close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY3214

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(19)
BY (11) 3214
(13)
C1
6
(51) C 12P 19/40,
(12)
C 07H 19/167,
C 12R 1:19
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ
КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ
(54)
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДЕНОЗИНА
(21) Номер заявки: 961084
(22) 1996.11.27
(46) 1999.12.30
(71) Заявитель: Ляховец В.И. (BY)
(72) Автор: Ляховец В.И. (BY)
(73) Патентообладатель: Ляховец Владимир Иванович
(BY)
(57)
Способ получения аденозина из аденина и рибонуклеозидного источника рибозы ферментативным трансгликозилированием аденина покоящимися клетками Echerichia coli, штамм БМ21 в присутствии неорганического фосфата, при рН 7,5 и температуре 60 °С, и выделением целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве источника рибозы используют природные рибонуклеозиды пуриновой или пиримидиновой природы, или их смесь, выделение проводят с использованием ионообменников, затем, применяя селективную элюцию на цис-гидроксильные
группы углеводной части молекулы, отделяют азотистые основания от оставшегося в реакционной смеси рибонуклеозида, который используется в следующем цикле получения аденозина.
(56)
1. SU 1621512 А, МПК С 12Р 19/38, 1990.
Предлагаемое изобретение относится к микробиологическим способам получения нуклеозидов,
а именно к способу получения аденозина (Ado) - природного нуклеозида, который применяется в
научных исследованиях, а также в качестве исходного сырья для получения АМФ, АТФ и других
биологически активных веществ нуклеиновой природы.
Из известных способов получения Ado наиболее близким к заявляемому способу по технической сущности является способ [1], предусматривающий его синтез из Inо и Ade с помощью, в качестве биокатализатора, интактных клеток Esсheriсhia coli БМ-21 (ВКПМ N В-2752) в присутствии неорганического фосфата при 60-65 °С и рН 7,5 с последующим выделением кристаллизацией
на холоду.
Недостатками способа-прототипа являются:
1 - потери целевого продукта при выделении из реакционной среды кристаллизацией составляют около 20 %;
2 - при оптимальном для прототипа молярном соотношении в реакционной смеси Inо и Ade
(2:1) выход Ado достигает 76,1 % по отношению к Ade. Но при этом используется лишь 41-42 %
добавленного Inо. Уменьшение относительного количества Inо в реакционной смеси увеличивает
степень его использования, однако резко ухудшает процесс выделения Ado кристаллизацией.
Указанные недостатки способа - прототипа ограничивают возможность его применения в условиях промышленного производства, так как Inо, используемый в качестве самостоятельного лекарственного средства "Рибоксин", является в настоящее время сравнительно дорогим компонентом - субстратом.
Целью предлагаемого изобретения является усовершенствование способов получения Ado за
счет как более полного его выделения из реакционной смеси, так и более эффективного использования рибозосодержащего сырья (вышеназванных нуклеозидов). Это достигается благодаря под-
BY 3214 C1
бору условий выделения колоночной ионообменной хроматографией целевого продукта и рибонуклеозидов - доноров рибозы, остающихся в реакционной смеси и используемых в последующих
циклах ферментативной наработки аденозина.
Указанная цель достигается тем, что после получения Ado аналогичным с прототипом способом либо с другим нуклеозидом (уридином, цитидином, гуанозином или их смесью) реакционная
смесь прогревается, осветляется центрифугированием (5000 g, 10 мин) или фильтрацией, наносится на ионообменную колонку с АВ-17 в ОН--форме.
Последовательно элюируют Ado, затем отдельной фракцией нуклеиновые основания, наконец,
оставшиеся нуклеотиды - доноры рибозы, используемые в ферментативной наработке Ado.
Представленный в заявке способ получения Ado, включающий ионообменную хроматографию,
обеспечивает по сравнению с прототипом следующие преимущества:
1. Снижение потерь целевого продукта в процессе выделения;
2. Снижение затрат рибонуклеозидного сырья на получение единицы целевого продукта в 2
раза;
3. Снижение затрат Ade при использовании схемы его реутилизации, представленной в примере 4;
4. Предлагаемый способ выделения позволяет варьировать соотношение нуклеозида - донора и
Ade, а также макси-расширить ассортимент используемых для получения Ado других
нуклеозидов, включая их смесь.
Сущность изобретения поясняется примерами его исполнения.
Пример 1.
В реакционный сосуд вносят 25 г Ade, 100 г инозина(Inо) и 900 мл 0,02 М фосфатного буфера,
рН 7,3. Смесь нагревают до 60 °С и вносят в нее 1 г (в расчете на сухую массу) интактных клеток
Esherichia coli БМ-21, суспендированных в 20 мл того же буфера.
Клетки предварительно выращивали глубинным культивированием при 37 °С в течение 16 часов на среде, содержащей в %: глюкозу - 0,1; пептон - 2,0; дрожжевой экстракт - 2,0; Na2HPO4 0,6; КH2РO4 - 0,3; NaCl - 0,1; MgSO4 х 7 H2O - 0,002.
Полученную реакционную среду с клетками доводят до объема 1 литр 0,02 М фосфатным буфером и инкубируют при 60 °С с периодическим перемешиванием в течение 22 часов.
Выход Ado составляет 77,8 % по отношению к Ade, что соответствует 38,6 г.
После остановки реакции 15-минутным прогреванием и осветления центрифугированием (5000
g, 10 мин) конечную реакционную смесь наносят на ионообменную колонку, наполненную анионообменником АВ-17 М в ОН--форме, 50х250мм, объемом 500 мл. Ado элюируют дистиллированной водой.
За ходом элюции следят с помощью UV- детектора (при λ = 260 нм). (Замена дист. воды в качестве элюэнта на 80 % водный метанол в 7 раз уменьшает объем фракции Ado и время его элюции).
Собранный элюат упаривают на роторном испарителе до объема 150 мл и кристаллизуют Ado
на холоду в течение 15 ч.
Полученный осадок фильтруют и сушат в суховоздушном шкафу при 100 °С. Вес сухого осадка 33,5 г, чистота полученного Ado = 96 %.
После отбора фракции Ado с колонки элюируют Ade и гипоксантин 0,2 М борной кислотой и
промывают колонку 250 мл дистиллированной воды. Оставшийся на колонке Inо элюируют 0,1 М
уксусной кислотой и упаривают элюат до сухого остатка. К сухому остатку дважды добавляют по
30 мл метанола и выпаривают на роторном испарителе. Осадок содержит 50,5 г Inо.
Выделенный Inо может быть использован в дальнейших циклах получения Ado в смеси с новой
порцией Inо или отдельно.
В последнем случае, для реутилизации выделенного Inо, его растворяют в 200 мл воды, доводят значение рН раствора до 7,3 с помощью концентрированного раствора КОН. К полученному
раствору добавляют 200 мл 0,05 М фосфатного буфера, рН 7,3 и 12,6 г Ade. Реакционную смесь
прогревают до 60 °С с перемешиванием и начинают ферментативную реакцию добавлением клеток Escherichia coli БМ-21 (0,5 г в расчете на сухую массу клеток). Условия и время проведения
2
BY 3214 C1
реакции аналогичны таковым для исходного цикла наработки. Выделение проводят аналогичным
образом.
Выход Ado составляет 73 %, что соответствует 18 г. При использовании смеси новой порции
Inо и выделенного в предыдущем цикле выход Ado составляет 73-77 %.
Оставшийся в реакционной смеси Inо (26 г) может использоваться в последующих циклах получения Ado.
Пример 2.
Получение Ado из уридина (Urd) и Ade.
Все условия и количества (молекулярные соотношения) аналогичны данным в примере 1, но
вместо Inо используют Urd и реакцию завершают через 6 часов. Выход Ado достигает 90,3 %, что
соответствует 44,6 г. Выделение Ado, а также фракции Ade с урацилом (Ura) аналогично описанному выше.
Вес выделенного Ado 40 г, чистота – 96 %.
(Смесь Ade и Ura разделима с помощью сильного катионообменника (например, КРС-8П) и,
таким образом, Ade может быть реутилизован наряду с нуклеозидами).
Уридин, оставшийся в реакционной смеси (36 % от исходного его количества) элюируют 0,1 М
уксусной кислотой.
Собранную фракцию уридина нейтрализуют до значения рН 6,0 раствором аммиака и упаривают до минимального объема. К выпаренному остатку добавляют два раза по 20 мл этилового
спирта и выпаривают до сухого остатка. Выделенный Urd может быть использован в дальнейших
циклах получения Ado в смеси с новой партией Urd или отдельно. В последнем случае полученный уридин растворяют в 150 мл дист. воды, доводят значение рН 7,5 добавлением концентрированного раствора КОН, добавляют 150 мл 0,05 М фосфатного буфера, рН 7,5 и 8,5 г Ade. Доводят
объем смеси до 400 мл дистиллированной водой, прогревают до 60 °С и начинают реакцию добавлением клеток Escherichia coli БМ-21 (400 мг по сухому весу).
Через 6 часов реакции выход Ado составляет 89 %, или 15 г.
Оставшийся уридин (12 г) может быть использован в последующих циклах наработки Ado.
Суммарная степень препаративного получения Ado из уридина (и Ade) = 80 %.
Получение Ado из цитидина (Cyd) и Ade проводят почти аналогичным способом. Различия заключались в том, что реакцию начинают с фосфатным буфером, имеющим значение рН 6,0, кроме
того, в течение первого часа реакции поддерживают значение рН 7,0-8,5 с помощью уксусной кислоты. Реакцию проводят при перемешивании в открытом сосуде. Через 0,5 часа от начала реакции основное количество Cyd превращается в Urd, поэтому дальнейшую наработку, выделение и
реутилизацию (уридина) проводят аналогичным вышеописанному способом.
Выход Ado составляет 85-88 % по отношению к Ade.
Пример 3.
Получение Ado из гуанозина (Guo) и Ade.
К 800 мл 0,025 М фосфатного буфера, рН 7,3 добавляют 15,6 г Guo и 6,8 г Ade (молярное соотношение 11:10). После прогревания при температуре 60 °С к смеси добавляют 20 мл суспензии
клеток Escherichia coli БМ-21 (400 мг сухого веса). Реакцию проводят при 60 °С с перемешиванием в течение 22 часов.
Выход Ado составляет 68 % к исходному Ade, или 9,1 г.
После окончания реакции смесь фильтруют, прогревают до кипения, охлаждают и сразу наносят на колонку с анионообменником АВ-17М в ОН--форме, 50х250 мм, объемом 500 мл, со скоростью 200 мл/час. Аденозин элюируют водой, элюат упаривают до 25 мл и помещают в холодильник для формирования кристаллического осадка Ado при температуре 0-5 °С на 16 часов.
Осадок фильтруют на стеклянном фильтре и сушат до постоянного веса при 100 °C.
Вес полученного Ado 8 г, чистота – 95 %.
После элюции аденозина оставшиеся компоненты (в основном это Guo и Ade, так как гуанин,
образующийся в реакционной смеси, очень слаборастворим и удаляется фильтрацией) элюируют
0,1 М уксусной кислотой. Полученный элюат нейтрализуют раствором аммиака до рН 6,5-7,5 и
упаривают до минимального объема. Осадок растворяют в 300 мл 0,02 М фосфатного буфера, рН
3
BY 3214 C1
7,3 при нагревании и при 60 °С добавляют 30 мл суспензии клеток Escherichia coli БМ-21 в аналогичном буфере (120 мг сухой массы). Через 16 часов реакции, проводимой с перемешиванием и
термостатированием при 60 °С, выход Ado к оставшемуся Ade составил 40 % (молярных) или 1,6
г. Выделяют с помощью ионообменной колонки 1,3 г Ado чистотой 95 %.
Суммарная эффективность наработки Ado в описанной выше двухцикловой схеме составляет
80 % относительно Ade и Guo.
Пример 4.
Получение Ado из гидролизата РНК и Ade.
Непосредственным донором рибозы является сумма нуклеозидов, входящих в гидролизат РНК,
который получают следующим образом*:
Растворяют 50 г натриевой соли РНК (Олайна) в 1 литре 0,005 М MgCl2 и доводят с помощью
уксусной кислоты значение рН 5,5. Полученный раствор помещают в термостат с температурой 55
°С. После нагревания к раствору добавляют 105 г (15 г сухого веса) измельченного сырого мицелия Spicaria violacea БМ-33 (Paecilomyces), выращенного глубинным культивированием, и перемешивают в течение всего времени гидролиза РНК. Через 20 часов гидролиза отделяют мицелий
фильтрованием через ткань, доводят значение рН 7,3 с помощью КОН, добавляют 10 г аденина и
растворяют его 15-минутным прогреванием до 100 °С при перемешивании. Снижают температуру
до 60 °С и к полученному раствору добавляют суспензию клеток Escherichia coli БМ-21 (1 г в расчете на сухую массу). Через 5 ч реакцию прекращают 5-минутным прогреванием до 100 °C и после охлаждения до комнатной температуры реакционную смесь осветляют центрифугированием
(5000 g, 10 мин).
Количество Ado в гидролизате РНК (Олайна) составляет 14,35 % от исходного количества
РНК. После проведения реакции трансгликозилирования с Ade выход Ado достигает 37,8 % к исходному количеству чистой РНК (увеличен в 2,6 раза).
Реакционную смесь порционно наносят на колонку с анионообменником АВ 17 М в ОН-форме, объемом 1750 мл со скоростью протока 1000 мл/час. Скорость промывания и элюции дист.
водой составляет 3 л/час. Ход элюции Ado контролируют с помощью UV-детектора. Из собранной
фракции Ado выделяли упариванием под вакуумом и кристаллизацией на холоду - аналогично
способу, описанному в примере 1.
После отбора фракции Ado колонку промывают дистиллированной водой и элюируют нуклеиновые основания 0,2 М боратом при той же скорости протока. После увеличения оптической
плотности элюата (при λ = 260 нм) до 1 о.е./мл присоединяют последовательно вторую колонку с
катионообменником КРС-8П в Н+-форме, объемом 500 мл. Скорость элюции - 1000 мл/час.
После завершения элюции боратом Ade и Ura, выходящих совместно с первой колонки, и соответствующего падения оптической плотности до 0,5 о.е./мл колонку промывают дистиллированной водой, а контроль за элюатом переносят с первой на вторую колонку. (Первую колонку на
этом этапе выводили из системы элюции.) Завершив элюцию Ura (дистиллированной водой), со
второй колонки приступают к элюции Ade 0,5 M NH4ОH. Полученные фракции Ade упаривают на
роторном испарителе до сухого остатка. Выпаренный осадок двухкратно ресуспендируют с 50 мл
этанола и вновь выпаренный осадок Ade используют для дальнейшей наработки Ado. Полученный
Ade способен к эффективной конверсии в Ado. Потери Ade в процессе реутилизации составляют
около 10 %. Степень использования Ade по вышеописанному методу повышается в 1,5 раза по
сравнению со способом без выделения и реутилизации Ade.
* Гидролиз РНК может быть проведен другими способами. Наряду с гидролизатом РНК в данной схеме могут быть использованы различные смеси природных нуклеозидов - доноров рибозы.
Государственный патентный комитет Республики Беларусь.
220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66.
4
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
145 Кб
Теги
by3214, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа