close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY3607

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(19)
BY (11) 3607
(13)
C1
(51)
(12)
6
C 12N 15/00,
C 12N 15/67,
C 12N 15/82
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ
КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ
(54)
СПОСОБ МОДИФИКАЦИИ ФРАГМЕНТА ДНК, КОДИРУЮЩЕГО
ИНСЕКТИЦИДНЫЙ БЕЛОК BACILLUS THURINGIENSIS, ФРАГМЕНТ ДНК,
КОДИРУЮЩИЙ ИНСЕКТИЦИДНЫЙ БЕЛОК BACILLUS THURINGIENSIS
(ВАРИАНТЫ), ФРАГМЕНТ ДНК, СОДЕРЖАЩИЙ СТРУКТУРНЫЙ ГЕН,
КОДИРУЮЩИЙ ИНСЕКТИЦИДНЫЙ БЕЛОК (ВАРИАНТЫ), И ФРАГМЕНТ
ДНК, СОДЕРЖАЩИЙ СТРУКТУРНЫЙ ГЕН, КОДИРУЮЩИЙ СЛИТЫЙ
БЕЛОК
(21) Номер заявки: 1420
(22) 1993.12.08
(86) PCT/US90/00778, 1990.02.13
(31) 315355, 476661
(32) 1989.02.24, 1990.02.12
(33) US, US
(46) 2000.12.30
(71) Заявитель: Монсанто Компани (US)
(72) Авторы: Дэвид Эллен Фишофф, Фредерик
Джозеф Перлак (US)
(73) Патентообладатель: Монсанто Компани (US)
BY 3607 C1
(57)
1. Способ модификации фрагмента ДНК, кодирующего инсектицидный белок Bacillus thuringiensis, для
обеспечения экспрессии в растениях, предусматривающий удаление частей указанного фрагмента, отличающийся тем, что удаляют отдельные сигналы полиаденилирования, выбранные из группы:
ААТААА, ААТААТ, ААССАА, АТАТАА, ААТСАА,
АТАСТА, АТАААА, ATGAAA, AAGCAT, АТТААТ, АТАСАТ, ААААТА,
АТТААА, ААТТАА, ААТАСА, САТААА и АТТТА,
сохраняя при этом последовательность, кодирующую инсектицидный белок.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что дополнительно осуществляют замену части оставшейся последовательности на последовательность, которая является предпочтительной для растений.
3. Фрагмент ДНК, кодирующий инсектицидный белок Bacillus thuringiensis HD-1, имеющий нуклеотидную
последовательность I.
Фиг. 1
BY 3607 C1
4. Фрагмент ДНК, кодирующий инсектицидный белок Bacillus thuringiensis HD-73, имеющий нуклеотидную последовательность II.
5. Фрагмент ДНК, кодирующий инсектицидный белок Bacillus thuringiensis HD-1, имеющий нуклеотидную последовательность III.
6. Фрагмент ДНК, кодирующий инсектицидный белок, полученный из Bacillus thuringiensis HD-73,
имеющий нуклеотидную последовательность IV.
7. Фрагмент ДНК, кодирующий полноразмерный инсектицидный белок Bacillus thuringiensis HD-73, имеющий
нуклеотидную последовательность V.
8. Фрагмент ДНК, кодирующий инсектицидный белок, полученный из Bacillus thuringiensis HD-73,
имеющий нуклеотидную последовательность VI.
9. Фрагмент ДНК, содержащий структурный ген, кодирующий инсектицидный белок, полученный из Bacillus
thuringiensis tenebrionis, имеющий нуклеотидную последовательность VII.
10. Фрагмент ДНК, содержащий структурный ген, кодирующий инсектицидный белок, полученный из
Bacillus thuringiensis entomocidus, имеющий нуклеотидную последовательность VIII.
11. Фрагмент ДНК, кодирующий инсектицидный белок Bacillus thuringiensis Р2, имеющий нуклеотидную последовательность IX.
12. Фрагмент ДНК, содержащий структурный ген, кодирующий слитый белок, включающий 610Nтерминальных аминокислот, полученных из Bacillus thuringiensis kurstaki HD-1 и 567C-терминальных аминокислот белка токсина, полученного из Bacillus thuringiensis kurstaki HD-73, имеющий нуклеотидную последовательность X.
13. Фрагмент ДНК, содержащий структурный ген, кодирующий инсектицидный белок, полученный из Bacillus
thuringiensis kurstaki HD-73, имеющий нуклеотидную последовательность XI.
(56)
1. Kenneth A., et al., Bacillus thurigiensis δδ-Endotoxin Expressed in Trasgenic Nicotiana tabacum Provides Resistance to Lepidopteran Insects, Plant Physiol., vol. 85, 1987, p. 1103-1109.
2. Vaeck M., et al., Transgenic plants protected from insect attack. Nature, vol. 328, 2 July, 1987, p. 33-37.
2
BY 3607 C1
Последовательность I
33
BY 3607 C1
34
BY 3607 C1
35
BY 3607 C1
Последовательность II
36
BY 3607 C1
37
BY 3607 C1
38
BY 3607 C1
39
BY 3607 C1
40
BY 3607 C1
41
BY 3607 C1
42
BY 3607 C1
43
BY 3607 C1
44
BY 3607 C1
45
BY 3607 C1
46
BY 3607 C1
47
BY 3607 C1
48
BY 3607 C1
49
BY 3607 C1
50
BY 3607 C1
51
BY 3607 C1
52
BY 3607 C1
53
BY 3607 C1
54
BY 3607 C1
55
BY 3607 C1
56
BY 3607 C1
57
BY 3607 C1
58
BY 3607 C1
59
BY 3607 C1
60
BY 3607 C1
61
BY 3607 C1
62
BY 3607 C1
63
BY 3607 C1
64
BY 3607 C1
65
BY 3607 C1
66
BY 3607 C1
67
BY 3607 C1
68
BY 3607 C1
69
BY 3607 C1
70
BY 3607 C1
71
BY 3607 C1
72
BY 3607 C1
73
BY 3607 C1
74
BY 3607 C1
75
BY 3607 C1
76
BY 3607 C1
77
BY 3607 C1
78
BY 3607 C1
Таблица 1
PA
Р1А
Р2А
РЗА
Р4А
Р5А
Р6А
Р7А
Р8А
Р9А
Р10А
Р11А
Р12А
Р13А
Р14А
Р15А
ААТААА
ААТААТ
AACCAA
АТАТАА
AAТCAA
AТACТA
AТAAAA
AТGAAA
AAGCAT
ATTAAT
ATACAT
AAAATA
ATTAAA
AATTAА
AATACA
CATAAA
Мажорный консенсусный сайт
Мажорный сайт растений
Минорный сайт растений
Минорный сайт растений
Минорный сайт растений
Минорный сайт растений
Минорный сайт растений
Минорный сайт растений
Минорный сайт растений
Минорный сайт растений
Минорный сайт растений
Минорный сайт растений
Минорный сайт животных
Минорный сайт животных
Минорный сайт животных
Минорный сайт животных
Таблица 2
Предпочтительно используемые в растениях кодоны
Аминокислота
ARG
LEU
SER
THR
PRO
АLА
GLY
Кодон
CGA
СGС
CGG
CGU
AGA
AGG
CUA
CUC
CUG
CUU
UUA
UUG
UCA
UCC
UCG
UCU
AGC
AGU
АСА
ACC
ACG
ACU
CCA
CCC
CCG
CCU
CGA
GCC
GCG
GCU
GGA
GGC
GGG
GGU
Процент встречаемости в растениях
7
11
5
25
29
23
8
20
10
28
5
30
14
26
3
21
21
15
21
41
7
31
45
19
9
26
23
32
3
41
32
20
11
37
79
BY 3607 C1
Продолжение табл. 2
Аминокислота
Кодон
AUA
AUC
AUU
GUA
GUC
GUG
GUU
AAA
AAG
AAC
AAU
CAA
CAG
CAC
CAU
GAA
GAG
GAC
GAU
UAC
UAU
UGC
UGU
UUC
UUU
AUG
UGG
ILE
VAL
LYS
ASN
CLN
HIS
GLU
ASP
TYR
CYS
PHE
MET
TRP
Процент встречаемости в растениях
12
45
43
9
20
28
43
36
64
72
28
64
36
65
35
48
52
48
52
68
32
78
22
56
44
100
100
Таблица 3
Праймеры для мутагенеза B.t.k. HD-I гена
Праймер
ВТК185
ВТК240
ВТК462
ВТК669
ВТК930
ВТК1110
ВТК1380А
ВТК1380Т
Длина
(пн)
18
48
54
48
39
32
37
100
ВТК1600
27
Последовательность
TCCCCAGATA ATATCAAC
GGCTTGATTC CTAGCGAACT CTTCGATTCT CTGGTTGATG AGCTGTTC
CAAAACTGAG AGGTGGAGGT TGGCAGCTTG AACGTACACG GAGAGGAGAGGAAC
AGTTAGTGTA AGCTCTCTTC TGAACTGGTT GTACCTGATC CAATCTCT
AGCCATGATC TGGTGACCGG ACCAGTAGTA TTCTCCTCT
AGTTGTTGGT TGTTGATCCC GATGTTAAAA GG
GTGATGAAGG GATGATGTTG TTGAACTCAG САСTАСG
CAGAAGTTCC AGAGCCAAGA TTAGTAGACT TGGTGAGTGG GATTTGGGTG
ATTTGTGATG AAGGGATGAT GTTGTTGAAC TCAGCACTAC GATGTATCCA
TGATGTGTGG AACTGAAGGT TTGTGGT
Таблица 4
Сравнительные эффекты региональных модификаций в B.t.k. гене
Конструкция
pMON5370
pMON10707
pMON10706
pMON10539
pMON10537
pMON10540
pMON10705
Модифицированные позиции
185, 240, 669, 930, 1110, 1380 а+b, 1600
185, 240, 462, 669
930, 1110, 1380 a+b, 1600
185
240
185, 240
462
Кол-во токсичных растений
38
22
48
19
43
1
55
2
57
17
88
23
47
1
Таблица 5
Встречаемость различных кодонов в синтетическом B.t.k. HD-I гене
80
BY 3607 C1
Аминокислота
ARG
(43)
LYS
(3)
ASN
(44)
GLN
(31)
HIS
(10)
GLU
(30)
ASP
(23)
Кодон
CGA
CGC
CGG
CGU
AGA
AGG
CUA
CUC
CUG
CUU
UUA
UUG
UCA
UCC
UCG
UCU
AGC
AGU
АСА
ACC
ACG
ACU
CCA
CCC
CCG
CCU
GCA
GCC
GCG
GCU
GGA
GGC
GGG
GGU
AUA
AUC
AUU
GUA
GUC
GUG
GUU
AAA
AAG
AAC
AAU
CAA
CAG
CAC
CAU
GAA
GAG
GAC
GAU
Аминокислота
Кодон
LEU
(49)
SER
(64)
THR
(42)
PRO
(34)
ALA
(31)
GLY
(46)
ILE
(46)
VAL
(38)
Процент встречаемости в: растениях/Дт B.t.k./ Синтет.
7
11
2
11
5
5
5
2
0
25
14
27
29
55
41
23
14
25
8
16
4
20
0
20
10
2
6
28
22
24
5
50
0
30
10
45
14
27
5
26
9
28
3
8
0
21
19
31
21
6
32
15
31
5
21
31
14
41
19
53
7
14
0
31
36
33
45
35
53
19
6
12
9
21
3
26
38
32
23
38
26
32
9
29
3
3
0
41
50
45
32
52
45
20
17
15
11
15
6
37
15
34
12
39
2
45
11
67
43
50
30
9
45
3
20
5
16
28
11
37
43
39
45
36
100
33
64
0
67
72
27
80
28
73
20
64
77
61
36
23
39
65
0
80
35
100
20
48
87
50
52
13
50
48
17
65
52
83
35
Продолжение табл. 5
Процент встречаемости в: растениях/Дт B.t.k./ Синтет.
81
BY 3607 C1
TYR
(25)
CYS
(2)
PHE
(36)
MET (9)
TRP (9)
UAC
UAU
UGC
UGU
UUC
UUU
AUG
UGG
68
32
78
22
56
44
100
100
20
80
50
50
17
83
100
100
72
28
100
0
83
17
100
100
Таблица 6
Праймеры, используемые при мутагенезе B.t.k. HD-73 гена
Праймер
73К1363
Длина (по)
51
73К1437
73К1471
73К1561
33
48
60
73К1642
73К1675
33
48
73К1741
73К1797
73KTER М
39
36
54
Последовательность
AATACTATCG GATGCGATGA TGTTGTTGAA CTCAGCACTA
CGGTGTATCC A
TCCTGAAATG ACAGAACCGT TGAAGAGAAA GTT
ATTTCCAGTG CTGTTGAGTC TAACGAGGTC TCCACCAGTG AATCCTGG
GTGAATAGGG GTCACAGAAG CATACCTCAC ACGAACTCTA
TATCTGGTAG ATGTTGGATGG
TGTAGCTGGA ACTGTATTGG AGAAGATGGA TGA
TTCAAAGTAA CCGAAATCGC TGGATTGGAG ATTATCCAAG
GAGGTAGC
ACTAAAGTTT CTAACACCCA CGATGTTACC GAGTGAAGA
AACTGGAATG AACTCGAATC TGTCGATAAT CACTCC
GGACACTAGA TCTTAGTGAT AATCGGTCAC ATTTGTCTTG
AGTCCAAGCT GGTT
Таблица 7
Встречаемость кодонов в синтетическом B.t.k. HD-73 гене
Аминокислота
ARG
(10)
LEU
(12)
SER
(21)
THR
(15)
Кодон
CGA
CGC
CGG
CGU
AGA
AGG
CUA
CUC
CUG
CUU
UUA
UUG
UCA
UCC
UCG
UCU
AGC
AGU
АСА
ACC
ACG
ACU
Процент использования в: растениях Дт /HD-73/ Син
7
10
0
11
0
8
5
10
0
25
20
23
29
60
62
23
0
8
8
25
8
20
17
58
10
17
8
28
8
0
5
33
8
30
0
17
14
24
18
26
10
27
3
10
0
21
24
18
21
0
14
15
33
23
21
47
38
41
13
31
7
13
0
31
27
31
Продолжение табл. 7
82
BY 3607 C1
Аминокислота
PRO
(7)
ALA
(14)
GLY
(15)
ILE
(15)
VAL
(15)
LYS
(3)
ASN
(20)
GLN
(5)
HIS
(3)
GLU
(7)
ASP
(5)
TYR
(5)
CYS
(0)
PHE
(13)
MET (2)
TRP (2)
Кодон
CCA
CCC
CCG
CCU
GCA
GCC
GCG
GCU
GGA
GGC
GGG
GGU
AUA
AUC
AUU
GUA
GUC
GUG
GUU
AAA
AAG
AAC
AAU
CAA
CAG
CAC
CAU
GAA
GAG
GAC
GAU
UAC
UAU
UGC
UGU
UUC
UUU
AUG
UGG
Процент использования в: растениях Дт /HD-73/ Син
45
71
71
19
0
0
9
14
0
26
14
29
23
29
31
32
7
8
3
21
15
41
43
46
32
33
43
20
0
0
11
27
14
37
40
43
12
33
7
45
7
40
43
60
53
9
40
7
20
0
7
28
20
36
43
40
50
36
67
100
64
33
0
72
20
53
28
80
47
64
60
67
36
40
33
65
67
100
35
33
0
48
86
57
52
14
43
48
40
50
52
60
50
68
0
20
32
100
80
78
0
0
22
0
0
56
8
67
44
92
33
100
100
100
100
100
100
Таблица 8
Экспрессия B.t.k. HD-I белка в трансгенном табаке
Описание гена
дикого типа
модифицированный
синтетический
Вектор
pMON 9921
pMON 5370
pMON 5377
Концентрация
B.t.k. белка *
10
1000
5000
Во сколько раз увеличивалась экспрессия B.t.k.
белка
1
100
500
* B.t.k. белковые концентрации экспрессируются в нг/мг всего растворимого белка. Уровень B.t.k. белка
для растений, содержащих ген дикого типа, оценивали по уровням мРНК.
Таблица 9
Защита растений табака от табачной бабочки-бражника и совки-карадрина
83
BY 3607 C1
Описание гена
Вектор
нет
дикого типа
модифицированный
синтетический
нет
pMON 9921
pMON 5370
pMON 5377
Вред табачной бабочкебражнику *
NL
0
0
0
Вред совке-карадрина *
NL
3
1
0
* - степень нанесенного вреда насекомым оценивалась: 0 - нет повреждений; 1 - легкие,
2 - средние, 3 - серьезные: NL - не имеется опадающих листьев.
Таблица 10
Полноразмерный B.t.k. HD-73 белок и уровни мРНК в трансгенных растениях табака
Описание гена
Вектор
Синтетический/дикого типа
Синтетический/модифицированный
Синтетический/синтетический
pMОN 10506
pMОN 10526
pMОN 10518
Концентрация
белка B.t.k.
100
400
2000
Относительный уровень мРНК
B.t.k
0,5
1
40
Таблица 11
Экспрессия B.t.k. HD-I белка в трансгенных растениях томатов
Описание гена
Дикого типа
Модифицированный
Синтетический
Вектор
pMОN 9921
pMОN 5370
pMON 5377
Концентрация B.t.k.
белка *
10
100
500
Во сколько раз увеличена экспрессия
B.t.k. белка
1
10
50
* Концентрация экспрессированного B.t.k. HD-I белка в нг/мг от общего растворимого растительного
белка. Данные для растений, содержащих ген дикого типа, оцениваются из уровней мРНК и уровней белка,
определяемых с помощью ELISA.
Таблица 12
Защита растений томатов от табачной бабочки-бражника и совки-карадрина
Описание гена
нет
Дикого типа
Модифицированный
Синтетический
Вектор
Повреждения, наносимые та- Повреждения, наносимые совкойбачной бабочкой-бражником *
карадриной *
нет
pMON 9921
pMON 5370
pMON 5377
NL
0
0
0
NL
3
1
0
* Повреждения определялись, как указано в таблице 9.
Таблица 13
84
BY 3607 C1
Полноразмерный B.t.k. HD-73 белок и уровни мРНК в трансгенных растениях табака
Описание гена
Синтетический/дикого типа
Синтетический/модифицированный
Полностью синтетический
Вектор
pMON 10506
pMON 10526
pMON 10518
Концентрация
В.t k. белка
100
400
2000
Относительный уровень
мРНК в B.t.k.
1
2-4
40
Таблица 14
Защита от табачной бабочки-бражника путем "окрашивания" листьев томатов экстрактами,
приготовленными из каллюса хлопка, содержащего контроль, ген B.t.k. HD-I дикого типа, синтетический HD-I ген или синтетический HD-73 ген
Описание гена
Повреждения, наносимые табачной бабочкойбражником *
NL
3
0
0
Вектор
Контроль
Дикого типа HD-I
Синтетический HD-I
Синтетический HD-73
контроль
pMON 9921
pMON 5377
pMON 5383
*Повреждения оценивали, как показано в таблице 8.
Таблица 15
Генные конструкции с CTPs
Вектор
pMON 10306
pMON 10814
pMON 10811
pMON 10819
pMON 10815
pMON 10817
pMON 10821
pMON 10822
pMON 10838
pMON 10839
Промотор
CTP
Кодирующая последовательность B.t.k. HD-73
En 35S
En 35S
SSU IIa
SSU IIa
atsI A
atsI A
EN 35S
EN 35S
SSU IIa
atsI A
atsIA
SSU IIa
SSU IIa
нет
нет
atsI A
atsI A
atsI A
SSU IIa
atsI A
усеченный
полноразмерный
усеченный
полноразмерный
полноразмерный
полноразмерный
85
BY 3607 C1
Фиг. 2
86
BY 3607 C1
Фиг. 3
87
BY 3607 C1
Фиг. 4
88
BY 3607 C1
Фиг. 5
89
BY 3607 C1
Фиг. 6
90
BY 3607 C1
Фиг. 7
91
BY 3607 C1
Фиг. 8
92
BY 3607 C1
Фиг. 9
93
BY 3607 C1
Фиг. 10
Фиг. 11
94
BY 3607 C1
Фиг. 12
Фиг. 13
95
BY 3607 C1
Фиг. 14
96
BY 3607 C1
Фиг. 15
97
BY 3607 C1
Фиг. 16
98
BY 3607 C1
Фиг. 17
99
BY 3607 C1
Фиг. 18
100
BY 3607 C1
Фиг. 19
101
BY 3607 C1
Фиг. 20
102
BY 3607 C1
Фиг. 21
103
BY 3607 C1
Фиг. 22
104
BY 3607 C1
Фиг. 23
105
BY 3607 C1
Фиг. 24
106
BY 3607 C1
Фиг. 25
107
BY 3607 C1
Фиг. 26
108
BY 3607 C1
Фиг. 27
109
BY 3607 C1
Фиг. 28
110
BY 3607 C1
Фиг. 29
111
BY 3607 C1
Фиг. 30
112
BY 3607 C1
Фиг. 31
113
BY 3607 C1
Фиг. 32
114
BY 3607 C1
Фиг. 33
115
BY 3607 C1
Фиг. 34
116
BY 3607 C1
Фиг. 35
117
BY 3607 C1
Фиг. 36
118
BY 3607 C1
Фиг. 37
119
BY 3607 C1
Фиг. 38
120
BY 3607 C1
Фиг. 39
121
BY 3607 C1
Фиг. 40
122
BY 3607 C1
Фиг. 41
123
BY 3607 C1
Фиг. 42
124
BY 3607 C1
Фиг. 43
125
BY 3607 C1
Фиг. 44
Государственный патентный комитет Республики Беларусь.
220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66.
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
6 103 Кб
Теги
патент, by3607
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа