close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY3205

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(19)
BY (11) 3205
(13)
C1
6
(51) G 01N 33/48
(12)
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ
КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ
(54)
СПОСОБ ОЧИСТКИ ПОЛИКЛОНАЛЬНЫХ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ
КЛАССА G ИЗ СЫВОРОТКИ КРОВИ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ АФФИННОЙ
ХРОМАТОГРАФИИ
(21) Номер заявки: 960228
(22) 1996.05.02
(46) 1999.12.30
(71) Заявитель: Витебский медицинский университет
(BY)
(72) Авторы: Конорев М.Р.,
Генералов
И.И.,
Жильцов И.В., Генералова А.Г. (BY)
(73) Патентообладатель: Витебский
медицинский
университет (BY)
BY 3205 C1
(57)
1. Способ очистки поликлональных иммуноглобулинов класса G из сыворотки крови, включающий осаждение иммуноглобулинов 0,75 % раствором риванола в соотношении 1:2, преципитацию выделенных иммуноглобулинов сульфатом аммония раствором 33-40 % насыщения с последующим диализом против 0,9 %
раствора NaCl, отличающийся тем, что после осаждения иммуноглобулинов дополнительно проводят аффинную хроматографию на агарозе, коньюгированной с протеином А золотистого стафилококка, причем остатки риванола удаляют при хроматографии или до нее.
2. Устройство для аффинной хроматографии, включающее колонку с матрицей, отличающееся тем, что
оно дополнительно содержит резервуар для элюента, соединенного с колонкой посредством промежуточного сосуда и разъемных креплений.
(56)
1. Lang В., Newsom-Davis S., Peers C.e.a., J. Physiol., 1987, v. 390. - P. 257-270.
2. Instrument and Reagent for Magnetic Cell Sorting, 1995. - P. 16-17.
BY 3205 C1
Изобретение относится к медицине, в частности к клинической иммунологии и инфекционным болезням,
а также к биохимии и может быть использовано для выделения из сыворотки крови иммуноглобулинов класса G для дальнейшего исследования и изучения, а также для приготовления препаратов каталитических антител, люминесцирующих антител, других коньюгатов, например, для проведения иммуноферментного
анализа (ИФА). В последнем случае освобождение от основного количества балластных белков (главным
образом от альбумина) позволяет снизить неспецифические реакции, вызываемые коньюгатом.
Чаще используют комбинированный способ очистки поликлональных иммуноглобулинов риванолсульфатным методом [1]. Он обеспечивает удаление альбумина, а также а- и b-глобулинов. Gordon с соавт.
показали, что риванол, оставшийся после первого переосаждения, удаляется на сефадексе G-25. Основной
недостаток данного метода связан с потерей иммуноглобулинов при очистке, значительная часть которых
остается в растворе после преципитации сульфатом аммония. Следует отметить, что теоретически вместе с
иммуноглобулинами преципитируют и другие белковые соединения, имеющие сходный молекулярный вес.
Все это ограничивает его практическое применение.
Задачей изобретения является разработка способа для выделения из сыворотки крови поликлональных
IgG (IgG1, IgG2 и IgG4) без примесей других белковых молекул иммуноглобулиновой и неиммуноглобулиновой природы.
В качестве прототипа предлагаемого изобретения принят существующий способ очистки поликлональных иммуноглобулинов (риванол-сульфатный метод).
Сущность предложения заключается в выделении поликлональных ИГ путем первого переосаждения риванолом с последующей аффинной хроматографией на агарозе, коньюгированной с протеином А золотистого
стафилококка, удаления остатка риванола, элюции поликлональных IgG с последующим осаждением сульфатом аммония.
Удаление остатка риванола производится путем адсорбции его на активированном угле или отмывкой
непосредственно на агарозе.
Способ осуществляется следующим образом: Негепаринизированную человеческую кровь центрифугируют 30 минут в центрифужных пробирках в центрифуге с бакетным ротором при 4,5 g (1500 об/мин). К надосадочной жидкости добавляют 0,75 % риванола в соотношении 1:2. Смесь инкубируют при температуре
37 °С 1 час и центрифугируют 30 минут. Полученную в итоге надосадочную жидкость пропускают под давлением через колонку, содержащую активированный уголь, уравновешенную 0,01-0,1М фосфатным буфером
рН 7,4, а затем аккуратно вводят в колонку, содержащую агарозу, коньюгированную с протеином А золотистого стафилококка и уравновешенную 0,1М фосфатным буферным раствором (ФБР) рН 7,4. Аффинную
хроматографию проводят, пропуская надосадок через колонку со скоростью 6-7 капель/мин. Колонку последовательно промывают 0,1М ФБР рН 7,4 с 1 % раствором тритона Х-305 в количестве, равном 4-5 объёмам
колонки, и 0,01-0,1М фосфатным буферным раствором рН 7,4 в количестве, равном 16-20 объемам колонки.
Элюцию проводят 0,1М глицин-НС1 буфером рН 2,8 до исчезновения белка в пробе (объем одной фракции
1,5-2,0 мл). Колонку затем промывают 0,1М ФБР с 1 % раствором тритона Х-305, равным 20-25 объемам колонки до рН 7,4. Полученные элюаты объединяют и добавляют сульфат аммония до 40 % насыщения. Инкубируют при комнатной температуре 15 минут. Преципитирующиеся иммуноглобулины осаждают в
центрифуге с угловым ротором при 32,3 g (6000 об/мин) в течение 15 минут. Надосадочную жидкость сливают. Осадок диализуют против 0,9 % NaCl.
Модификация способа отличается тем, что остатки риванола удаляют во время аффинной хроматографии
непосредственно на агарозе, коньюгированной с протеином А золотистого стафилококка, при промывании
колонки 0,01-0,1М фосфатным буферным раствором рН 7,4 в количестве, равном 30-60 объемам колонки, до
исчезновения желтого окрашивания.
Для сравнения существующих методов очистки ИГ и разработанного способа исследовали 3 способа
очистки поликлональных иммуноглобулинов:
1) риванол-сульфатный метод (рив. сульф.);
2) метод аффинной хроматографии (аф. хром.);
3) комбинацию риванол-сульфатного способа и аффинной хроматографии, предлагаемую нами (рив.аф.хр.).
Оценивали качественный, количественный состав и степень чистоты поликлональных ИГ после очистки
разработанным нами методом и двумя другими способами. Концентрацию IgG определяли спектрофотометрически по поглощению на 280 нм, при этом использовали коэффициент пересчета 1,45. Классы иммуноглобулинов (A,M,G) идентифицировали в радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони. Степень очистки
иммуноглобулинов определяли с помощью следующих методов анализа: электрофореза по ГрабаруУильямс, иммуноэлектрофореза с последующей окраской серебром [2], диск-электрофореза в диссоциирующем полиакриламидном геле с последующей окраской Кумасси R 250, капиллярного иммуноблоттинга с
проявлением полос бензидином.
2
BY 3205 C1
Результаты различных методов очистки поликлональных иммуноглобулинов представлены в таблицах
(таб. 1, таб. 2).
Таблица 1
Процент выхода белка после очистки поликлональных Ig
Наименование метода
Рив. сульф.
Аф. хром.
Рив.-аф.хр.
Исходный объем
сыворотки, мл
2
2
2
Количество Ig в
исходн. объеме, мг
53,4
53,4
53,4
Количество Ig в получ. объеме, мг
9,68
17,06
15,87
Процент
выхода
18,12
31,95
29,72
Таблица 2
Качественный состав выделенных Ig (иммунодиффузия по Оухтерлони)
Наименование метода
Рив. сульф.
Аф. хром.
Рив.-аф.хр.
IgG
+
+
+
IgA
+
+
-
IgM
-
В образцах ИГ, полученных методами риванол-аффинной хроматографии, риванол-сульфатным и методом аффинной хроматографии, иммуноглобулины после электрофоретического разделения сформировали
одну сплошную полосу, соответствующую Ig. При очистке только методом аффинной хроматографии в образцах присутствовали и примеси неиммуноглобулиновых молекул, которые в двух других вышеперечисленных методиках не обнаруживались.
При очистке ИГ с помощью комбинации ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-Toyopearl 650 с риванол-сульфатным методом обнаруживалось небольшое количество примесей неиммуноглобулиновых молекул, комбинация же ДЕАЕ-очистки и аффинной хроматографии приводила к тем же результатам, что и
риванол-аффинно-хроматографический метод. Приведенные данные позволяют сделать вывод о том, что
предложенный нами метод по чистоте получаемых препаратов ИГ является наиболее оптимальным, требует
меньших финансовых затрат и пригоден для получения препаратов каталитических антител, а также для
приготовления препаратов люминесцирующих антител и других коньюгатов.
Эффективность способа заключается в том, что он позволяет обеспечить высокий выход Ig и дает возможность получить препараты иммуноглобулинов класса G (G1, G2 ,G4) без примесей IgA.
Устройство для аффинной хроматографии.
Существующие устройства для аффинной хроматографии с крупнопористыми матрицами (агароза, сефароза) представляют собой стеклянный или полимерный цилиндрический сосуд или трубку различного диаметра и длины с суженным выходным отверстием, где находится мелкопористая мембрана. Устройство
располагается вертикально. К нижнему выходному отверстию присоединяется трубка для отвода жидкости.
Колонка заполняется гранулами матрицы и проводится соответствующая хроматография путем тока жидкости сверху вниз под действием силы тяжести. Данные устройства имеют определенные недостатки. Они связаны с неудобством введения в колонку большого количества элюента с ограничением объёма вводимой
жидкой фазы из-за невозможности изменить длину и объем колонки. Кроме того, при одномоментной загрузке в колонку большого объема элюента значительно увеличивается давление на матрицу, что может
привести к деформации последней, а следовательно к ухудшению условий хроматографии. Наиболее близким к предлагаемому техническому решению является, например, устройство для хроматографии фирмы
«Miltenyi Biotec» [2] и т.п., представляющее собой полимерные цилиндрические сосуды, располагающиеся
вертикально, с узким выходным отверстием, где находится мелкопористая мембрана, на которую наслаивают гранулы матрицы. К нижнему выходному отверстию присоединяется трубка для отвода жидкости.
Задачей изобретения является усовершенствование устройства для аффинной хроматографии.
Сущность предложения заключается в создании нового варианта колонки для аффинной хроматографии
путем применения разъемных креплений, приводящих к быстрому разъединению прибора для очистки и обработки последнего, а также использования промежуточного цилиндра (уменьшающего давление на матрицу) и резервуара для элюента. Цилиндр и резервуар могут иметь различный объем и диаметр, что позволяет
изменять объем, длину и давление в колонке.
Схема и работа прибора.
Предлагаемое устройство для аффинной хроматографии низкого давления состоит из трех цилиндрических сегментов различного диаметра, соединённых между собой переходной и соединительной трубками, и
эластического шланга с зажимом (фиг. 1). Предлагаемое нами устройство состоит из двух цилиндрических
сегментов (1 и 2) диаметром 14 мм и длиной 63 мм. В первом сегменте располагают мембрану-фильтр (5) и
агарозу, коньюгированную с протеином А золотистого стафилококка. К нижнему концу первого сегмента, че3
BY 3205 C1
рез переходную трубку диаметром 7 мм и длиной 20 мм (7), присоединяют эластический шланг с зажимом
(6) диаметром 5 мм. К верхнему концу данного сегмента, через соединительную трубку (4) диаметром 12 мм
и длиной 25 мм, присоединяют второй сегмент. Верхний конец второго промежуточного сегмента соединен
через переходную трубку (7) с нижним концом третьего сегмента (3) диаметром 23 мм и длиной 85 мм.
Работа устройства.
Нижний сегмент заполняют агарозой, коньюгированной с протеином А золотистого стафилококка, которую наслаивают на мембрану-фильтр, находящийся в нижней части сегмента. Объем колонки достигает 5 мл
и более в случае применения цилиндров большего диаметра. Второй сегмент присоединяют к первому с помощью резиновой или силиконовой переходной трубки после наслаивания жидкости на верхний слой агарозы. Третий сегмент с помощью силиконовой соединительной трубки соединяют с вторым сегментом (узкая
часть прибора). Верхний сегмент наполняется жидкостью, которую затем постепенно вводят во второй сегмент с помощью осторожного сжатия последнего. Второй сегмент заполняется частично (не более чем на
1/4). Объем второго сегмента - 5 мл, а третьего - 20 мл и более. Максимальный объем исходной жидкости,
вводимой в колонку, составляет 25 мл и более, в случае применения цилиндров большего диаметра. Вся система быстро разбирается на отдельные части, которые легко обработать и химически простерилизовать. Аффинную хроматографию проводят, пропуская надосадок через колонку со скоростью 6-7 капель/мин. В
третий сегмент прибора постепенно добавляют остальной объем жидкости, необходимый для очистки. Колонку укрепляют вертикально на штативе с помощью зажимов.
Данное устройство в результате применения разъемных креплений и цилиндров различного диаметра и
объёма дает возможность разъединять прибор для очистки и обработки последнего, а также увеличивать
длину и объём колонки, снижая при этом давление на матрицу, в результате использования воздушной прослойки в промежуточном цилиндре.
Государственный патентный комитет Республики Беларусь.
220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66.
4
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
169 Кб
Теги
by3205, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа