close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY3042

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(19)
BY (11) 3042
(13)
C1
6
(51) G 01N 33/48
(12)
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ
КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ
(54)
СПОСОБ ИНДИКАЦИИ НАСЛЕДСТВЕННОГО КЛЕТОЧНОЛЕТАЛЬНОГО ЭФФЕКТА НЕКОНТРОЛИРУЕМОГО ХРОНИЧЕСКОГО
ОБЛУЧЕНИЯ ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА
(21) Номер заявки: 960427
(22) 1996.08.16
(46) 1999.09.30
(71) Заявитель: Институт генетики и цитологии НАН
Беларуси (BY)
(72) Авторы: Михалевич Л.С., Перепецкая Г.А. (BY)
(73) Патентообладатель: Институт
генетики
и
цитологии НАН Беларуси (BY)
(57)
Способ индикации наследственного клеточно-летального эффекта неконтролируемого хронического облучения in vivo лимфоцитов периферической крови человека, включающий забор крови, культивирование
лимфоцитов в питательной среде, содержащей фитогемагглютинин, добавление блокатора деления цитоплазмы - цитохолазина В, витальное окрашивание и микроскопирование, отличающийся тем, что определяют частоту репродуктивно погибших и выживших потомков хронически облученных in vivo лимфоцитов и
при наличии статистически достоверной разницы между контрольными и опытными показателями судят о
наследственном клеточно-летальном эффекте неконтролируемого хронического облучения лимфоцитов.
(56)
1. T.Nomura, V.Kinuta, T.Hongyo, H.Nakajima, T.Hatanaka. Programmed Cell Death in Whole Body & Organ
Systems by Low Dose Radiation//Radiat. Res.-1992.-33: Supplement. -P. 109-123.
2. H.I.Hinkley, A.G.Bosanquet. The in vitro radiosensitivity of lymphocytesfrom chronic lymphocytic leukaemia
using the differential staining sytotoxicity (DISC) assay. 1. Investigation of the method// Int. J.Radiat.Biol.-1992.-61.
- № 1. P. 103-110.
3. A.G.Bosanquet, H.I.Hinkley. Profound differences in the radiosensitivity of lymphocytes from patients with
chronic lymphocytic leukaemia found by DISCassay: Abstr. sci. presentat. Meet Assoc. Radiat. Res., Cardiff, UK,
16-18 Apr.//Int. J.Radiat.Biol. -1991. -60. -№ 6.- Р.947.
4. M.Fenech. The cytokinesis-block micronucleus technique: A detailed description of the method & its application to genotoxicity studies in human populations//Mut.Res..- 1993. - 285.-P. 35-44.
5. D.A.Hungerford. Leukocytes cultured from small inocula of whole blood & the preparation of metaphase
chromosomes by treatment with hypotonic KCl// Stain. Techn. - 1965. - V. 40. - Р. 333-338.
Изобретение относится к области биологии и медицины и может быть использовано для индикации наследственного клеточно-летального эффекта неконтролируемого хронического облучения in vivo лимфоцитов периферической крови человека.
Аналогом данного способа исследования является способ, предназначенный для учета интерфазной гибели клеток тимуса, селезенки и кишечника мышей при действии низких доз радиации [1], основанный на том,
что 0,02 % раствор эритрозина Б инкорпорируется в мертвые клетки и окрашивает их в красный цвет. Учет
эритрозин Б положительных клеток производится путем подсчета их с помощью микроскопа.
В работах других авторов [2, 3] при использовании способа дифференциального окрашивания (DISC)
была исследована in vitro радиочувствительность лимфоцитов от больных хроническим лимфоцитарным
лейкозом. Выделенные лимфоциты периферической крови этих больных облучали, инкубировали в течение
4 суток, а затем способом дифференциальной окраски живых и мертвых клеток определяли гибель клеток.
BY 3042 C1
Результаты характеризовались воспроизводимостью как при повторных исследованиях одного образца, так и
при исследовании различных образцов от одного больного.
Прототипом данного изобретения может быть способ, предложенный M.Fenech для проведения цитогенетического мониторинга популяций человека [4].
Указанный способ состоит в том, что использовали кровь здоровых доноров, полученную стерильно методом венопункции. После выделения лимфоцитов в градиенте фикол-верографина их витально окрашивали
трипановым синим и автоматически подсчитывали количество жизнеспособных лимфоцитов, после чего их
использовали для культивирования. Индивидуальная культура, содержащая 1 млн. лимфоцитов на 1 мл питательной среды, включающей 15 % объема инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, ФГА
фирмы «Wellcome» в концентрации 5 мг/мл, инкубировалась при температуре 37 °С в течение 44 часов в атмосфере 10 % двуокиси углерода. Затем в культуру вводили цитохалазин Б в концентрации 4,5 мг/мл культуральной смеси. Фиксацию культуры производили на 72 часу от начала культивирования абсолютным метанолом в течение 10 минут. Готовили по 2 препарата на культуру и окрашивали по Май-Грюнвальд Гимзой
для оценки интерфазно погибших лимфоцитов.
Однако данный способ не может быть использован в таком виде, так как он имеет ряд существенных недостатков.
1. Для проведения анализа с помощью описанного способа требуется, как минимум, 10 мл венозной крови. Столь большие объемы крови для данного анализа можно получить только с помощью достаточно болезненного для детей метода венопункции.
2. С помощью указанного способа может быть проведена только оценка интерфазной гибели лимфоцитов, т.е. жизнеспособности выделенных лимфоцитов до их культивирования.
3. Используемый способ не дает ответа на вопрос о том, как действует радиационный фактор на пролиферативные возможности клеток крови человека.
Задача, на решение которой направлено изобретение, состоит в том, что для проведения лечебных и профилактических мероприятий по раннему выявлению признаков хронического радиационного воздействия
введено: исследование частоты
а) репродуктивно погибших и
б) выживших потомков хронически облученных in vivo лимфоцитов.
Поставленная цель достигается тем, что в способе индикации наследственного клеточно-летального эффекта неконтролируемого хронического облучения in vivo лимфоцитов человека, включающем забор крови,
культивирование лимфоцитов в питательной среде, содержащей фитогемагглютинин, добавление блокатора
деления цитоплазмы - цитохалазина Б, витальное окрашивание и микроскопирование, определяют частоту
репродуктивно погибших и выживших потомков хронически облученных in vivo лимфоцитов и при наличии
статистически достоверной разницы между контрольными и опытными показателями судят о наследственном клеточно-летальном эффекте неконтролируемого хронического облучения лимфоцитов.
Оценка пролиферативной гибели лимфоцитов периферической крови детей г. Калинковичи Гомельской
области представлена в табл. 1.
Оценка пролиферативной гибели лимфоцитов периферической крови детей и взрослых г. Минска представлена в табл. 2.
Способ реализован следующим образом.
Объектом исследования являлась культура лимфоцитов периферической крови 20 детей г. Калинковичи
Гомельской области (уровень загрязнения по Cs-137 5Ки/км2), а также контрольной группы детей и взрослых
г. Минска.
2
BY 3042 C1
Таблица 1
Оценка пролиферативной гибели лимфоцитов периферической крови детей
г. Калинковичи Гомельской области
№ п/п
Всего
1
200
2
200
3
200
4
200
5
200
6
200
7
200
8
200
9
200
10
200
11
200
12
200
13
200
14
200
15
200
16
200
17
200
18
200
19
200
20
200
Суммарные данные
4000
Количество проанализированных клеток
% клеток
М С+
М Cживых
погибших
42
158
79,0
21,0
39
161
80,5
19,5
49
151
75,5
24,5
37
163
81,5
18,5
54
146
73,0
27,0
35
165
82,5
17,5
48
152
76,0
24,0
31
169
84,5
15,5
45
155
77,5
22,5
37
163
81,5
18,5
41
159
79,5
20,5
52
148
74,0
26,0
49
151
75,5
24,5
37
163
81,5
18,5
34
166
83,0
17,0
28
172
86,0
14,0
51
149
74,5
25,5
45
155
77,5
22,5
39
161
80,5
19,5
48
152
76,0
24,0
841
3159
79,0 ± 0,6
21,0 ± 0,6
Таблица 2
Оценка пролиферативной гибели лимфоцитов периферической крови
детей и взрослых г. Минска
N п/п
Всего
1
2
3
4
5
6
Суммарные данные
200
200
200
200
200
200
Дети
10
7
12
5
8
25
190
193
188
195
192
175
95,0
96,5
94,0
97,5
96,0
87,5
5,0
3,5
6,0
2,5
4,0
12,5
1133
94,4 ± 0,7
5,6 ± 0,7
200
200
200
200
67
Взрослые
7
11
9
15
193
189
191
185
96,5
94,5
95,5
92,5
3,5
5,5
4,5
7,5
800
42
758
94,7 ± 0,8
5,3 ± 0,8
1200
1
2
3
4
Суммарные данные
Количество проанализированных клеток
% клеток
М С+
М Сживых
погибших
Для постановки культуры использовалась цельная кровь, полученная из пальца или методом венопункции. Порции крови в стерильных флаконах с гепарином доставляли к месту постановки эксперимента - в
стационарный бокс, работу в котором вели с соблюдением всех правил асептики. Культивирование проводили с использованием модифицированного полумикрометода [5].
3
BY 3042 C1
Удобство метода заключается в том, что для культивирования требуется небольшое, до 0,5 мл, количество цельной крови, которое может быть получено не только методом венопункции, но и из пальца.
Лимфоциты культивировали в течение 72 часов в 15 % питательной среде, состоящей из среды RPMI
1640 фирмы «Вектор-Новосибирск», эмбриональной телячьей сыворотки, 0,2 % фитогемагглютинина Р
фирмы "Difco". На 44 часу роста в культуру добавляли блокатор деления цитоплазмы - цитохалазин Б в концентрации 3 мкг/мл. На 72-96 часу от начала культивирования к 0,3 мл культуральной смеси, необходимой
для проведения анализа пролиферативной гибели культуры, добавляли 0,5 мл сыворотки для предотвращения агрегации клеток, осторожно ресуспендировали культуру, добавляли 3-5 капель метиленового синего индикатора погибших клеток. Через 30 минут окрашенную суспензию клеток наносили на предметное стекло и подсчитывали число метилен-положительных (Мс+) клеток на 100-200 полинуклеарных лимфоцитов,
которые легко визуализировались под световым микроскопом с увеличением 20⋅16,5. Число погибших и
выживших лимфоцитов выражали как процент (%) Мс+ (Мс-) клеток к общему количеству проанализированных клеток.
Данные таблиц 1 и 2 свидетельствуют о том, что использование предложенной модификации выявляет
высоко достоверные различия уровня репродуктивной гибели клеток у детей г. Калинковичи и контрольных групп г. Минска.
Индивидуальное обследование показало статистически значимое повышение исследуемых показателей в
опытных образцах по сравнению с контрольными (примерно в 4-5 раз). Количество репродуктивно погибших клеток у детей г. Калинковичи варьировало от 14,0 до 27,0 % среди лимфоцитов, претерпевших несколько делений, тогда как в контрольных группах у детей и взрослых эти показатели изменялись от 2,5 до
12,5 %.
Анализ среднегрупповых показателей репродуктивной гибели лимфоцитов детей из опытной и двух контрольных групп также подтвердил это заключение: 21,0 ± 0,6 % у детей г. Калинковичи, 5,6 ± 0,7 и 5,3 ± 0,8
у детей и взрослых г.Минска. Следует отметить, что выбранные нами контрольные группы являются условно-контрольными, так как радиационно-экологическая обстановка в Минске также изменилась после катастрофы на ЧАЭС.
Таким образом, полученные данные позволяют сделать заключение о том, что:
1. Результаты обследования детей, подвергающихся длительному неконтролируемому многокомпонентному радиационному воздействию разной интенсивности и продолжительности в районах выпадения радиоактивных осадков, показали высокую эффективность индивидуальной и популяционной биоиндикации облучения по частоте репродуктивной гибели лимфоцитов периферической крови.
2. Использование метиленового синего (МС) позволило провести точный количественный учет живых
(МС-) и погибающих или погибших (МС+) клеток, которые претерпели несколько делений в условиях цитокинетического блока в культуре лимфоцитов периферической крови.
3. Наличие погибших лимфоцитов, находящихся в I, II, III и более клеточных циклах, показало, что после
хронического облучения могут погибать не только непосредственно облученные клетки, но и их потомки.
Использование данного способа позволит:
1. Ускорить выявление выживших при культивировании потомков хронически облучаемых in vivo лимфоцитов периферической крови человека.
2. Сократить время на выявление отдаленного эффекта действия хронического облучения in vivo на потомство облученных клеток.
3. Оценить косвенно пролиферативные возможности стволовых кроветворных клеток.
4. Проводить профилактику с целью выявления радиационных поражений организма.
Государственный патентный комитет Республики Беларусь.
220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66
4
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
162 Кб
Теги
by3042, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа