close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY3962

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(19)
BY (11) 3962
(13)
C1
7
(51) A 01N 63/00
(12)
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ
КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ
(54)
ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS SUBTILIS КМБУ 30043 - АНТАГОНИСТ
ФИТОПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ
(21) Номер заявки: 970673
(22) 1997.12.04
(46) 2001.06.30
(71) Заявитель: Белорусский
государственный
университет (BY)
(72) Авторы: Максимова Н.П., Ерома Б.Л., Комарова
М.С., Маслак Д.В., Лысак В.В. (BY)
(73) Патентообладатель: Белорусский
государственный университет (BY)
(57)
Штамм бактерий Bacillus subtilis КМБУ 30043 - антагонист фитопатогенных микроорганизмов.
BY 3962 C1
(56)
SU 1738200 A1, 1992.
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению средств защиты растений, и касается
штамма бактерий, который оказывает антагонистическое действие на фитопатогенные грибы и бактерии и
может быть использован в сельском хозяйстве для защиты растений от заболеваний.
Известен штамм бактерий Bacillus subtilis для получения препарата для защиты яблок и винограда от
гнили при хранении (А. с. СССР 1706504, МПК А 01N 63/00, 1992). Однако данный штамм не предназначен
для защиты растений в течение вегетационного периода.
Известен штамм бактерий Bacillus subtilis, активный против Fusarium oxysporum и некоторых других возбудителей болезней хлопчатника грибной этиологии (А. с. СССР 1717156, МПК А 01N 63/00, 1992). Однако
он не обладает активностью против бактериальных инфекций.
Известен штамм бактерий Bacillus lichenifbrmis, активный против возбудителей белой гнили подсолнечника (Патент России 2032345, МПК А 01N 63/00, 1995). Недостатком данного штамма является узкий спектр
антимикробной активности, особенно в отношении бактериальных инфекций.
Известен штамм Bacillus pumilus ВКМ CR-333D, активный против фитопатогенных бактерий родов Erwinia, Pseudomonas, Agrobacterium (А. с. СССР 1817875, МПК А 01N 63/00, 1995). Однако данный штамм не
обладает активностью против возбудителей болезней растений грибной этиологии.
Недостатком всех выше перечисленных штаммов является узкий спектр антифунгальной или антибактериальной активности.
Наиболее близким к заявляемому является штамм бактерий Bacillus subtilis ЦМПМ В-2895, предложенный для борьбы с возбудителем серой гнили земляники Botrytis cinerea. (А. с. СССР 1738200, МПК А 01 N
63/00, 1992). Показана также его активность против ряда других грибов и бактерий. Однако большинство из
них не являются фитопатогенными. Кроме того, в отношении указанных микроорганизмов бактерии
В.subtilis ЦМПМ В-2895 проявляют невысокую антагонистическую активность.
Цель изобретения - выделение природного высокоактивного штамма Bacillus subtilis с широким спектром
антагонистического действия в отношении фитопатогенных грибов и бактерий.
Штамм Bacillus subtilis 494 выделен из почвы в Беларуси в 1994 г.
Штамм депонирован в Коллекции микроорганизмов Белорусского государственного университета под
номером КМБУ 30043.
BY 3962 C1
Штамм Bacillus subtilis КМБУ 30043 имеет следующие характеристики.
Культурально-морфологические признаки. Клетки палочковидные с закругленными концами, 3-5х0,50,9 мкм, грамположительные, подвижные. Капсулы не образуют. Споры образуют. Споры эллиптические,
расположены центрально, спорангий не раздувают.
На агаризованных средах (среде Спицайзена, М9, МПА) через 24-36 ч образуют макроколонии диаметром 3-4 мм, округлые, беловато-серые, складчатые, с неровным лопастным краем, матовые, непрозрачные.
Рост по уколу в МПА умеренный, в основном поверхностный. При культивировании в жидких средах образуют поверхностную пленку, плотную, серовато-белую, складчатую.
Хорошо растет на минеральных средах простого состава, не нуждается в добавлении факторов роста и
аминокислот.
Физиолого-биохимические признаки. По отношению к кислороду - облигатный аэроб. Температурный
диапазон роста 15-45 °С. Оптимальная температура 30 °С.
Оптимум рН 6-8. Способен к росту на среде с 10 % содержанием NaCl.
Азот утилизирует в виде солей аммония, нитратов, мочевины.
Пигментов не образует.
Реакция на оксидазу отрицательная, на каталазу положительная. Реакция Фогеса-Проскауэра положительная. Фенилаланин не дезаминирует. Индол, аммиак, сероводород не образует. Лецитиназная активность
отсутствует. Нитраты восстанавливает до нитритов.
Желатину разжижает. Гидролизует крахмал, казеин, целлюлозу, ДНК. Не гидролизует пектин и Твин-80.
На среде с 5 % сахарозой образует леван.
В качестве источника углерода использует арабинозу, фруктозу, галактозу, глюкозу, глицерин, инозит,
лактозу, мальтозу, маннозу, раффинозу, сорбит, сахарозу, ксилозу, цитрат, формиат, лактат, сукцинат, этанол. Не утилизирует дульцит, рамнозу, ацетат, тирозин.
Штамм чувствителен к хлорамфениколу, налидиксовой кислоте, канамицину, тетрациклину. Устойчив к
рифампицину (100 мкг/мл), стрептомицину (50 мкг/мл), ампициллину (50 мкг/мл).
Штамм идентифицирован как Bacillus subtilis согласно определителю "Bergey's mannual of determinative
bacteriology"(9th ed., Baltimore: Williams & Wilkins Co., v. 2, 1989).
Штамм хранится на косяках МПА при 4 °С с пересевом 1 раз в месяц или на агаризованной среде Спицайзена под слоем стерильного вазелинового масла при той же температуре с пересевом 1 раз в год.
Штамм В. subtilis КМБУ 30043 не патогенен для растений. Патогенность штамма проверяют с помощью
реакции сверхчувствительности на листьях бобов (Vicia faba L.). Суспензию клеток штамма (108 клеток в 0.5
мл) в стерильной дистиллированной воде вводят шприцем под кожицу листа. Реакция сверхчувствительности для бактерий В. subtilis КМБУ 30043 отрицательная.
Штамм В. subtilis КМБУ 30043 не патогенен для теплокровных животных. При введении белым мышам
массой 16-20 г перорально и внутрибрюшинно по 0.5 мл взеси суточной культуры с титром 109 клеток/мл в
3-кратной повторности при последующем наблюдении в течение 24 суток павших животных не было, поведение и аппетит оставались в норме. Выборочное вскрытие животных показало отсутствие каких-либо скрытых поражений внутренних органов.
Штамм В. subtilis КМБУ 30043 не фитотоксичен. Фитотоксичность штамма проверяют экспресс-методом
на культуре хлореллы (Chlorella vulgaris). Для этого суспензию клеток хлореллы в стерильной дистиллированной воде вносят в концентрации 106 клеток/мл в расплавленную и охлажденную агаризованную среду с
глюкозой (0.2 %) и разливают в чашки Петри. Бактерии В. subtilis КМБУ 30043 засевают в виде "медальона"
диаметром 0,5 мм по центру чашки и культивируют в течение 24 ч при 28 °С, после чего чашки помещают в
светотеплицу и инкубируют на свету при той же температуре 72 ч для роста хлореллы. Отсутствие зон задержки роста водоросли вокруг колонии бактерий В. subtilis КМБУ 30043 свидетельствует о его нетоксичности для растений.
Штамм В. subtilis КМБУ 30043 не снижает всхожести семян сельскохозяйственных растений. Для проверки семена различных растений замачивают в суспензии штамма в концентрации 107 клеток/мл на 1 г сухих семян, помещают во влажную камеру в светотеплицу и проращивают в течение 3-10 суток в зависимости
от вида испытуемых растений. В качестве контроля семена замачивают в дистиллированной воде. Всхожесть
семян после обработки суспензией штамма В. subtilis КМБУ 30043 по сравнению с контролем составляла
100 %.
Штамм способен к колонизации ризосферы и вегетативных органов растений. Для проверки семена растений перед посевом обрабатывают суспензией суточной культуры бактерий, выращенных на агаризованной
глюкозо-солевой среде М9 при 28 °С, с титром 5х106 клеток/мл. Обработанные семена выдерживают в течение 48 ч при 28 °С, после чего вносят в нестерильную почву и выращивают в течение 2 месяцев. Результаты
учитывают через 1, 1,5, и 2 месяца путем определения количества бактерий в средней пробе образцов. Среднюю пробу получают из трех отдельностоящих растений при смешивании их проростков или корней. Из полученного среднего образца делают навеску в 1 г, переносят ее в 5 мл стерильной дистиллированной воды и
ресуспендируют. Полученную суспензию из соответствующих разведении высевают по 0.1 мл на селектив2
BY 3962 C1
ную среду со стрептомицином (50 мкг/мл) и культивируют в течение 48 часов при 28 °С, затем подсчитывают количество сформировавшихся колоний исследуемых бактерий. Учитывают только те бактериальные колонии, морфология которых не отличается от контроля. Результаты экспериментов представлены в табл. 1.
Штамм В. subtilis КМБУ 30043 обладает антагонистической активностью в отношении фитопатогенных
бактерий родов Corynebacterium, Erwinia, Pseudomonas, Xanthomonas и других, в числе которых есть как
грамположительные, так и грамотрицательные бактерии. Всего было проверено 190 штаммов, среди которых не было обнаружено ни одного фитопатогенного штамма, устойчивого к действию В. subtilis КМБУ
30043.
Штамм В. subtilis КМБУ 30043 обладает выраженной антифунгальной активностью в отношении фитопатогенных грибов родов Alternaria, Ascochita, Botrytis, Fusarium, Trichoderma, Phytophtora и других. Всего было проверено 23 штамма, среди которых также не обнаружено фитопатогенов, устойчивых к действию В.
subtilis КМБУ 30043.
Штамм В. subtilis КМБУ 30043 пригоден к использованию в условиях сельскохозяйственного производства. При испытаниях штамма в условиях закрытого и открытого грунта было установлено, что применение
препарата В. subtilis КМБУ 30043 значительно снижает поражение растений томатов и огурцов бактериозами, вызываемыми Erwinia aroidea, Corynebacterium michiganense, Pseudomonas solanacearum, Agrobacterium
sp., а также грибными инфекциями, вызываемыми Pseudomonospora cubensis, Ascochita cucumis и др. Также
отмечен положительный эффект препарата В. subtilis КМБУ 30043 в борьбе с инфекционным полеганием сеянцев женьшеня.
Полезные свойства штамма В. subtilis КМБУ 30043 иллюстрируются следующими примерами.
Пример 1.
Для изучения антибактериальной активности штамм В.subtilis КМБУ 30043 высевают пятнами (диаметр
3-5 мм) на поверхность 1,5 % агаризованной среды М9. Образовавшиеся макроколонии (время инкубации
48 ч при 28 °С) обрабатывают парами хлороформа в течение 30 мин, проветривают и заливают слоем
0.7 % агаризованной среды М9 с индикаторной культурой фитопатогенных бактерий (0.1 мл индикаторной
культуры в стационарной фазе роста на 5 мл охлажденной до 45 °С среды). Учет результатов проводят по
наличию или отсутствию зон подавления роста индикаторной культуры вокруг макроколоний исследуемого штамма через 24 ч инкубирования при 28 °С. Результаты измерений приведены в табл. 2.
Пример 2.
Для изучения антифунгальной активности штамма В. subtilis КМБУ 30043 бактерии высевают на картофельно-глюкозную агаризованную среду кольцом диаметром 40 мм, инкубируют 24 ч при 28 °С. В центр
сформировавшегося бактериального кольца засевают культуру фитопатогенного гриба, инкубируют при
комнатной температуре 25 суток с периодическим учетом диаметра мицелия и характера роста гриба. Затем
определяют степень подавления генеративной функции гриба. Для этого делают серию высевов спор, образовавшихся на мицелии, находящемся внутри кольца бактерий. Контролем во всех опытах служат чашки, засеянные чистой культурой гриба. Результаты, представленные в табл. 3 и 4, свидетельствуют о высокой антагонистической активности В. subtilis КМБУ 30043 в отношении широкого спектра фитопатогенных
грибов.
Пример 3.
Для проверки эффективности использования препарата Bacillus subtilis КМБУ 30043 в борьбе с инфекционным полеганием сеянцев женьшеня в условиях открытого грунта бактерии исследуемого штамма выращивают
36 ч при 28 °С с аэрацией в жидкой модифицированной среде Спицайзена, содержащей (%) К2НРO4 0,7,
NaH2PO4 0,35, NH4Cl 0,2, Na цитрат 0,1, MgSО4x7H20 0,01, глюкозы 0,5. Полученную взвесь с титром -8х107
клеток/мл разводят водой в 100 раз. Полученный раствор используют для замочки семян (24 ч) и опрыскивания рассады. Количество обработок за сезон - 3, норма расхода препарата - 3 л/м2. В результате установлено,
что применение препарата В.subtilis КМБУ 30043 снижает количество выпадов с 18-23 % до 5-7 % (т.е. в
3-4 раза), а всхожесть обработанных препаратом семян повышается с 64,1 % до 83,3 %. Полученные данные
свидетельствуют о высокой эффективности применения препарата штамма Bacillus subtilis КМБУ 30043 для
профилактики инфекционного полегания женьшеня, где недопустимо использование химических средств
защиты растений и фитостимуляторов.
Пример 4.
Для проверки эффективности применения препарата В subtilis КМБУ 30043 для борьбы с болезнями
овощных культур в условиях закрытого грунта в 1995-1996 гг. были проведены испытания препарата в с-зе
"Минская овощная фабрика" и Минском парниково-тепличном комбинате на томатах сортов "Рубика" и
"Перамога", огурцах сортов НИИОХ-412 и ТСХА-98. Закладку и проведение эксперимента осуществляли по
методике Б. А. Доспехова, учеты на пораженность болезнями - по "Методическим указаниям по государственным испытаниям фунгицидов, антибиотиков и протравителей семян сельскохозяйственных культур"
(1985). Препарат B. subtilis КМБУ 30043 готовят по методике, описанной в Примере 3. Обработка растений
включает следующие этапы:
3
BY 3962 C1
а) замочка семян в препарате (24 ч);
б) двукратное опрыскивание рассады;
в) подлив бактериальной суспензии под корни растений через 12 дней после высадки в грунт;
г) двукратное опрыскивание вегетирующих растений с интервалом в 15-20 дней, начиная с фазы завязывания плодов.
За эталон брали биопрепарат "Триходермин" и химический препарат "Превикур". Результаты испытаний
проставлены в табл. 5.
Таким образом, штамм Bacillus subtilis КМБУ 30043 обладает выраженной антагонистической активностью против широкого спектра фитопатогенных бактерий и грибов и может успешно использоваться для
комплексной защиты сельскохозяйственных культур от болезней.
Таблица 1
Способность штамма B. subtilis КМБУ 30043 к колонизации ризосферы и филлосферы растений
Части растения
Вегетативные органы
Корневая система
Количество бактерий В. subtilis КМБУ 30043, клеток/г биомассы
через 1 мес.
через 1,5 мес.
через 2 мес.
4х105
1,6х105
6,2х105
3
9,1х10
7,8х104
3,3×104
Таблица 2
Спектр антибактериальной активности штамма В. subtilis КМБУ 30043
Количество штаммов
проверенных
чувствительных
4
4
Виды бактерий
Bacillus idosus, megaterium, mycoides,
thuringiensis
Corynebacterium glutamicum, insidiosum,
michiganese, sepedonicum, Corynebacterium sp.
Clostridium pasteurianum, Clostridium sp.
Escherichia coli
Erwinia aroidea, atroseptica, carotovora, chrysanthemi,
herbicola, nimipressuralis, Erwinia spp.
Mycobacterium lacticola, rubrum
Pseudomonas corrugata, lachrymans
Proteus vulgaris
Salmonella sp.
Streptococcus aureus, saprophyticus
Xanthomonas beticola, campestris
Всего
25
25
2
2
91
2
2
91
2
64
1
1
2
7
190
2
64
1
1
2
7
190
Примечание: чувствительными считались культуры с диаметром зон задержки роста 10 мм и более.
Таблица 3
Спектр антифунгальной активности штамма Bacillus subtilis КМБУ 30043
Количество штаммов
проверенных
чувствительных
4
4
1
1
3
3
4
4
Виды грибов
Alternaria alternata, раnах, solani, Alternaria sp.
Aspergillus sp.
Botrytis cinerea
Fusarium culmorum, oxysporum, sambucinum, Fusarium sp.
Hansenula aromatica
Penicillum sp.
Phytophtora spp.
Saccharomyces cerevisiae, oleaceus
Trichoderma viride, polysporum
Ulocladium consortiale
Всего
1
1
4
2
2
1
23
4
1
1
4
2
2
1
23
BY 3962 C1
Таблица 4
Подавление жизнеспособности спор фитопатогенных грибов штаммом Bacillus subtilis КМБУ 30043
Проба
Споры с мицелия, подвергавшегося
воздействию В. subtilis КМБУ 30043.
Споры чистой культуры гриба
(контроль)
Интенсивность прорастания спор фитопатогенных грибов,
х106
Alternaria solani
Fusarium
Botrytis cynerea
oxysporum
2,1
3,2
2,7
5,3
6,1
6,5
Таблица 5
Результаты испытаний штамма Bacillus subtilis КМБУ 30043 в условиях закрытого грунта
Заболевание растений и/или возбудитель
Бактериальный рак, Agrobacterium sp.
Черная ножка, Erwinia aroidea
Pseudomonas solanacearum
Corynebacterium michiganense
Ложная мучнистая роса, Pseudoperonospora cubensis
Корневые гнили огурцов
Серая гниль томатов
Аскохитоз, Ascochita cucumis
Государственный патентный комитет Республики Беларусь.
220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66.
5
Снижение заболеваемости растений, %
98,1
95,6
93,1
82,5
80,2
76,4
72,4
57,6
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
164 Кб
Теги
by3962, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа