИ
(21) Номер заявки: 961123
(22) 12.12.1996
(46) 30.12.1998
(71) Заявитель: Институт физиологии Национальной
Академии наук Беларуси (BY)
(72) Авторы: Красковский Г.В., Миголеня Т.И. (BY)
(73) Патентообладатель: Институт физиологии Национальной Академии наук Беларуси (BY)
(57)
Способ диагностики опухолевого роста и установления типа опухоли, включающий анализ крови и определение в ней антигенов, отличающийся тем, что в сыворотке крови и тканевых жидкостях опухоленосителей определяют ассоциацию факторов, включающих иммунный комплекс, специфический для данной
опухоли комплекс свободных антигенов, при анализе в качестве тест-изоантисывороток используют содержащие соответствующий специфическому антигенному комплексу данной опухоли набор антител изоантисывороток, полученных у опухоленосителей с полностью хирургически удаленной у них гомологичной
опухолью.
(56)
1. SU 1802323, МПК G 01N 33/53, 1993.
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии.
Известен способ диагностики опухолевого роста и установления типа опухоли, включающий анализ крови и определение в ней антигенов [1].
Однако, этот способ не позволяет точно установить тип злокачественной опухоли.
Задачей изобретения является повысить точность диагностики опухолевого роста на любом его этапе и
определить тип опухоли.
Поставленная задача достигается тем, что в способе диагностики опухолевого роста и установления типа
опухоли, включающим анализ крови и определение в ней антигенов, в сыворотке крови и тканевых жидкостях
опухоленосителей определяют ассоциацию факторов, включающих иммунный комплекс, специфический для
данной опухоли комплекс свободных антигенов, при анализе в качестве тест-изоантисывороток используют содержащие соответствующий специфическому антигенному комплексу данной опухоли набор антител изоантисывороток, полученных у опухоленосителей с полностью хирургически удаленной у них гомологичной
опухолью.
Разработанный нами способ диагностики рака осуществляется следующим образом:
1. Получаем аналитические тест-изоантисыворотки от опухоленосителей с полностью хирургически удалёнными опухолями разного типа («А», «В» и т.д.), содержащие набор антител, соответствующий специфическому для разного типа опухолей («А», «В» и т.д.) набору антигенов, и контрольные сыворотки от
интактных (здоровых) индивидов.
Прививаем под кожу подошвенной поверхности задней лапки каждой мыши (2-х - 3-х месячного возраста)
по 1õ106 клеток соответствующей опухоли типа «А», «В» и т.д. Когда опухоль достигнет величины 9×5×5 мм,
на лапку между голенью и стопой накладываем лигатуру и стопу с опухолью удаляем, культю смазываем йодом. Через 13-21 день после удаления опухоли у мышей под эфирным наркозом путём рассечения аксиллярного
сосудистого сплетения получаем кровь и из неё сыворотку по обычной методике. Аналогичным методом получаем контрольную сыворотку у интактных (здоровых) мышей. Во всех используемых при анализе сыворотках:
сыворотка мышей с растущей опухолью (СО), сыворотка мышей с полностью хирургически удалённой опухолью (СУО), сыворотка интактных (здоровых) мышей (ИС) определяем исходное количество иммунных комплексов (ИК) с помощью 3,5 % полиэтиленгликоля (ПЭГ 6000) по стандартной методике. Определяем также
BY 2489 C1
количество образующегося преципитата при добавлении 3,5 % ПЭГ 6000 к экстрактам 1:10 из опухолей типа
«А», «В» и т.д.
В полученных изоантисыворотках у мышей с полностью хирургически удалённой опухолью (СУО) типа
«А», «В» и т.д. определяем наличие антител против специфического набора антигенов, соответствующего
опухоли типа «А», «В» и т.д. с помощью реакции между СУО («А», «В» и т.д.) с соответствующим каждой
опухоли в отдельности экстрактом из опухолевых клеток 1:10 - ЭО («А», «В» и т.д.). Для получения содержащей специфический для каждого типа опухоли комплекс антигенов ЭО клетки опухоли типа «А», «В»" и
т.д. растираем в ступке с кварцевым песком на холоде (+4 °С), затем добавляем физиологический раствор
Хенкса в соответствии 1:10, перемешиваем, выдерживаем в холодильнике 2 часа, надосадок центрифугируем
при 3000 об / мин. 30 мин, а затем час при 105 000 g.
К части сыворотки СУО («А», «В» и т.д.), полученной от каждой мыши в отдельности, добавляем в соотношении 1:1 (0,1 мл+0,1 мл или 0,05 мл + 0,05 мл) соответствующего экстракта - ЭО («А», «В» и т.д.) 1:10, перемешиваем, смесь выдерживаем в термостате час при 37°С. По стандартной методике определяем количество
образующихся иммунных комплексов (для контроля проводим реакцию между сыворотками интактных, здоровых
индивидов-мышей и экстрактом опухолей разного типа («А», «В» и т.д.). При взаимодействии между сывороткой
интактных мышей и экстрактом из опухолей при добавлении 3,5 % ПЭГ 6000 не образуется дополнительное количество преципитата, превышающее исходный уровень (количество преципитата, образующегося при добавлении
3,5 % ПЭГ 6000 к интактной сыворотке и соответствующему экстракту из опухоли 1:10).
При наличии противоопухолевых антител в СУО при взаимодействии (реакции) ее с экстрактом из соответствующей опухоли при добавлении 3,5 % ПЭГ 6000 количество образующегося преципитата обычно на 19- 60 %
(средние по разным опытам) превышает исходный уровень ПЭГ-преципитата в этой сыворотке (при анализе из
суммарной величины ПЭГ-преципитата, образующегося при реакции, вычитаем величину ПЭГ-преципитата экстракта из опухоли).
СУО каждого типа опухоли от отдельных мышей, содержащие противоопухолевые антитела, соединяем
и используем как тест-изоантисыворотки СУО (анти А), СУО (анти В) и т.д.
2. Определяем наличие опухолевого роста и типа опухоли в организме опухоленосителя.
Получаем исследуемую сыворотку опухоленосителя. Мышам прививаем под кожу спины по 6 × 106 клеток, допустим, опухоли «А». Начиная с 5-го для после прививки опухоли до терминальной стадии опухолевого роста (в любой период) получаем кровь у мышей-опухоленосителей путём рассечения аксиллярного
сосудистого сплетения или из орбитального синуса, из неё готовим по обычной методике сыворотку (исследуемая сыворотка) - сыворотка опухоленосителя (СО). Получаем сыворотку у здоровых (интактных) мышей
(СИ).
С помощью 3,5 % ПЭГ 6000 в сыворотках опухоленосителей и интактных животных (используя часть
сыворотки) определяем наличие и количество иммунных комплексов (ИК). Если есть опухоль, в предполагаемой сыворотке опухоленосителей количество нативных ИК в 1,5-1,8 раза (на 50 - 70 %) должно быть выше количества ИК у интактных (здоровых) животных. Этот признак важен, но не обязателен (при
опухолевом росте может быть отсутствие повышенного количества ИК, но повышенное количество комплекса свободных антигенов при опухолевом росте всегда имеет место и является обязательным признаком
опухолевого роста). С использованием тест-сывороток СУО (анти А), СУО (анти В) и т.д. определяем наличие в исследуемой сыворотке опухоленосителя комплекса свободных опухолевых антигенов и его специфичность - соответствие определённому типу опухоли по образованию ИК при реакции СО и СИ с СУО
(анти А), СУО (анти В) и т.д. и добавлении 3,5 % ПЭГ 6000.
Для этого к единице объёма исследуемой сыворотки (СО и СИ) добавляем в соотношении 1:1 СУО (анти А), СУО
(анти В) и т.д. Выдерживаем час при 37 °С в термостате, затем с помощью 3,5 % ПЭГ 6000 определяем количество
ИК, образующихся при проведении иммунологической реакции.
Необходимые серии при проведении диагностических реакций:
1. СО + СУО (анти А)
2. СО + СУО (анти В) и т.д.
3. СИ + СУО (анти А)
4. СИ + СУО (анти В) и т.д.
При проведении реакции в случае, если СО получена от опухоленосителя и у него опухоль типа «А», то
при проведении указанной реакции получатся следующие результаты:
Количество ИК, образующихся при реакции СО + СУО (анти А), СУО (анти В) и т.д. будет в 2-5 раз превосходить количество ИК, образующихся при взаимодействии СИ с СУО (анти А), (анти В) и т.д.
Количество ИК, образующихся при реакции СО с гомологичной ей СУО (анти А) будет в 2-3 раза выше,
чем при реакции с негомологичной СУО (анти В) и т.д.
Количество ИК, образующихся при реакции СО с СУО (анти А), СУО (анти В) и т.д. будет в 1,3- 2 раза
выше, по сравнению с количеством нативных ИК в СО. Причём при реакции СО с гомологичной СУО (анти
2
BY 2489 C1
А) оно превышено в 2 раза (на 84,6 - 93,3 %). При реакции СО с негомологичными СУО (анти В) и т.д. оно
будет выше в 1,3- 1,5 раза или на 33 - 50 %.
На основании вышеизложенного таким образом устанавливается наличие и тип опухоли в организме, а также
осуществляется прогнозирование опухолевого роста при изучении изменения количества нативных иммунных
комплексов и свободных опухолевых антигенов (если таковые обнаружены) в динамике, так как твёрдо установлено, что при прогрессивном опухолевом росте количество ИК выше интактного контроля, но остаётся на одном
уровне, а количество специфического для опухоли комплекса свободных антигенов возрастает, при отсутствии
опухоли (в результате её удаления) снижаются, а затем исчезают в сыворотке крови иммунные комплексы и полностью исчезают свободные опухолевые антигены и появляются противоопухолевые антитела.
Примеры: Определение наличия опухолевого роста и типа опухоли АКЭ или АГ 22а у мышей.
Получаем аналитические тест-изоантисыворотки от мышей-носителей асцитной карциномы Эрлиха
(АКЭ) и асцитной гепатомы 22а (АГ 22а) с полностью хирургически удалёнными опухолями и сыворотку
интактных (здоровых) мышей. Мышам прививаем под кожу подошвенной поверхности задней лапки по 1 ×
106 клеток АКЭ или АГ 22а. Когда опухоль достигает величины 9х5х5мм, на лапку между голенью и стопой
накладываем лигатуру и стопу с опухолью удаляем под эфирным наркозом. Через 13-21 день после удаления
опухоли под эфирным наркозом путём рассечения аксиллярного сосудистого сплетения получаем кровь и из
неё сыворотку. Получаем сыворотку у интактных (здоровых) животных. Во всех используемых сыворотках
(сыворотки мышей с растущей опухолью - АКЭ и АГ 22а-, сыворотки мышей с удалённой АКЭ и АГ 22а СУО (АКЭ) и СУО(АГ 22а), сыворотка здоровых мышей) определяем исходное количество иммунных комплексов с помощью 3,5 % ПЭГ 6000. Определяем количество образующегося преципитата при добавлении
3,5 % ПЭГ 6000 к экстрактам из АКЭ и АГ 22а 1:10. Определяем наличие антител против специфического
набора антигенов соответствующего опухолям АКЭ и АГ 22а типа с помощью реакции между СУО (АКЭ) и
СУО (АГ 22а) и соответствующим каждой опухоли в отдельности экстрактом из опухолевых клеток 1:10.
Для получения содержащего специфический для каждой опухоли комплекс антигенов экстракта (ЭО) клетки
АКЭ и АГ 22а растираем в ступке с кварцевым песком на холоде (+4 °С), затем добавляем физиологический
раствор Хенкса в соотношении 1:10, перемешиваем, выдерживаем в холодильнике 2 часа, надосадок центрифугируем при 3000 об/мин 30 мин, а затем час при 105 000 g (экстракт можно хранить в холодильнике
при - 20 °С).
К части сыворотки СУО (АКЭ) или СУО (АГ 22а), полученной от каждой мыши в отдельности, добавляем в соотношении 1:1 (0,1 мл+ 0,1 мл или 0,05 мл + 0,05 мл) соответствующий экстракт ЭО (АКЭ) или ЭО
(АГ 22а), перемешиваем. Смесь выдерживаем в термостате час при 37°С. По стандартной методике определяем количество образующихся иммунных комплексов (для контроля проводим реакцию между сывороткой
здоровых мышей и экстрактом из опухолей АКЭ и АГ 22а). При взаимодействии между сывороткой интактных мышей и экстрактом из опухолей при добавлении ПЭГ 6000 (3,5%) не образуется дополнительное количество преципитата, превышающее исходный уровень (количество преципитата, образующегося при
добавлении 3,5% ПЭГ 6000 к интактной сыворотке и соответствующему экстракту из опухоли).
При наличии противоопухолевых антител в СУО (АКЭ) и СУО (АГ 22а) при реакции их с экстрактами из
опухолевых клеток ЭО (АКЭ) и ЭО (АГ 22а) при добавлении 3,5% ПЭГ 6000 количество образующегося
ПЭГ-преципитата в среднем на 27% превышает исходный уровень преципитата в этой сыворотке (при анализе из суммарной величины ПЭГ-преципитата, образующегося при реакции, вычитают величину ПЭГпреципитата экстракта из опухоли).
Сыворотки СУО (АКЭ) и СУО (АГ 22а) отдельных мышей, содержащие противоопухолевые антитела анти-АКЭ и анти-АГ 22а, соединяем и используем для диагностики (анализа) как тест-изоантисыворотки СУО (анти-АКЭ) и СУО (анти-АГ 22а).
Получаем исследуемые сыворотки опухоленосителей. Мышам прививаем по 6×106 клеток АКЭ или АГ 22а под
кожу спины. Через 10 дней после прививки опухоли (средний вес АКЭ - 1,13 ± 0,01 г; АГ 22а - 1,25 ± 0,13 г) у мышей получаем кровь из аксиллярного сплетения или орбитального синуса, готовим исследуемую сыворотку. Получаем для контроля сыворотку интактных (здоровых) мышей (СИ). С помощью 3,5 % ПЭГ 6000 в сыворотке
опухоленосителя и интактных мышей (используя часть сыворотки) определяем наличие и количество нативных
иммунных комплексов. У интактных мышей количество ИК (в ед. оптической плотности) в сыворотке - 0,017. У
мышей с АКЭ - 0,026 (превышение контрольного уровня в 1,5 раза или на 53 %). У мышей с АГ 22а количество
ИК - 0,030, что превышает контрольный уровень в 1,8 раза или на 76 %.
С помощью имеющегося набора тест-изоантисывороток - СУО (анти-АКЭ) и СУО (анти-АГ 22а) определяем в исследуемой сыворотке опухоленосителя наличие комплекса свободных опухолевых антигенов и его
специфичность - соответствие типу опухоли (АКЭ или АГ 22а) по образованию ИК при реакции исследуемой сыворотки опухоленосителя и сыворотки интактных индивидов (СИ) с СУО (анти-АКЭ) и СУО (антиАГ 22а) и добавлении 3,5 % ПЭГ 6000. Для этого к единице объёма исследуемой сыворотки опухоленосителя (СО) и СИ добавляем в соотношении 1:1 СУО (анти-АКЭ) и СУО (анти-АГ 22а). Смесь выдерживаем час
3
BY 2489 C1
при 37 °С в термостате, затем с помощью 3,5 % ПЭГ 6000 определяем количество ИК, образующихся при
проведении иммунологической реакции.
Пример 1. Определяем наличие опухолевого роста и типа опухоли (АКЭ) у мышей-опухоленосителей.
Необходимые серии исследования:
1. Сыворотка опухоленосителя - СО (АКЭ)+ СУО (анти-АКЭ).
2. Сыворотка опухоленосителя - СО (АКЭ)+ СУО (анти-АГ 22а).
3. Сыворотка интактных мышей - СИ + СУО (анти-АКЭ).
4. Сыворотка интактных мышей - СИ + СУО (анти-АГ 22а).
Результаты реакций:
1. Количество иммунных комплексов в интактной сыворотке - 0,017.
2. Количество нативных иммунных комплексов в сыворотке опухоленосителя АКЭ - 0,026: на 34 % (в 1,5
раза) превышает контрольный уровень в СИ.
3. Количество ИК при реакции СО (АКЭ) + СУО (анти-АКЭ) - 0,048: в 2 раза (или на 84,6 %) превышает
исходный уровень нативных ИК в сыворотке опухоленосителя (серия 1).
4. Количество ИК при реакции СО (АКЭ) + СУО (анти-АГ 22а) - 0,039: в 1,5 раза (на 50 %) превышает исходный
уровень нативных иммунных комплексов в сыворотке опухоленосителя (серия 2).
5. Количество ИК при реакции СИ + СУО (анти-АКЭ) - 0,020 - превышает исходный уровень ИК в СИ на
17,6% (или в 1,1 раза) - серия 3.
6. Количество ИК при реакции СИ + СУО (анти-АГ 22а) - 0,021: превышает исходный уровень ИК в СИ
на 23,5% (или в 1,2 раза) - серия 4.
Выводы и заключения:
Вывод 1:
а). Количество ИК, образующихся при реакции СО (АКЭ) с СУО (анти-АКЭ) и СУО (анти-АГ 22а), в 2-5
раз превосходит количество ИК, образующихся при взаимодействии СИ с СУО (анти-АКЭ) и СУО (анти-АГ
22а).
б). Количество ИК, образующихся при реакции СО (АКЭ) с СУО (анти-АКЭ) и СУО (анти-АГ 22а) в 1,52 раза выше, по сравнению с количеством нативных ИК в сыворотке опухоленосителя: при реакции СО
(АКЭ) с гомологичной СУО (анти-АКЭ) превышение на 84,6%, при реакции СО (АКЭ) с негомологичной
СУО (анти-АГ 22а) - превышение на 50 %.
Заключение 1: повышенное количество в СО (АКЭ) нативных иммунных комплексов, по сравнению с интактным контролем, а также повышенное количество свободных опухолевых антигенов (указано в пунктах
«а» и «б») свидетельствует о наличии опухолевого роста в организме, у которого получена СО.
Вывод 2:
Количество ИК, образующихся при реакции СО (АКЭ) с гомологичной ей СУО (анти-АКЭ), в 2 раза
больше количества ИК, образующихся при реакции СО (АКЭ) с негомологичной ей СУО (анти-АГ 22а).
Заключение 2: в организме, у которого получена сыворотка (СО), происходит рост АКЭ, а не АГ 22а.
Пример 2. Определяем наличие опухолевого роста и типа опухоли (АГ 22а) у мышей-опухоленосителей.
Необходимые серии исследований:
1. Сыворотка опухоленосителя - СО (АГ 22а) + СУО (анти-АГ 22а).
2. Сыворотка опухоленосителя - СО (АГ 22а) + СУО (анти-АКЭ).
3. Сыворотка интактных мышей - СИ + СУО (анти-АГ 22а).
4. Сыворотка интактных мышей - СИ + СУО (анти-АКЭ).
Результаты исследования (реакций):
1. Количество ИК в интактной сыворотке - 0,017.
2. Количество нативных иммунных комплексов в сыворотке опухоленосителей АГ 22а - 0,030: на 76 % (в
1,8 раза) превышает контрольный (у СИ) уровень в ИК.
3. Количество ИК при реакции СО (АГ 22а) + СУО (анти-АГ 22а) - 0,058: в 2 раза (или на 93%) превышает
исходный уровень ИК в сыворотке опухоленосителей - СО (АГ 22а)- (серия 1).
4. Количество ИК при реакции СО (АГ 22а) + СУО (анти-АКЭ) - 0,040: в 1,3 раза (на 33 %) превышает
исходный уровень нативных иммунных комплексов в сыворотке опухоленосителя - СО (АГ 22а) -(серия 2).
5. Количество ИК при реакции СИ + СУО (анти-АГ 22а) - 0,021: превышает исходный уровень ИК в СИ
на 23,5 % (или в 1,2 раза) - серия 3.
6. Количество ИК при реакции СИ + СУО (анти-АКЭ) - 0,020: превышает исходный уровень ИК в СИ на
17,6% (или в 1,1 раза), серия 4.
Выводы и заключения:
Вывод 1:
а). Количество ИК, образующихся при реакции СО (АГ 22а) с СУО (анти-АГ 22а) и СУО (анти-АКЭ), в 24 раза превосходит количество ИК, образующихся при взаимодействии СИ с СУО (анти-АГ 22а) и СУО (анти-АКЭ).
4
BY 2489 C1
б). Количество ИК, образующихся при реакции СО (АГ 22а) с СУО (анти-АГ 22а) и СУО (анти-АКЭ) в 1,3-2
раза выше, по сравнению с количеством нативных ИК в сыворотке опухоленосителя - СО (АГ 22а); при реакции
СО (АГ 22а) с гомологичной СУО (анти-АГ 22а) превышение на 93 %, при реакции СО (АКЭ) с негомологичной
СУО (анти-АКЭ) - превышение на 33 %.
Заключение 1: повышенное количество в СО (АГ 22а) нативных ИК, по сравнению с интактным контролем, а также повышенное количество свободных опухолевых антигенов (указано в пунктах «а» и «б») свидетельствует о наличии опухолевого роста в организме, у которого получена СО.
Вывод 2:
Количество ИК, образующихся при реакции СО (АГ 22а) с гомологичной ей СУО (анти-АГ 22а) в 3 раза
больше количества ИК, образующихся при реакции СО (АГ 22а) с негомологичной ей СУО (анти-АКЭ).
Заключение 2: в организме, у которого получена СО, происходит рост АГ 22а, а не АКЭ.
Исследования, подтверждающие возможность осуществления изобретения (экспериментальные исследования)
выполнены в Институте генетики и цитологии АНБ.
Для разработки адаптированного к клинике метода иммунодиагностики опухолей в основу настоящего
исследования была положена идея использовать антитела (противоопухолевые изоантисыворотки) животных
(людей) с полностью хирургически удалённой опухолью для обнаружения в сыворотке опухоленосителей
компонента онкотолерогенной ассоциации факторов (10 - 12) - специфического для данной опухоли комплекса свободных антигенов. Возможность использования в клинических условиях противоопухолевых тестизоантисывороток (антител), полученных у больных после полного хирургического удаления растущей опухоли, в диагностических целях, если иметь набор таких сывороток против разного типа опухолей, не представляет большого труда и какой-либо опасности.
Для сравнения параллельно с этими опытами были проведены опыты по изучению образования иммунных комплексов (выявлению специфического для опухоли комплекса антигенов) при взаимодействии тех же
сывороток опухоленосителей с противоопухолевыми изоантисыворотками, полученными иммунизацией
мышей, убитыми облучением опухолевыми клетками.
Опыты проведены на мышах линии Af двухмесячного возраста, асцитной карциноме Эрлиха и асцитной
гепатоме 22а.
Получаем изоантисыворотку у мышей с удалённой опухолью. Для этого прививаем клетки АКЭ или АГ
22а под кожу подошвенной поверхности стопы задней лапки по 1 млн. опухолевых клеток на мышь. Когда
опухоль достигает размеров 9õ5õ5 мм, ступню лапки ампутируем с предварительным наложением лигатуры
на голень. На 13 и 21 дни после удаления опухоли у мышей получаем сыворотку. Определяем наличие в сыворотке нативных иммунных комплексов и наличие противоопухолевых антител (AT) по образованию ИК
при реакции сыворотки мышей с удалённой опухолью и экстрактом («опухолевый антиген» - специфический
для опухоли комплекс антигенов) из соответствующих опухолевых клеток 1:10 (центрифугирование 1 час
при 105 000 g). ИК определяем с помощью 3,5 % ПЭГ 6000.
В исследовании используем те сыворотки мышей с удалённой опухолью, в которых обнаружены противоопухолевые антитела. В случае асцитной карциномы Эрлиха таких образцов сывороток (содержащих противоопухолевые антитела) было 10 из 14, в случае асцитной гепатомы 22а -12 из 16.
Иммунные противоопухолевые сыворотки анти-АКЭ и анти-АГ 22а получаем иммунизацией мышей линии Af путём внутрибрюшинного введения по 6 млн. убитых облучением 12 000 Р клеток АКЭ или АГ 22а пятикратно с интервалом через 3 дня на 4-ый. Антисыворотку (кровь) получаем у мышей на 10 день после последней иммунизации.
Противоопухолевые антитела в ней определяем с помощью содержащего опухолевые антигены экстракта из опухолевых клеток по описанной методике.
Часть полученных сывороток мышей с удалённой опухолью (СУО), содержащих противоопухолевые антитела (АнтиСУО) и иммунных противоопухолевых сывороток, полученных иммунизацией убитыми опухолевыми клетками, подвергаем абсорбции соответствующими опухолевыми клетками-мишенями, против
которых в сыворотке имелись антитела.
Опухолевые клетки-мишени, используемые для абсорбции, обрабатываем 0,25 % раствором трипсина 30 мин
при комнатной температуре. После этого добавляем к смеси 0,1 - 0,2 мл мышиной сыворотки, перемешиваем.
Трипсин удаляем центрифугированием 5 мин при 1000 об/мин, клетки отмываем раствором Хенкса. Затем к антисыворотке добавляем трипсинизированные опухолевые клетки из расчёта 20 млн. опухолевых клеток на 1
мл сыворотки АнтиСУО. Суспензию перемешиваем, инкубируем час при 37 °С, затем клетки удаляем центрифугированием 5 мин при 1000 об/мин. Абсорбцию проводим дважды. Абсорбированную сыворотку используем в качестве контрольной при проведении реакций.
Прививаем мышам линии Af под кожу спины по 6 млн. клеток АКЭ или АГ 22а. Через 12 дней после
прививки опухолей у мышей получаем кровь из аксиллярного сосудистого сплетения (сыворотка опухоленосителя - СО). Определяем в ней количество нативных ИК путём осаждения их 3,5 % ПЭГ 6000. Вес опухолей
у мышей в это время составлял: АКЭ: 1,13 ± 0,09 г., АГ 22а - 1,25 ± 0,13 г.
5
BY 2489 C1
Для выявления специфического для опухоли комплекса антигенов в сыворотке опухоленосителей проводим иммунологические реакции между ними и сыворотками, содержащими противоопухолевые антитела (и
соответствующими контрольными сыворотками) АнтиСУО (АКЭ или АГ 22а) и АнтиС (АКЭ или АГ 22а).
Условные обозначения сывороток:
1. CO (АКЭ) - сыворотка мышей-носителей АКЭ.
2. СО (АГ 22а) - сыворотка мышей-носителей АГ 22а.
3. СУО (анти-АКЭ) - сыворотка мышей с удалённой АКЭ.
4. СУО (анти-АГ 22а) - сыворотка мышей с удалённой АГ 22а.
5. СУО (анти-АКЭ) абс. - сыворотка СУО (анти-АКЭ), абсорбированная клетками АКЭ.
6. СУО (анти-АГ 22а) абс. - сыворотка СУО (анти-АГ 22а), абсорбированная клетками АГ 22а.
7. С (анти-АКЭ) - сыворотка анти-АКЭ, полученная путём иммунизации мышей опухолевыми клетками,
убитыми облучением.
8. С (анти-АГ 22а) - сыворотка анти-АГ 22а, полученная путём иммунизации мышей опухолевыми клетками, убитыми облучением.
9. С (анти-АКЭ) абс. - сыворотка анти-АКЭ, абсорбированная клетками АКЭ.
10. С (анти-АГ 22а) абс. - сыворотка анти-АГ 22а, абсорбированная клетками АГ 22а.
11. С (инт) - сыворотка интактных мышей.
В проведенных исследованиях получены следующие результаты. Установлено, что количество нативных иммунных комплексов в исследуемых сыворотках (в ед. опт. пл., λ = 280 нм) : СУО (анти-АКЭ) - 0,050; СУО (анти-АГ 22а) 0,032; С (анти-АКЭ) - 0,040; С (анти-АГ 22а) - 0,030; СУО (анти-АКЭ) абс. - 0,048; СУО (анти-АГ 22а) абс. - 0,032; С (анти-АКЭ) абс. - 0.029; С (анти-АГ 22а) абс. - 0,026.
При реакции сыворотки мышей-носителей АКЭ - СО (АКЭ) - с сывороткой мышей с удалённой опухолью - СУО
(анти-АКЭ) прирост количества ИК составил 84,6 %, что приблизительно в 7 раз выше прироста количества иммунных комплексов, наблюдаемого при реакции между СО (АКЭ) и абсорбированной сывороткой - СУО (анти-АКЭ) абс.
(прирост количества ИК на 11,5%), табл.1.
Значительно меньший (в 2,5 раза) прирост количества иммунных комплексов наблюдается при взаимодействии сыворотки носителей АГ 22а с СУО (анти-АКЭ) (прирост на 33,3 %). Значительно более низкий прирост количества иммунных комплексов при взаимодействии сыворотки интактных мышей с СУО
(анти-АКЭ) (на 17,6 %), что практически соответствует количеству ИК, образующихся при взаимодействии сыворотки опухоленосителей с сывороткой СУО (анти-АКЭ) абс. При взаимодействии сыворотки
мышей с растущей АГ 22а с сывороткой мышей, у которых полностью удалена эта опухоль - СУО (антиАГ 22а) - происходит значительный, выраженный прирост количества образующихся ИК, на 93,3 %, что в
5 раз больше, чем количество ИК, образующихся при взаимодействии сыворотки мышейопухоленосителей СО (АГ 22а) с абсорбированной сывороткой мышей с удалённой опухолью (прирост
ИК на 20%) и сыворотки интактных мышей с СУО (анти-АГ 22а) - прирост на 23,5 %, табл.2.
При реакции СО (АКЭ) с сывороткой мышей с удалённой АГ 22а - СУО (анти-АГ 22а) - отмечен также
прирост количества ИК на 50 %, но он в 1,9 раза ниже, чем прирост при взаимодействии сыворотки мышей-носителей АГ 22а с сывороткой мышей с полностью удалённой АГ 22а.
Таким образом, указанные эксперименты показывают, что сыворотки мышей-опухоленосителей реагируют иммунологически с сыворотками мышей, у которых полностью хирургически удалена растущая
опухоль, при этом образуется количество иммунных комплексов значительно, в 5-7 раз превышающее
фоновый (контрольный) уровень образующихся иммунных комплексов. В перекрёстных реакциях между
сыворотками опухоленосителей генотипически различных опухолей и негомологичными им сыворотками
мышей с полностью удалённой опухолью также образуется значительное количество иммунных комплексов, но оно в 2- 2,5 раза меньше, чем количество иммунных комплексов, образующихся при взаимодействии (реагировании) гомологичных сывороток мышей-опухоленосителей и сывороток мышей с удалённой
опухолью.
Эти данные показывают, как и полученные нами ранее с противоопухолевыми антисыворотками, что
используемые опухоли имеют общие антигены в своём специфическом антигенном наборе и различные
антигены. Это свидетельствует о том, что, имея набор гомологичных сывороткам опухоленосителей сывороток индивидуумов с удалённой опухолью, можно обнаружить и отдифференцировать любую опухоль
и установить наличие опухолевого роста в любом его периоде.
Проведенные параллельные исследования с использованием противоопухолевых антисывороток антиАКЭ и анти-АГ 22а, полученных иммунизацией мышей убитыми облучением опухолевыми клетками, показали полную идентичность эффекта этих иммунных сывороток и сывороток, полученных у мышей после полного хирургического удаления у них опухоли, при их взаимодействии с сыворотками
опухоленосителей, идентичность по их способности выявлять в сыворотке опухоленосителей специфический для опухоли комплекс присутствующих в ней свободных опухолевых антигенов.
6
BY 2489 C1
Из табл. 3 видно, что при реагировании сыворотки мышей-носителей АКЭ - СО (АКЭ) - с гомологичной
антисывороткой - С (анти-АКЭ) - количество образующихся при этом иммунных комплексов увеличивается
на 76,9 %, что в 5 раз выше количества ИК, образующихся при взаимодействии СО (АКЭ) с абсорбированной иммунной сывороткой (прирост ИК на 15,4 %) и в 7 раз выше количества ИК, образующихся при взаимодействии иммунной противоопухолевой сыворотки с интактной (прирост ИК на 11,8 %).
Аналогичные результаты получаем при взаимодействии сыворотки мышей-носителей АГ 22а - СО (АГ
22а) - с иммунной сывороткой С (анти-АГ 22а). При этом количество ИК увеличивается на 63,3 %, что в 5
раз выше количества ИК, образующихся при взаимодействии СО (АГ 22а) с С (анти-АГ 22а) абс. (прирост
ИК на 13,3%), и в 2 раза выше количества ИК, образующихся при взаимодействии интактной сыворотки с
иммунной С (анти-АГ 22а) - прирост на 35,3 %, табл. 4.
Прирост количества иммунных комплексов (преципитатов) при взаимодействии иммунных сывороток
и содержащих противоопухолевые антитела сывороток мышей с полностью удалённой опухолью с интактными сыворотками обусловлен наличием в интактных сыворотках комплемента, присутствие которого и взаимодействие с ИК, имеющимися в используемых тест-сыворотках, способствует образованию
молекулярных агрегатов, которые при добавлении 3,5 % ПЭГ обусловливают образование повышенного
количества ПЭГ-преципитатов, что не имеет отношения к специфической иммунологической реакции
между опухолевыми антигенами и противоопухолевыми антителами.
Таким образом, указанными исследованиями убедительно показана возможность с помощью противоопухолевых антител набора изологичных антисывороток мышей (больных) с полностью хирургически удалённой опухолью (а не полученных иммунизацией введением убитых опухолевых клеток, которая в
клинических условиях неприемлема) на любом этапе роста опухоли установить присутствие в сыворотке
опухоленосителей специфического для данной опухоли комплекса свободных опухолевых антигенов и тем
самым установить как наличие (или отсутствие) опухолевого роста на любом его этапе, так и отдифференцировать любую опухоль при наличии набора антисывороток животных (больных) с полностью хирургически удалёнными различными по гистогенезу (морфологии) опухолями.
Таблица 1
Количество в сыворотке опухоленосителей специфического для опухоли комплекса (СОК) антигенов,
выявляемых реакций с СУО (анти-АКЭ)
Серия опыта
1. СО (АКЭ)
2. СО (АКЭ) + СУО (анти-АКЭ)
3. СО (АКЭ) + СУО (анти-АКЭ) абс.
4. СО (АГ 22а)
5. СО (АГ 22а) + СУО (анти-АКЭ)
6. С (инт.)
7. С (инт.) + СУО (анти-АКЭ)
Количество
животных
Количество СОК антигенов (количество
ИК после реакции без
нативных ИК в СУО
(анти-АКЭ) и СУО (анти-АКЭ) абс.
13
13
13
10
10
15
15
0,026±0,001
0,048±0,001
0,029±0,001
0,030±0,001
0,040±0,001
0,017±0,001
0,020±0,001
7
% превышения над
количеством нативных ИК в сыворотке исследуемых мышей (опухоленосителей или
интактных)
84,6
11,5
33,3
17,6
P
1-2<0,001
1-3<0,05
2-3<0,001
4-5<0,001
6-7<0,05
BY 2489 C1
Таблица 2
Количество в сыворотке опухоленосителей специфического для опухоли комплекса (СОК) антигенов,
выявляемых реакций с СУО (анти-АГ 22а)
Количество
животных
Серия опыта
1. СО (АГ 22а)
2. СО (АГ 22а) + СУО (анти-АГ 22а)
3. СО (АГ 22а) + СУО (анти- АГ 22а) абс.
4. СО (АКЭ)
5. СО (АКЭ) + СУО (анти- АГ 22а)
6. С (инт.)
7. С (инт.) + СУО (анти- АГ 22а)
Количество СОК антигенов (коли-чество
ИК после реакции без
нативных ИК в СУО (анти-АГ 22а) и СУО (антиАГ 22а) абс.
10
10
10
13
13
15
15
0,030±0,001
0,058±0,001
0,036±0,001
0,026±0,001
0,039±0,001
0,017±0,001
0,021±0,001
% превышения
над количеством
нативных ИК в
сыворотке исследуемых мышей
(опухоленосителей или интактных)
93,3
20,0
50,0
23,5
P
1-2<0,001
1-3<0,01
2-3<0,001
4-5<0,001
6-7<0,05
Таблица3
Количество в сыворотке опухоленосителей специфического для опухоли комплекса (СОК) антигенов,
выявляемых реакций с С (анти-АКЭ)
Серия опыта
1. СО (АКЭ)
2. СО (АКЭ) + С (анти-АКЭ)
3. СО (АКЭ) + С (анти-АКЭ) абс.
4. С (инт.)
5. С (инт.) + С (анти-АКЭ)
Количество
животных
13
13
13
15
15
Количество СОК антигенов (количество ИК
после реакции без нативных ИК в С (антиАКЭ) и С (анти-АКЭ)
абс.
0,026±0,001
0,046±0,002
0,030±0,001
0,017±0,001
0,019±0,001
% превышения над
количеством нативных
ИК в сыворотке исследуемых мышей (опухоленосителей или
интактных)
76,9
15,4
11,8
P
1-2<0,001
1-3<0,05
2-3<0,001
4-5<0,1
Табл.4
Количество в сыворотке опухоленосителей специфического для опухоли комплекса (СОК) антигенов,
выявляемых реакций с С (анти-АГ 22а)
Серия опыта
1. СО (АГ 22а)
2. СО (АГ 22а) + С (анти-АГ 22а)
3. СО (АГ 22а) + С (анти- АГ 22а) абс.
4. С (инт.)
5. С (инт.) + СУО (анти- АГ 22а)
Количество
животных
10
10
10
15
15
Количество СОК антигенов (количество ИК
после реакции без нативных ИК в С (анти-АГ
22а) и С (анти-АГ 22а)
абс.
0,030±0,001
0,049±0,002
0,034±0,001
0,017±0,001
0,023±0,001
Cоставитель А.И. Сорокин
Редактор В.Н. Позняк
Корректор Т.Н. Никитина
Государственный патентный комитет Республики Беларусь.
220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66.
8
% превышения над количеством нативных ИК
в сыворотке исследуемых мышей (опухоленосителей или
интактных)
63,3
13,3
35,3
P
1-2<0,001
1-3<0,02
2-3<0,001
4-5<0,001
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
208 Кб
Теги
by2489, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа