close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY2890

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(19)
BY (11) 2890
(13)
C1
6
(51) G 01N 33/566
(12)
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ
КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ
(54)
СПОСОБ ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ
(21) Номер заявки: 960208
(22) 1996.04.26
(46) 1999.06.30
(71) Заявитель: Белорусский
научно-исследовательский институт радиационной медицины
МЗ РБ (BY)
(72) Авторы: Доценко Э.А., Новиков Д.К.,
Доценко М.Л., Жаворонок С.В. (BY)
(73) Патентообладатель: Белорусский
научноисследовательский институт радиационной
медицины МЗ РБ (BY)
(57)
Способ оценки состояния иммунной системы, включающий определение количества лимфоцитов, несущих специфические рецепторы к субстрату в реакции розеткообразования с частицами покрытыми субстратом, отличающийся тем, что лейкоциты периферической крови инкубируют с частицами, нагруженными
рекомбинантным интерлейкином 2 и при получении значения розеткообразующих лимфоцитов среди общего
их пула более 15%, определяют активацию иммунной системы, а при значении 5% и менее - угнетение функции
иммунной системы.
(56)
1. Новиков Д.К., Новикова В.И. Клеточные методы иммунодиагностики. Мн.: Беларусь, 1979, С. 50-57.
2. Хаитов Р.М. с соавт. Экологическая иммунология. - М., 1995.
3. Armitage R.J., Cawley J.C. Normal and certain leukaemic В cells express IL2 receptors without in vitro activation // Clin. Exp. lmmunol. - 1986. - Vol. 63. - № 2. - P. 298-302.
4. Herrman Т., Ahmed J.S., Diamanstein T. The intermediate-affinity interleukin (IL)2 receptor expressed on
Theileria annulata-infected cells comprises a single IL2-binding protein. Partial characterization of bovine IL2 receptors//Eur. J. lmmunol. - 1989. - Vol. 19. - P. 1339-1342.
Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано при оценке
иммунного статуса человека.
К числу показателей иммунного статуса относят количество лимфоцитов периферической крови, несущих на своей поверхности те или иные субстратсвязывающие структуры (антигены, рецепторы и др.) к некоторым биологическим веществам. В частности, важной характеристикой является уровень активированных
лимфоцитов, т.е. экспрессирующих рецепторы к инсулину, к интерлейкину 2 (ИЛ2), HLA-DR-антигены и др.
[1]. Для определения специфических структур на поверхности клеток используют субстраты, меченые изотопом [4], флюоресцентным зондом, ферментом или частицами [1, 2, 3]. Так, описан способ [1], при котором используется субстрат, связанный с частицами: лимфоциты, несущие рецепторы к С3 компоненту комплемента определяют методом розеткообразования с эритроцитами, покрытыми специфическим субстратом
- С3 компонентом комплемента [4].
Наиболее близким решением, выбранным в качестве прототипа, является способ, при котором используют субстрат (рекомбинантный ИЛ2, рИЛ2), меченый изотопом (I125) с последующей оценкой связывания радиомеченного субстрата (рИЛ2) с клетками [4].
Описанный способ имеет следующие недостатки:
1) необходимы дорогостоящее оборудование (гамма-счетчик), реагенты и соответствующая лаборатория,
1
BY 2890 C1
высококвалифицированный персонал, поэтому способ не применим в рутинной клинико-лабораторной практике;
2) использование радиоактивных изотопов небезопасно и приводит к загрязнению окружающей среды;
3) короткое время жизни (нестабильность) меченого изотопом субстрата;
Общими с прототипом признаками являются:
1) объект исследования - лимфоциты периферической крови;
2) принцип метода, основанный на специфическом связывании субстрата с рецептором;
3) использование меченых реагентов.
Задачей изобретения является упрощение техники проведения реакции и снижение ее стоимости. Поставленная задача достигается следующим образом.
Заявляемый способ основан на взаимодействии меченого корпускулами субстрата (рИЛ2) с рецепторами
к интерлейкину 2.
Для этого венозную кровь с антикоагулянтом (гепарин - 20 Ед/мл) отстаивают при 37 °С, плазму со взвешенными лейкоцитами центрифугируют (150g) в течение 5 минут. Супернатант отбрасывают, а осадок промывают 2,0 мл забуференного физиологического раствора (рН7,4) при прежних условиях дважды и оценивают способность к розеткообразованию с частицами, несущими рИЛ2. Диагностикум для определения
лимфоцитов, несущих рецепторы к интерлейкину 2 готовят следующим образом: эритроциты быка тщательно отмывают забуференным физиологическим раствором до исчезновения в супернатанте следов белка.
1 мл эритроцитов, упакованных центрифугированием (1000 об/мин., 15 мин.), смешивают с 2,5 % раствором
глютарового альдегида в общем объеме 20 мл. Инкубируют 24 часа при 4 °С с периодическим встряхиванием и отмывают от глютарового альдегида. Препарат рИЛ2 разводят в 1,0 мл дистиллированной воды и добавляют к осадку эритроцитов, после чего ресуспендируют и инкубируют 24 часа на холоду. Непрореагировавшие альдегидные группировки блокируют 0,1 % раствором человеческого сывороточного альбумина.
Хранят в осажденном состоянии в присутствии 0,1 % азида натрия; срок хранения препарата без потери активности - 6 месяцев.
Число лимфоцитов в лейкосуспензии доводят до концентрации 2-3·106 /мл; диагностикум - до 50-75·106
частиц/мл. В лунку планшеты для иммунологических исследований вносят по 100 мкл взвеси клеток и диагностикума, инкубируют 30 мин. при 37 °С, после чего центрифугируют при 150g. Супернатант удаляют,
осадок ресуспендируют в 50 мкл 0,05 % раствора глютарового альдегида. После высушивания и фиксации
мазка этиловым спиртом, его прокрашивают азур-эозином. Используя увеличение 7х90 и масляную иммерсию, оценивают процент розеткообразующих клеток на 200 лимфоцитов.
Пример 1. Больной Ж., 25 лет. Клинический диагноз: хронический обструктивный бронхит, фаза обострения ДН1.
20 мл венозной крови с гепарином (20 Ед/мл) отстаивают при 37 °С, плазму со взвешенными лейкоцитами центрифугируют при 150g в течение 5 минут. Супернатант отбрасывают, осадок клеток промывают 2,0
мл забуференного физиологического раствора при прежних условиях дважды. Осадок разводят в 1,0 мл забуференного физиологического раствора (число лимфоцитов 3·106 /мл); диагностикум для определения
лимфоцитов, несущих рецепторы к интерлейкину 2 - приготовленный как описано выше - разводят до 75·106
частиц/мл. В лунку планшеты для иммунологических исследований вносят по 100 мкл лейковзвеси и диагностикума, инкубируют 30 мин. при 37 °С, после чего центрифугируют при 150g. Супернатант удаляют, осадок
ресуспендируют в 50 мкл 0,05 % раствора глютарового альдегида. После высушивания и фиксации мазка
этиловым спиртом, его прокрашивают азур-эозином. Используя увеличение 7х90 и масляную иммерсию,
оценивают процент розеткообразующих клеток на 200 лимфоцитов: он составил 25 %, из чего выносят суждение об активации иммунной системы.
Пример 2. Больной М., 35 лет. Клинический диагноз: хронический остеомиелит.
20 мл венозной крови с гепарином (20 Ед/мл) отстаивают при 37 °С, плазму со взвешенными лейкоцитами центрифугируют при 150g в течение 5 минут. Супернатант отбрасывают, осадок клеток промывают 2,0
мл забуференного физиологического раствора при прежних условиях дважды. Осадок разводят в 1,0 мл забуференного физиологического раствора (число лимфоцитов 2·106 /мл); диагностикум для определения
лимфоцитов, несущих рецепторы к интерлейкину 2 - приготовленный как описано выше - разводят до 50·106
частиц/мл. В лунку планшеты для иммунологических исследований вносят по 100 мкл лейковзвеси и диагностикума, инкубируют 30 мин. при 37 °С, после чего центрифугируют при 150g. Супернатант удаляют, осадок
ресуспендируют в 50 мкл 0,05 % раствора глютарового альдегида. После высушивания и фиксации мазка
этиловым спиртом, его прокрашивают азур-эозином. Используя увеличение 7х90 и масляную иммерсию,
оценивают процент розеткообразующих клеток на 200 лимфоцитов: он составил 5 %, из чего выносят суждение об угнетении иммунной системы.
Таким образом, предложенный способ позволяет оценивать состояние иммунной системы. Его преимущества перед традиционными:
2
BY 2890 C1
1) упрощение техники выполнения реакции и, вследствие этого, ее доступность, что позволяет применять
данный метод в качестве иммунных тестов 1 уровня;
2) не используются радиоактивные изотопы;
3) простота метода позволяет использовать его в качестве скринингового, при контроле эффективности
иммуномодулирующей терапии.
Государственный патентный комитет Республики Беларусь.
220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66.
3
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
1
Размер файла
121 Кб
Теги
by2890, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа