close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY3961

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(19)
BY (11) 3961
(13)
C1
(51)
(12)
7
C 12P 17/12,
C 12N 11/20
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ
КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ
(54)
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ
ГИДРОКСИАЗОТСОДЕРЖАЩИХ ГЕТЕРОЦИКЛИЧЕСКИХ КАРБОНОВЫХ
КИСЛОТ, МИКРООРГАНИЗМЫ, РАЗЛАГАЮЩИЕ
6-МЕТИЛНИКОТИНОВУЮ КИСЛОТУ И
ГИДРОКСИАЗОТГЕТЕРОЦИКЛИЧЕСКИЕ КАРБОНОВЫЕ КИСЛОТЫ
(21) Номер заявки: 426
(22) 1993.05.26
(31) 672/92
(32) 1992.03.04
(33) CH
(46) 2001.06.30
(71) Заявитель: Лонца АГ (CH)
(72) Авторы: Андреас
Кинер
(CH),
Андреас
Тиншерт (DE), Андреас Чех (CH), Клаус
Хейнцманн (CH)
(73) Патентообладатель: Лонца АГ (CH)
(57)
1. Микробиологический способ получения гидроксиазотсодержащих гетероциклических карбоновых кислот или их растворимых солей с общей формулой I:
, (I)
где R1 и R2 имеют одинаковое или различное значение и представляют собой атом водорода, атом галогена
или C1-C4-алкильную группу, а X - атом азота или СR3-группу, в котором R3 - атом водорода или атом галогена, отличающийся тем, что азотсодержащую гетероциклическую карбоновую кислоту или ее растворимые соли с общей формулой II:
BY 3961 C1
, (II)
где R1, R2 и X имеют указанные выше значения, используемую в качестве субстрата, под влиянием содержащих специфическую гидроксилазу и использующих 6-метилникотиновую кислоту микроорганизмов преобразуют в продукт формулы I.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве субстрата применяют азотсодержащие гетероциклические карбоновые кислоты с общей формулой II:
, (II)
где R1 и R2 имеют одинаковое или различное значение и представляют собой атом водорода, атом хлора или
метильную группу, а X - атом азота или CH-группа.
BY 3961 C1
3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что проводят реакцию с микроорганизмами, Ki101, германская коллекция микроорганизмов 6920.
4. Способ по одному или нескольким пп. 1-3, отличающийся тем, что реакцию проводят при однократном или многократном (непрерывном) добавлении субстрата так, чтобы концентрация субстрата в культуральной среде не превышала 10 вес. %.
5. Способ по одному или нескольким пп. 1-4, отличающийся тем, что реакцию проводят при температуре 15-50 °С при рН от 5 до 9.
6. Микроорганизмы Ki101 (германская коллекция 6920), предназначенные для разложения 6метилникотиновой кислоты в качестве единственного источника углерода, азота и энергии через 2-гидрокси6-метилникотиновую кислоту.
7. Гидроксиазотгетероциклические карбоновые кислоты с общей формулой I:
, (I)
где X - атом азота, R1 и R2 имеют одинаковое или различное значение и представляют собой атом водорода,
атом галогена или С1-С4-алкильную группу, исключая вариант, когда R1 и R2 - водород одновременно, а также в случае, если X - CH-группа, R1 и R2 - атом хлора.
8. 5,6-Дихлор-2-гидроксиникотиновая кислота.
9. 3-Гидрокси-5-метилпиразинкарбоновая кислота.
10. 3-Гидрокси-5-хлорпиразинкарбоновая кислота.
(56)
SU 578876 A, 1977.
US 4081451 A, 1978.
EP 006711 A2, 1982.
CH 658866 A5, 1986.
EP 0225172 Al, 1987.
Изобретение относится к области биохимии и микробиологии, в частности к микробиологическим способам получения карбоновых кислот.
Под азотсодержащими гетероциклическими карбоновыми кислотами следует понимать гидроксилированные или негидроксилированные кислоты, а также их растворимые соли, такие как, например, соли щелочных металлов или аммониевые соли.
2-гидроксиазотсодержащие гетероциклические карбоновые кислоты представляют собой важнейшие промежуточные продукты в процессах синтеза активных веществ. Например, 2-гидроксиникотиновая кислота служит исходным материалом для получения 2-хлорникотиновой кислоты (пат. заявка США 4 081 451), являющейся, в частности, важным промежуточным продуктом для получения фармацевтических соединений (Ann.
Pharm. Fr., 1980, 38(3), стр. 243-252).
До настоящего момента не было известно микробиологического метода получения гидроксиазотсодержащих гетероциклических карбоновых кислот.
Задачей настоящего изобретения была разработка простого и экологически чистого метода получения
химически трудно доступных 2-гидроксиазотсодержащих гетероциклических карбоновых кислот на микробиологической основе.
Эта задача решается с помощью микробиологического способа получения гидроксиазотсодержащих гетероциклических карбоновых кислот или их растворимых солей с общей формулой I:
, (I)
где R1 и R2 имеют одинаковое или различное значение и представляют собой атом водорода, атом галогена
или C1-C4-алкильную группу, а X - атом азота или СR3-группу, в котором R3 - атом водорода или атом галогена, заключающегося в том, что азотсодержащую гетероциклическую карбоновую кислоту или ее растворимые соли с общей формулой II:
2
BY 3961 C1
, (II)
где R1, R2 и X имеют указанные выше значения, используемую в качестве субстрата, под влиянием содержащих специфическую гидроксилазу и использующих 6-метилникотиновую кислоту микроорганизмов преобразуют в продукт формулы I.
В другом варианте в качестве субстрата применяют азотсодержащие гетероциклические карбоновые кислоты с общей формулой II:
, (II)
где R1 и R2 имеют одинаковое или различное значение и представляют собой атом водорода, атом хлора или
метильную группу, а X - атом азота или CH-группа.
В предпочтительном варианте проводят реакцию с микроорганизмами, Ki101, Германская коллекция
микроорганизмов 6920.
В предпочтительном варианте реакцию проводят при однократном или многократном (непрерывном) добавлении субстрата так, чтобы концентрация субстрата в культуральной среде не превышала 10 вес. %.
В предпочтительном варианте реакцию проводят при температуре 15-50 °С при рН от 5 до 9.
Другим объектом изобретения являются микроорганизмы Ki101 (Германская коллекция 6920), предназначенные для разложения 6-метилникотиновой кислоты в качестве единственного источника углерода, азота и энергии через 2-гидрокси-6-метилникотиновую кислоту.
Еще одним объектом изобретения являются гидроксиазотгетероциклические карбоновые кислоты с общей формулой I:
, (I)
где X - атом азота, R1 и R2 имеют одинаковое или различное значение и представляют собой атом водорода,
атом галогена или С1-С4-алкильную группу, исключая вариант, когда R1 и R2 - водород одновременно, а также в случае, если X - CH-группа, R1 и R2 - атом хлора, в частности 5,6-дихлор-2-гидроксиникотиновая кислота, 3-гидрокси-5-метилпиразинкарбоновая кислота, 3-гидрокси-5-хлорпиразинкарбоновая кислота.
Под термином "использующие 6-метилникотиновую кислоту микроорганизмы, содержащие специфическую гидроксилазу" следует понимать следующее.
Если, например, из шламма отстойника в качестве инокулярной среды при использовании 6метилникотиновой кислоты вырастить биомассу, то в результате можно получить использующие 6метилникотиновую кислоту микроорганизмы, т.е. микроорганизмы, способные расти и развиваться с 6метилникотиновой кислотой как единственным источником углерода, азота и источником энергии. При селекционировании микроорганизмов с использованием известных специалистам методов (речь идет о микроорганизмах, полностью разлагающих 6-метилникотиновуто кислоту через 2-гидрокси-6-метилникотиновую
кислоту в качестве промежуточного продукта) получаются микроорганизмы, содержащие специфическую
гидроксилазу, т.е. микроорганизмы, специфически гидроксилирующие единственный углеродный атом, расположенный между кислотной группой и атомом азота.
В принципе для данного метода могут быть использованы все виды микроорганизмов, селекционированные по данному принципу, например, из шлама отстойников или проб почвы. Эти микроорганизмы не описаны в литературе и являются составной частью изобретения.
Более целесообразным представляется использование микроорганизмов, известных под названием Ki101
(германская коллекция микроорганизмов), а также их потомства и мутантов. Последние зарегистрированы в
Германской коллекции микроорганизмов и клеточных культур, ГмбХ, Машеродервег1б, Д-3300 Брауншвейг
от 10.2.1992.
Приведем результаты научно-технических исследований культуры Ki101 (Германская коллекция микроорганизмов 6920).
Форма клеток
ничтожно мелкие палочки
3
BY 3961 C1
Ширина, мкм
0,4-0,5
Длина, мкм
1,0-1,5
Подвижность
Жгутики
Грамм-реакция
Лизис под действием 3 % КОН
+
Аминопептидаза (Черни)
+
Споры
Оксидаза
+
Каталаза
+.
Через анализ последовательности 16 r-рибонуклеиновой кислоты род определить не удалось.
Селекция и культивирование такого типа микроорганизмов при использовании 6-метилникотиновой кислоты производились по известным каждому специалисту методам.
В процессе селекции целесообразно проводить "скрининг" микроорганизмов в аэробных условиях.
Во время "скрининга" микроорганизмы необходимо культивировать в состоянии покоя (не встряхивать!).
Целесообразно, если количество 6-метилникотиновой кислоты в стадии селекции и выращивания будет
составлять до 1 вес. %, предпочтительно до 0,5 вес. %.
Селекцию и выращивание рекомендуется проводить при рН в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6
до 8.
Температура на стадии селекции и культивирования должна поддерживаться на уровне 15-50 °С, предпочтительно от 25 до 40 °С.
Обычно селекция и культивирование проводятся в среде минеральных солей, предпочтительно в среде
минеральных солей, имеющей состав, приведенный в табл. 1.
Если делаемая оптическая плотность при 650 нм (ОП650) составляет от 0,5 до 100, то микроорганизмы
либо отбирают с применением известных специалистам методов, либо субстрат, азотсодержащую гетероциклическую кислоту, непосредственно добавляют в среду микроорганизмов для проведения указанной реакции (биотрансформации).
Собственно биотрансформация протекает в дальнейшем в соответствии с известными методами при использовании нерастущих клеток.
В качестве субстратов с общей формулой II могут быть использованы, например, никотиновая кислота,
пиразинкарбоновая кислота или их галоидированные или C1-4-алкилированные производные.
В качестве производных никотиновой или паразинкарбоновой кислот предпочтительно использование
гидроксилированных
6-хлорникотиновой
кислоты,
5,6-дихлорникотиновой
кислоты
и
5хлорпиразинкарбоновой кислоты.
В качестве производных C1-4-пиразинкарбоновой кислоты лучше всего гидроксилируется 5метилпиразинкарбоновая кислота.
Субстрат для биотрансформации можно вводить непрерывно или за один раз. Наиболее целесообразным
представляется такое добавление субстрата, чтобы его концентрация в культурной среде не превышала
предпочтительно 7 вес. %.
В качестве среды для биотрансформации можно применять обычные хорошо известные специалисту среды. Процесс биотрансформации предпочтительно проводить в низкомолекулярном фосфатном буфере.
Обычно биотрансформацию проводят при использовании суспензии микроорганизмов, имеющих оптическую плотность при 650 нм (ОП650) в пределах от 0,5 до 100, предпочтительнее от 5 до 50.
Биотрансформацию рекомендуется проводить при температуре от 15 до 50 °С, предпочтительнее от 25 до
35 °С, и рН от 5 до 9, предпочтительно от 6,5 до 7,5.
Обычная продолжительность процесса от 5 часов до 3 дней, после чего гидроксилированный продукт,
соответствующий формуле 1, выделяется при использовании известных специалистам методов, например
путем подкисления не содержащего клеточной культуры верхнего слоя.
Полученные по данному методу гидроксиазотсодержащие гетероциклические карбоновые кислоты с общей формулой I:
, (I)
где X - атом азота, R1 и R2 могут иметь одинаковое или различное значение и могут представлять собой атом
водорода, атом галогена или С1-4-алкильную группу, исключая вариант, когда R1 и R2 вместе - водород, а
также в случае, если X - CH-группа, R1 и R2 - атом галогена, в литературе не описаны.
4
BY 3961 C1
Наиболее предпочтительными представителями этой новой группы соединений можно считать 5,6дихлор-2-гидроксиникотиновую кислоту, 3-гидрокси-5-метилпиразинкарбоновуто кислоту и 3-гидрокси-5хлорпиразинкарбоновую кислоту.
Пример 1.
Выделение микроорганизмов, использующих 6-метилникотиновую кислоту.
В 300-мл колбу Эрленмейера загружали 100 мл среды минеральных солей, содержащей 1 ммоль 6метилникотиновой кислоты (табл. 1) и добавляли 10 мл шламма из отстойника с очистительных сооружений
фирмы Лонца АГ в местечке Весп, Швейцария, или же пробы грунта с предприятий Лонца в Веспе, после
чего выдерживали, не оказывая никакого воздействия, при 30 °С. Через 10 дней в нескольких загрузках с
помощью спектрофотометрического метода определяли 2-гидрокси-6-метилникотиновую кислоту. Затем эти
культуры повторно прививали несколько раз в свежую среду минеральных солей. После этого в ту же среду
вводили путем смазывания образующую 2-гидрокси-6-метилникотиновую кислоту клеточную культуру, содержащую 1,6 вес.% (об/об) агар-агара. Затем пластинки агара инкубировали при 30 °С в атмосфере, содержащей 4 % O2 и 96 % N2. Отдельные колонии трансферировали в жидкую среду и выдерживали в состоянии
покоя. Штамм бактерии, известный под названием Ki101 (Германская коллекция микроорганизмов 6920), в
процессе роста на культуре 6-метилникотиновой кислоты давал 2-гидрокси-6-метилникотиновую кислоту.
Пример 2.
Микробиологическое окисление никотиновой кислоты в 2-гидроксиникотиновую кислоту.
Микроорганизмы Ki101 (ГКМ 6920) выращивались в среде минеральных солей (800 мл) (табл. 1) при добавлении 8 ммолей 6-метилникотиновой кислоты в 1-литровой колбе Фернбаха при 30 °С при использовании
шейкера 100 об/мин. Инокулят составил 5 % (об/об). Через 5 дней оптическая плотность достигала около 0,5.
Затем клеточную культуру снимали и промывали один раз фосфатным буфером (50-молярным) при рН 7,0.
Повторно суспендировали клетки в 20 мл 50 ммоль фосфатного буфера, содержащего 200 мг (1,38 ммолей)
натриевой соли никотиновой кислоты. Оптическая плотность (ОП650) составила 20. Через 6 часов инкубации
на шейкере при 30 °С методом тонкослойной хроматографии следов никотиновой кислоты обнаружить не
удалось. После этого биомассу отделяли на центрифуге, верхний слой подкисляли, доводя рН до 2,5, с целью
осаждения 2-гидроксиникотиновой кислоты.
С помощью метода 1Н-ЯМР (DMSO) никаких примесей в выделенном продукте определить не удалось. В
общей сложности удалось получить 140 мг (1 ммоль) 2-гидроксиникотиновой кислоты, что соответствовало
выходу 72 % на введенную никотиновую кислоту.
Таблица 1
Растворы среды минеральных солей
Раствор 1 по Штоку:
NaH2PO4· . 2H2O
156 г
NH4Cl
10,0 г
K2SO4
1,2 г
рН с помощью КОН устанавливается на уровне
7,0
Дистиллированная вода
500,0 мл
Раствор 2 по Штоку:
п-аминобензойная кислота
8,0 мг
D-биотин
2,0 мг
Никотиновая кислота
20,0 мг
Ca-D-пантотенат
10,0 мг
Пиридоксальгидрохлорид
30,0 мг
Тиаминдихлорид
20,0 мг
Цианокобальамин
10,0 мг
Дистиллированная вода 100,0 мл, фильтрованная в стерильных условиях.
Раствор 3 по Штоку:
HCl (37 %)
7,0 мл
FeCl2•4H2O
1,5 г
ZnCl2
0,07 г
MnCl2•4H2O
0,1 г
Н3ВО3
0,006 г
CoCl2•6H2O
0,19 г
CuCl2•7H2O
0,002 г
NiCl2•6H2O
0,024 г
Na2MoO4•2H2O
0,036 г
Дистиллированная вода 1000,0 мл, обработанная в автоклаве при 121 °С в течение 20 мин
5
BY 3961 C1
Раствор 4 по Штоку:
NaOH
0,5 г
Na2SeO3•5H2O
0,003 г
Na2WO4
0,004 г
Дистиллированная вода 1000,0 мл, обработанная в автоклаве при 121 °С в течение 20 мин
Раствор 5 по Штоку:
MgCl2•6H2O
40,0 г
CaCl2•2H2O
5,0 г
Дистиллированная вода 200 мл, обработанная в автоклаве при 121 °С в течение 20 мин
6-метилникотиновая кислота (500 мМ)
Натриевая соль 6-метилникотиновой кислоты
80,0 г
Дистиллированная вода 1000,0 мл, обработанная в автоклаве при 121 °С в течение 20 мин
Среда для роста 10 ммоль 6-метилникотиновой кислоты:
раствор 1
25,0 мл
6-метилникотиновая кислота
20,0 мл
Дистиллированная вода 1000,0 мл, обработанная в автоклаве при 121 °С в течение 20 мин
После стерилизации добавляли:
раствор 2
0,5 мл
раствор 3
1,0 мл
раствор 4
1,0 мл
раствор 5
0,5 мл
6
Таблица 2
Примеры 3-7 проведены аналогично примеру 2.
Результаты приведены в табл. 2.
Прим.
3
4
5
6
Натриевая соль 5хлорпиразинкарбоновой кислоты
Концентр.
ОП650, нм
Время, час
Продукт
Выход, %
1 % (вес/об)
20
16
6-хлор-2-гидроксиникотиновая кислота
70 % (выделено)
1 % (вес/об)
20
16
5,6-дихлор-2-гидроксиникотиновая кислота
20 % (аналит.)
0,3 % (вес/об)
5
24
3-гидроксипиразинкарбоновая кислота
70 % (аналит.)
0,3 % (вес/об)
5
24
3-гидрокси-5-метилпиразинкарбоновая
кислота
80 % (аналит.)
0,3 % (вес/об)
0,3 % (вес/об)
24
3-гидрокси-5-хлорпиразинкарбоновая кислота
50 % (аналит.)
7
BY 3961 C1
7
Исходный материал
Натриевая соль 6-хлорникотиновой кислоты
Натриевая соль 5,6-дихлорникотиновой
кислоты
Натриевая соль пиразинкарбоновой кислоты
Натриевая соль 5метилпиразинкарбоновой кислоты
BY 3961 C1
Данные анализа к примеру 6:
(3-гидрокси-5-метилпиразинкарбоновая кислота)
1
Н-ЯМР: (DMSO, 400 мгерц) δ в частях на миллион
2,4,s; 2,6,s; 3,8,s; 7,8,s.
13
С-ЯМР: (DMSO, 100,5 мгерц) δ в частях на миллион
20,t; 40,m; 130,s; 134,s; 155,s; 164,s; 170,s.
Данные анализа к примеру 7:
(3-гидрокси-5-хлорпиразинкарбоновая кислота)
1
Н-ЯМР: (D2O и диоксан, 400 мгерц) δ в частях на миллион
3,8,s; 4,7,s; 8,0,s.
13
С-ЯМР: (D2O и диоксан, 100,5 мгерц) δ в частях на миллион
132,s; 133,s: 145,s; 149,s; 164,s; 172,s.
Государственный патентный комитет Республики Беларусь.
220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66.
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
156 Кб
Теги
патент, by3961
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа