close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY3137

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(19)
BY (11) 3137
(13)
C1
6
(51) A 61K 37/02,
(12)
A 61K 38/55
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ
КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ
(54)
СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ РЕТРОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ
(21) Номер заявки: 950399
(22) 1995.04.07
(86) РСТ/ US 93/08486, 1993.09.09
(31) 07/943.369
(32) 1992.09.09
(33) US
(46) 1999.12.30
(71) Заявитель: АМГЕН БУЛДЕР Инк., СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ, МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ (US)
(72) Авторы: Стефан Эйзенберг, Шарон М. Вахл,
Роберт С. Томпсон (US)
(73) Патентообладатель: АМГЕН
БУЛДЕР
Инк.,
СОЕДИНЕННЫЕ
ШТАТЫ
АМЕРИКИ,
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ (US)
(57)
Способ ингибирования ретровирусной инфекции, вызванной вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ),
включающий введение пациенту ингибитора сериновой протеазы лейкоцитов (СЛПИ) или его производного
в количестве, достаточном для блокирования инфекции, отличающийся тем, что производное СЛПИ выбирают из группы, состоящей из СЛПИ Phe 72 мутеина, СЛПИ Gly 20 мутеина, СЛПИ Gly 72 мутеина, СЛПИ
Val 72 мутеина, СЛПИ Phe 25 мутеина, СЛПИ Gly 25 мутеина, СЛПИ Val 25 мутеина.
(56)
1.WO 86/03519, MKИ4 C 12Р21/00,1986.
2. ЕР 0 384 559, МКИ5 A 61K 37/64, 1990.
3. WO 91/02540, МКИ5 A 61K 37/64, С 12Q 1/37, С 12N 9/50, С 07K 15/28, 1991 (прототип).
Фиг. 1
Изобретение относится к области лечения ретровирусных инфекций, более конкретно, к лечению инфекции вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) и сопутствующего заболевания, включающего синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД).
BY 3137 C1
Ретровирусные агенты причастны к ряду заболеваний, включая рак, аутоиммунное заболевание и СПИД.
Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) вызывает хроническое прогрессирующее исчезновение СД4+ Т
лимфоцитов (СД4+ клеток) и инфекцию макрофагов, приводя в результате к синдрому приобретенного иммунодефицита. Общераспространенный зидовудин (АЗТ), аналог тимидина является основным противовирусным лекарством, используемым при лечении инфекции ВИЧ, хотя используют также два других агента с
подобным механизмом действия — дидэзоксиинозин (ддИ) и дидэзоксицитозин (ддЦ). [Colley Т.Р. et. al.
New Engl. J. Med. (1990) 322:1340-45; Fisch M.A. et. al. New Engl. J. Med. (1987) 317:185-91]. Эти агенты являются эффективными при ингибировании вирусной репликации и могут стабилизировать уровни СД4+ клеток, но они не пригодны для уничтожения одного из основных вирусных образований — макрофагов, инфицированных ВИЧ. [Gartner S. et. al. Science (1986) 233:215-19]. Высокую токсичность, особенно при ВИЧ
костного мозга хозяина, связывают также с повышенными дозами АЗТ при лечении и уменьшением благотворного влияния лекарства после продолжительной терапии у пациентов, страдающих СПИД; у пациентов,
подвергнутых лечению, наблюдали также ВИЧ штаммы, резистентные к АЗТ. Эти находки побудили к поиску альтернативных лекарств для лечения инфекции ВИЧ, в частности агентов, отличающихся механизмом
действия.
Вирус иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1), ретровирус, является этиологичной причиной СПИД.
Гликопротеиновая оболочка ВИЧ-1, gp120, специфично связывается с СД4 рецептором на Т лимфоцитах и
на моноцитах и макрофагах. Хотя инфекция Т лимфоцитов требует клеточной пролифирации и синтеза ДНК,
продуктивное заражение моноцитов может иметь место независимо от синтеза клеточной ДНК [Weinberg,
J.B. et. а1. (1991) J. Exp. Med. 174:1477-82]. Если ВИЧ-1 заражает активированные СД4+ лимфоциты, это является летальным, но зараженные моноциты являются относительно резистентными к разрушению вирусом.
Следовательно, эти клетки, однажды зараженные ВИЧ-1, служат в качестве долгоживущих резервуаров вируса. Но не только эти клетки являются источником репликации вируса, но их дисфункция, возникающая за
счет вируса, может вносить вклад в повышенную восприимчивость к условно-патогенным инфекциям, которые являются признаком СПИД.
Так как моноцит-макрофаги служат в качестве резервуаров для ВИЧ-1, введение селективной метки в эту
популяцию, дополнительно к Т лимфоцитам, заслуживает дальнейшего рассмотрения [Finberg, R.W. et. а1.
Science 252:1703-05, 1991]. Ранние сообщения группы Fox [JADA 118:709-711, 1989] указывают, что компонент слюны человека блокирует репликацию ВИЧ. Недавно Hattori [FEBS Lett. 248:48-52, 1989] показал, что
ингибитор триптазы (трипсин-подобного фермента) может ингибировать образование синцитий Т-клеток,
индуцируемое ВИЧ.
При исследовании различных потенциальных модуляторов инфекции ВИЧ-1 авторы идентифицировали
эндогенный источник ингибирующей активности, который замедляет инфицирование и/или репликацию
ВИЧ-1.
Фактором, ответственным за противовирусную активность, является сериновый ингибитор протеазы лейкоцитов (СЛПИ). СЛПИ является сильнодействующим ингибитором эластазы лейкоцита человека и катепсина G и трипсина человека и был выделен из паротидных секреций [Thompson, R.C. and К. Ohlsson, (1986)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:6692-96; и US патент № 4760130]. СЛПИ является теперь доступным за счет
получения с помощью рекомбинантной ДНК [US патентная заявка № 07/712354, поданная 7 июня 1991 и заявка РСТ - публикация WO 86/03519, поданная 4 декабря 1985].
Способность СЛПИ и/или его производных и аналогов блокировать инфицирование и/или репликацию
ВИЧ-1 может обеспечить основание для терапевтического воздействия на инфекцию ВИЧ-1.
Настоящее изобретение обеспечивает новый способ для профилактики или лечения ретровирусных инфекций клеток млекопитающих, в частности профилактику инфекции клеток человека, зараженного вирусом
иммунодефицита человека (ВИЧ), и сопутствующих заболеваний, включая синдром приобретенного иммунодефицита человека (СПИД).
Изобретение обеспечивается фармацевтическими композициями для лечения ретровирусных инфекций, в
частности инфекции ВИЧ у человека, которые включают сериновый ингибитор протеазы лейкоцитов
(СЛПИ), или его аналог, или его производное и фармацевтически приемлемый носитель.
Изобретение включает способ лечения инфекций ВИЧ в клетках человека, включающий введение ему
эффективного количества СЛПИ или его аналога или его производного.
На фиг.1. изображено, как СЛПИ блокирует репликацию ВИЧ в моноцитах в зависимости от дозы. Выделенные моноциты человека высевают на чашки и выдерживают с ВИЧ-СЛПИ в течение 1 часа при 37 °С,
промывают и инкубируют при 37 °С, удаляя надосадочные жидкости и добавляя свежую среду каждые четыре
дня. ЕС50 для этих экспериментов была менее 0,1 мг/мл (8,5 наномоль) с полным ингибированием при 10
мг/мл (850 наномоль).
Как показано на фиг 2, ингибирующий эффект СЛПИ является длительным. На 18 сутки ВИЧ еще ингибирован на 90 %.
2
BY 3137 C1
Настоящее изобретение обеспечивает способы профилактики ретровирусов, в частности инфекции
ВИЧ клеток млекопитающего, в частности клеток человека, и сопутствующих заболеваний, включая синдром приобретенного иммунодефицита человека (СПИД).
Термин "фармацевтически приемлемый носитель", как он использован здесь, обозначает нетоксичный,
обычно инертный носитель для активного ингредиента, который не оказывает вредного влияния на ингредиент или на пациента, которому вводят композицию.
Термин "эффективное количество", как он использован здесь, обозначает предварительно определенное
количество СЛПИ, или его аналога или его производного, достаточное для того, чтобы быть эффективным
против ВИЧ in vivo.
Согласно настоящему изобретению ретровирусные инфекции лечат введением противовирусных агентов
в дозах, достаточных для снижения влияния таких инфекций. Ретровирусные инфекции причастны к ряду заболеваний, включая (но не ограничиваясь ими) рак, аутоиммунные заболевания и синдром иммуноприобретенного дефицита. Инфекция вируса иммунодефицита человека представляет особый интерес согласно настоящему изобретению.
Различные противовирусные агенты известны в области, занимающейся этими проблемами. Большинство из них ингибирует активность ретровирусной ревертазы и включает зидовудин (АЗТ) аналог тимидина,
дидэзоксиинозин (ддИ), и дидэзоксицитозин (ддЦ). Зидовудин является основным противовирусным лекарством, используемым при лечении инфекции ВИЧ. Противовирусные агенты являются обычно эффективными при дозах в области от около 50 мг/день до около 1000 мг/день, более предпочтительно, от около 100
мг/день до около 500 мг/день, и в случае зидовудина, соответственно от около 300 мг/день до 500 мг/день.
Эти агенты обычно вводят в форме оральных композиций.
Ингибиторы протеазы, использованные в этом изобретении, могут быть получены с помощью хорошо
известных в этой области способов [смотри: патент США 4760130, Европейскую патентную заявку 85905
953.7, заявку РСТ WO 86/03519 и патентную заявку США 07/712,354].
Настоящее изобретение относится к ингибиторам протеазы, которые выделены в чистой форме. Предпочтительно, сериновые ингибиторы протеазы по настоящему изобретению являются протеинами с однопептидной цепью, которые являются, по существу, гомологами, и более предпочтительно, биологически эквивалентными нативному сериновому ингибитору протеазы, выделенному из паротидных секреций
человека. Нативный сериновый ингибитор относится также к нативному паротидному ингибитору. Термином "биологически эквивалентный", как он использован повсюду в описании и в формуле изобретения, обозначают, что композиции способны ингибировать полученную из моноцита протеазу, которая ингибируется
СЛПИ, но необязательно в той же самой степени. Термином "производные", как используют повсюду в последующем описании и в формуле изобретения, обозначают степень гомологичности аминокислоты с нативным паротидным ингибитором, предпочтительно превышающую 40 %, более предпочтительно 50 %, с преимущественно предпочтительными группами протеинов, являющимися более чем на 60 % гомологичными с
нативным паротидным ингибитором. Процент гомологичности, как описано выше, расчитывают как процент
компонентов, найденных в меньшей из двух последовательностей, которые могут быть найдены в большей
из двух последовательностей, причем под компонентом понимают последовательность четырех соседних
аминокислот.
Одно из полезных СЛПИ производных представляет СЛПИ, усеченную молекулу СЛПИ, содержащую
только последние 60 аминокислот нативного паротидного ингибитора. Этими 60 аминокислотами являются:
Leu Asp Pro Val Asp Thr Pro Asn Pro Thr Arg Arg Lys
Pro Gly Lys Cys Pro Val Thr Tyr Gly Gln Cys Leu Met
Leu Asn Pro Pro Asn Phe Cys Glu Met Asp Gly Gln Cys
Lys Arg Asp Leu Lys Cys Cys Met Gly Met Cys Gly Lys
Ser Cys Val Ser Pro Val Lys Ala.
Следующую нуклеотидную последовательность используют для кодирования приведенных выше молекул из 60 аминокислот:
CTG GAT ССТ GTT GAC АСС ССА АСА ССА АСА AGG AGG
AAG ССТ GGG AAG TGC ССА GTG ACT TAT GGC CAA TGT TTG
ATG ССТ AAC CCC CCC AAT TTC TGT GAG ATG GAT GGC CAG
TGC AAG CGT GAC TTG AAG TGT TGC ATG GGC ATG TGT GGG
AAA TCC TGC GTT TCC ССТ GTG AAA GCT.
СЛПИ был построен за счет делегации из сигнальной последовательности СЛПИ гена и нуклеотидов, соответствующих первым 47 аминокислотам зрелого СЛПИ протеина, как описано в патентной заявке США
07/712354. СЛПИ может быть также получен по способу примера 8, описанному в заявке РСТ WO 86/03519
и Европейской патентной заявке 85 905 953.7. Хотя пример 8 в этих двух заявках раскрывает способы получения СЛПИ, этот способ может быть также использован для получения СЛПИ. СЛПИ может быть использован для выработки антител, пригодных для очистки СЛПИ. Антитела могут быть получены, например,
3
BY 3137 C1
способами, описанными в E.Harlow and D.Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, pp.92-114 [Cold Springs
Harbor Laboratory, 1988].
Термином "аналоги", как он использован здесь, обозначают любое соединение, включающее, например,
небольшие органические соединения, которые функционально биологически эквивалентны СЛПИ в ингибировании инфекции ВИЧ. Такие производные и аналоги могут быть выделены способами, хорошо известными специалистам в этой области, включающими использование клеток моноцитов для скринирования соединений, которые предотвращают связывание СЛПИ с ними. Аналоги могут также включать специфические
СЛПИ мутеины, которые имеют по крайней мере эквивалентную, а в некоторых случаях более высокую активность, чем нативный протеин. Особенно полезные СЛПИ мутеины включают замещение следующих
аминокислот в положениях остатка под номерами: Glу 20, Gly 75, Val 72, b Phe 72.
СЛПИ мутеины также обеспечивают осуществление изобретения. СЛПИ мутеины, которые соответствуют СЛПИ мутеинам: Сlу 72, Val 25 и Phe 72 здесь называются как Gly 25, Val 25 и Phe 25. Некоторые рассматриваемые СЛПИ мутеины имеют следующую аминокислотную последовательность:
Leu Asp Pro Val Asp Thr Pro Asn Pro Thr Arg Arg Lys
Pro Gly Lys Cys Pro Val Thr Tyr Gly Gln Cys R8, К3,
R9, Asn Pro Pro Asn Phe Cys Glu R4 Asp Gly Gln Cys
Lys Arg Asp Leu Lys Cys Cys R5 Gly R6 Cys Gly Lys
Ser Cys Val Ser Pro Val Lys R7,
где R7 представляет собой аланин и R3, R4, R5, R6, R8 и R9 являются одинаковыми или различными аминокислотами и один или более из R4, R3, R5, R6, R8 и R9 могут быть метионином, валином, аланином, фенилаланином, тирозином, триптофаном, лизином, глицином или аргинином.
Аналоги также включают, например, PEG-илированные формы СЛПИ или СЛПИ, который может иметь
улучшенные терапевтические характеристики по сравнению с нативным протеином. Мутеины, которые могут быть пригодны для PEG-илирования, включают мутеины, которые содержат цистеиновый остаток в положениях 13, 23, 52, 58, 68 и/или 75 СЛПИ и, при соответствующих сайтах: 5, 11, 21 и 28 в СЛПИ. Получение цистеиновых мутеинов для PEG-илирования раскрыто в заявке РСТ WO 92/16221, поданной 13 марта
1992г., которая приводится здесь ссылкой. Полезная стадия при получении мутеина может включать стадию
рефолдинга (refolding), в которой цистеин добавляют к раствору, содержащему протеин. Цистеин может добавляться в стадию разворачивания и может связываться с замещенным свободным цистеином в мутеине.
Можно также выделить из моноцитов СЛПИ ингибируемый протеин (СИП) из моноцитных клеток человека,
используя стандартные биохимические процедуры, хорошо известные специалистам в этой области, и выделять протеины с протеолитической активностью.
После выделения протеина (и, при необходимости, его секвенирования, клонирования его гена и экспрессирования его в клетки хозяина, т.е. рекомбинантного получения СИП) можно скринировать его по способности ингибировать СИП с помощью приемов хорошо известных в этой области. Или же можно определять
их структуру и конструировать из них ингибиторы также с помощью приемов хорошо известных специалистам в этой области.
Если СЛПИ или его аналог, или производное используют для борьбы с инфекциями ВИЧ у человека, соединение может быть введено орально или парентерально, в носителе, включающем один или более фармацевтически приемлемых носителей, количество которого определяют растворимостью и химической природой соединения, выбранного пути введения и стандартной биологической практикой. Для орального
введения СЛПИ или его аналога, или его производного, могут быть приготовлены стандартные дозированные формы: капсулы или таблетки, каждая из которых содержит определенное количество активного ингредиента (от около 10 до 1000 мг, более предпочтительно для пациента -10-200 мг в день, а еще предпочтительнее для пациента - 20-200 мг в день) в фармацевтически приемлемом носителе.
Для парентерального введения СЛПИ, его аналога или его производного, их вводят с помощью внутривенной или подкожной, или внутримышечной инъекции в композиции с фармацевтически приемлемыми
связующими или носителями. Для введения путем инъекции главным образом используют соединение в растворе в стерильном водном носителе, которое может также содержать другие сорастворители: буферы, консерванты, а также достаточные количества фармацевтически приемлемых солей или глюкозы для того, чтобы сделать раствор изотоническим. Подкожные инъекции являются предпочтительным путем введения.
Дозы, в основном, являются такими же, как и те, которые определены выше для орального введения.
Подходящие связующие или носители для отмеченных выше композиций могут быть найдены в стандартных фармацевтических руководствах, например, в "Remington's Pharmaceutical Sciences", 16th ed., Mack
Publishing Company, Easton, PA, 1980.
Дозы соединения будут меняться в зависимости от формы введения и свойств выбранного активного
агента. Более того, они будут изменяться в зависимости от особенностей пациента или хозяина (людей, млекопитающих), которые подвергаются лечению. Обычно лечение начинают малыми дозами, существенно
меньшими, чем оптимальная доза соединения. После этого увеличивают понемногу до оптимального эффек4
BY 3137 C1
та, который достигают при данных обстоятельствах. Вообще наиболее желательно соединение вводить в
концентрации, которая будет обычно приводить к эффективным противовирусным результатам без того,
чтобы вызывать какие-либо нежелательные или разрушительные побочные эффекты. Желательно поддерживать уровень соединения в крови на уровне, достаточном для ингибирования ретровирусной инфекции клеток хозяина. Это может быть установлено опытным определением количества соединения, которое является
эффективным для предотвращения ретровирусной инфекции клеток хозяина, например ВИЧ в моноцитах, in
vitro, и затем, используя стандартную фармакокинетическую методику, определяют количество соединения,
необходимое для сохранения уровня в плазме при одном и том же уровне ингибирования или вплоть до более чем в 10-100 раз.
Хотя композиции, раскрытые здесь, являются эффективными и относительно безопасными для лечения
инфекций ВИЧ, не исключена возможность сопутствующего введения этих композиций с другими противовирусными лекарствами или агентами для получения положительных результатов. Такие другие противовирусные лекарства или агенты включают растворимые СД 4, зидовудин, дидэзоксицитидин, фосфонформат
рибаварин, противовирусные интерфероны (например, альфа-интерферон или интерлейкин-2) или аэрозоль
пентамидина.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1.
Моноциты периферической крови (МПК) выделяют от здорового донора, высевают на чашки с культурой
и инкубируют в течение нескольких дней. СЛПИ смешивают с ВИЧ (Ва1) и применяют к РВМ в течение 1
часа при 37 °С. Клетки промывают и инкубируют в течение дополнительного времени с изменением среды и
определением ревертазы в супернатантах каждые три дня. Считается, что СЛПИ эффективно блокирует репликацию ВИЧ при концентрации 1 мкг/мл (Фиг.1). При концентрациях менее или равных 20 мкг/мл ингибирование СЛПИ уменьшается. Эффект ингибирования является продолжительным, со значительным ингибированием, наблюдаемым на 18 день (Фиг.2).
Пример 2.
РВМ высевают на чашки и инкубируют, как в примере 1. СЛПИ выдерживают с клетками в течение около 1 часа, затем клетки промывают и обрабатывают ВИЧ. Меняют среду, и анализ проводят, как в примере 1.
Считается, что СЛПИ более эффективен при блокировании ВИЧ, если клетки предварительно обрабатывают
СЛПИ, чем если клетки обрабатывают смесью СЛПИ и ВИЧ.
Пример 3.
Демонстрируют в основном те же подходы, что и в примере 1, но заменяют Т-клетки на моноциты, так
как СЛПИ является эффективным в ингибировании репликации ВИЧ в Т-клетках.
Пример 4.
Колонию клеток Т-лимфоцитов человека (Н-9) выдерживают в суспензии культуры RPVI 1640 с 10 % фекальной телячьей сывороткой (ФТС) и 200 микрограммами на литр гентамицина. СЛПИ добавляют в среду
культуры с конечной концентрацией 100 микрограмм на миллилитр. Спустя 24 часа клетки промывают, инокулируют в течение 4 часов ВИЧ штаммом 111 В, вновь промывают и ресуспендируют с плотностью 500000
клеток на миллилитр. Добавляют среду и выдерживают с СЛПИ с конечной концентрацией 100 микрограмм
на миллилитр тотчас после ресуспендирования (Т=0) или два дня спустя после ресуспендирования (Т=2).
Культуру супернатанта собирают и культуры подают каждые два дня. Супернатант собирают 8 дней спустя
после инфицирования и анализируют на ривертазную активность измерением поглощения меченного тритием тимидина в поли (гА) -олиго (dT) матрицу.
Как показано в табл. 1, в клетках, предварительно обработанных СЛПИ, ингибированная СЛПИ вирусная
репликация составляет приблизительно 62 % и 54 %, при незамедлительном добавлении или спустя два дня
после инфицирования, соответственно.
Таблица 1
Клетки, предварительно обработанные СЛПИ
Активность RT
(ср. число имп.)
Стандартное
отклонение
Отрицательный
контроль
Положительный
контроль
Т=0
Т=2
955
86,205
32,594
39,554
±330
±9.676
±7,220
±8,737
Пример 5.
Опыты проводят, как описано в примере 4, за исключением того, что 1000-кратно концентрированный
штамм ВИЧ 111В инкубируют 100 микрограммами СЛПИ в течение 6 часов на льду до инокуляции. Эту
смесь ВИЧ/СЛПИ 1000-кратно разбавляют до инокуляции в течение 4 часов.
5
BY 3137 C1
Как показано в табл. 2, при использовании вируса и клеток, предварительно обработанных СЛПИ, СЛПИ
ингибирует репликацию вируса приблизительно на 64 % и 26 %, при немедленном добавлении или спустя 2
дня после инфицирования, соответственно.
Таблица 2
Вирус и клетки, предварительно обработанные СЛПИ
Активность RT
(ср.ч. имп/мин)
Стандартное
отклонение
Отрицательный
контроль
Положительный
контроль
Т=0
Т=2
2,889
59,004
20,676
43,432
±565
±10,988
±4,111
+14,982
Пример 6.
Опыты проводят, как в примере 5, за исключением того, что используют чистые клетки, т.е. клетки, не
культивированные СЛПИ до инокуляции. Использование чистых клеток и вируса, предварительно обработанного СЛПИ, дает ингибированную вирусную репликацию, приблизительно на 59 % при немедленном добавлении и 32 % спустя два дня после инифицирования соответственно (табл. 3).
Таблица 3
Вирус, предварительно обработанный СЛПИ
Активность RT
(ср.ч. имп/мин)
Стандартное
отклонение
Отрицательный
контроль
Положительный
контроль
Т=0
Т=2
4,763
70,076
28,383
47,436
±1,698
±15,803
±5,520
±11,679
Пример 7
Опыты проводят как в примерах 4-6, за исключением того, что ни клетки, ни вирус не выдерживают с
СЛПИ до инокуляции. Использование чистых клеток и чистого вируса дает ингибированную СЛПИ репликацию вируса приблизительно на 50 % и 42 % при немедленном и спустя два дня после инфицирования добавлении соответственно (табл. 4). В табл. 5 показана активность ревертазы, которая присутствует в культуре супернатанта, анализированной на 4, 6 и 8 сутки после инфицирования.
Таблица 4
Чистые клетки и вирус
Активность RT
(ср.ч. имп/мин)
Стандартное
отклонение
Отрицательный
контроль
Положительный
контроль
Т=0
Т=2
4,763
70,076
28,383
47,436
±1,698
±15,803
±5,520
±11,679
Таблица 5
Чистые клетки и вирус
4 день (ср.ч. имп/мин)
Стандартное
отклонение
6 день (ср.ч. имп/мин)
Стандартное
отклонение
8 день (ср.ч. имп/мин)
Стандартное
отклонение
Отрицательный
контроль
Положительный
контроль
Т=0
Т=2
435
±85
1,556
±300
797
±222
1,287
±204
952
±715
72,085
±12,219
15,846
±5,644
41,240
±14,542
1,519
±475
13,853
±3,458
7,617
±3,031
11,946
±2,889
6
BY 3137 C1
Пример 8.
Изучают также влияние различных СЛПИ мутеинов на вирусную репликацию. Чистые клетки Н-9 инкубируют чистым вирусом в течение 4 часов, как в примере 7. После промывания, клетки ресуспендируют с
плотностью 500000 клеток на миллилитр в среде, содержащей 30 микрограмм на миллилитр СЛПИ или
СЛПИ мутеинов, показанных в таблице 6. Культуру супернатанта анализируют на ревертазную активность
спустя 8 дней (табл. 6).
Таблица 6
Активность КТ
(ср.ч.им п/мин)
Стандартное отклонение
Отриц.
контр.
Полож.
контр
Дикий тип
Gly20
Gly72
Val72
Lys72
Phe72
4,815
55,126
39,323
39,387
40,549
36,077
53,239
8,384
±2,849
±6,637
±10,933
±11,143
±3,537
±7,859
±5,863
±1,924
Пример 9.
Опыты проводят, как в примере 8, за исключением того, что после инокуляции клетки ресуспендируют в
среду, содержащую 100 микрограмм на миллилитр СЛПИ или мутеина Phe 72. Культуру супернатанта анализируют на ревертазную активность через 2, 4, 6, 8 и 10 дней после инфицирования (табл. 7). Табл. 6 и 7
показывают, что влияние Phe 72 мутеина было особенно заметным.
Отрицательный
контроль
2 день (ср.ч. имп/мин)
Стандартное
отклонение
4 день (ср.ч. имп/мин)
Стандартное
отклонение
6 день (ср.ч. имп/мин)
Стандартное
отклонение
8 день (ср.ч. имп/мин)
Стандартное
отклонение
10 день (ср.ч. имп/мин)
Стандартное
отклонение
Таблица 7
Phe72
Положительный
контроль
1,386
±914
СЛПИ
995
±246
897
±472
1,356
±370
1,087
±414
1,380
±442
2,103
±498
1,526
±414
748
±442
77,931
±9,779
25,241
±8,399
3,491
±1,086
21,431
±1,890
12,499
±3,495
2,239
±444
1,142
±389
Пример 10.
Для определения влияния одного СЛПИ, лролифирацию клетки Н-9 оценивают с помощью анализа по
вхождению тимидина, используя клетки Н-9 в количестве 200000, культивированные со 100 микрограммами
на миллилитр СЛПИ и без СЛПИ. Культуры подвергают импульсной обработке /were hulsed/,средой, содержащей 2.5 микрокюри меченного тритием тимидина и проводят измерения на 1,2 и 3 сутки. Как показано в
табл. 8, СЛПИ не является токсичным для этих клеток.
Таблица 8
Активность RT (ср. число импульсов в минуту)
Пролиферация Н-9
Контроль (-СЛПИ)
Стандартное отклонение
+СЛПИ 100 мкг/мл
Стандартное отклонение
1 день
20,860
±581
20,437
±1,503
7
2 день
67,401
±2,529
61,892
±216
3 день
53,326
±3,783
54,592
±2,781
BY 3137 C1
Пример 11.
Изучают также ингибирование продуцирования вируса из хронически инфицированных клеток, используя линию (?колонию) промоноцитной клетки U1. Суспензию культуры U1 поддерживают в RPMI с
10 % FCS и 200 микрограммами на литр гентамицина. Клетки собирают, промывают и суспендируют с плотностью 2,5 миллиона клеток на миллилитр. Суспендированные клетки культивируют в течение ночи в среде,
содержащей 100 или 200 микрограмм на миллилитр СЛПИ (имеется в виду какая-то одна среда). Вирус индуцируют добавлением 13-форбол-12-миристат ацетата (РМА) с конечной концентрацией 1 микромоль.
Спустя 48 часов супернатант культуры клетки анализируют на ревертазную активность как в примерах 4-9.
Как показано в таблице 9, СЛПИ значительно ингибирует продуцирование вируса из этих хронически инфицированных клеток.
Таблица 9
Активность RT
(cp. ч. имп/мин)
Стандартное
отклонение
-ПМА
-СЛПИ
-ПМА
+СЛПИ
(200мкг/мл)
+ПМА
-СЛПИ
-ПМА
+СЛПИ
(200мкг/мл)
+ПМА
+СЛПИ
(200мкг/мл)
1,052
994
5,052
2,864
2,648
±352
±447
±2,053
±403
±374
Приведенное выше описание приводится с целью иллюстрации и объяснения. Должно быть понятно, что
могут быть проведены различные модификации в рамках объема изобретения.
Фиг. 2
Государственный патентный комитет Республики Беларусь.
220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66.
8
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
224 Кб
Теги
by3137, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа