close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY4174

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(19)
BY (11) 4174
(13)
C1
7
(51) A 61K 38/00,
(12)
A 61K 47/00
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ
КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ
(54)
БАКТЕРИЦИДНАЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СПОСОБ
ЛЕЧЕНИЯ
(21) Номер заявки: 2102
(22) 1994.07.15
(86) PCT/US93/00377, 1993.01.15
(31) 07/822,433, 07/866.135
(32) 1992.01.17, 1992.04.09
(33) US
(46) 2001.12.30
(71) Заявитель: АМБИ Инк. (US)
(72) Авторы: БЛЭКБУРН Питер, ПРОДЖАН Стивен
Дж., ГОЛЬДБЕРГ Эдвард Б. (US)
(73) Патентообладатель: АМБИ Инк. (US)
BY 4174 C1
(57)
1. Бактерицидная фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество лантионинсодержащего бактериоцина и фармацевтически приемлемый носитель, отличающаяся тем, что дополнительно
содержит кислотный носитель в количестве 0,1 - 3,0 % с pН 2,0-5,0.
2. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит хелатирующий агент.
3. Композиция по п. 2, отличающаяся тем, что в качестве хелатирующего агента она содержит цитрат.
4. Композиция по п. 2, отличающаяся тем, что в качестве хелатирующего агента она содержит ЭДТК.
5. Композиция по п. 2, отличающаяся тем, что в качестве хелатирующего агента она содержит цитрат и
ЭДТК.
6. Композиция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что бактериоцин выбран из группы, состоящей из низина, субтилина, эпидермина, пеп 5, анковенина, галлидермина, дуромицина или циннамицина.
7. Композиция по п. 6, отличающаяся тем, что в качестве бактериоцина она содержит низин.
8. Композиция по п. 2, отличающаяся тем, что в качестве бактериоцина она содержит низин, а в качестве хелатирующего агента - цитрат или ЭДТК.
9. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что кислотный носитель выбран из группы, состоящей из
ацетата, пропионата, цитрата, лактата, сукцината, фумарата, малоната, адипата, сорбата, фосфата или аскорбата.
10. Способ лечения или профилактики желудочно-кишечных заболеваний, вызванных патогенными микроорганизмами, отличающийся тем, что используют фармацевтическую композицию по любому из пп. 1-9,
в терапевтически эффективном количестве.
11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что заболевание вызвано грамотрицательными бактериями.
12. Способ по п. 10, отличающийся тем, что микроорганизмы представляют собой разновидность Helicobacter, Salmonella, Escherichia, Clostridia, Bacillus, Bacteroides, Campylobacter или Yersinia.
13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что микроорганизмы представляют собой Helicobacter pylori
или Campylobacter jejuni.
14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что используют фармацевтическую композицию по п. 7.
(56)
WO 89/12399 A1.
Изобретение относится к области медицины, в частности к бактерицидным фармацевтическим композициям и способам лечения ими желудочно-кишечных заболеваний.
Различные желудочно-кишечные заболевания или симптомы, включая диарею, гастрит, пептическую и
дуоденальную язву и гастральную карциному, являются результатом присутствия в желудочно-кишечном
тракте патогенных микроорганизмов. Эшерихия и сальмонелла, в частности, а также определенные виды
клостридии, бациллы, бактероида и ерсинии могут являться причиной диареи особенно у новорожденных
сельскохозяйственных животных (R.E. Голландия, 1990. Клиническая микробиология. Обзор 3:345, "Случаи
инфекционной диареи среди сельскохозяйственного молодняка"). Можно говорить о причастности гелико-
BY 4174 C1
бактер пилори (Helicobacter pylori) к гастриту, дуоденальной и пептической язвенной болезни (Петерсон,
В.Л., 1991, Новая Англия, журнал "Медицина" 324:1043, "Геликобактер пилори и пептическая язвенная болезнь"), а также об их связи с гастральной карциномой (Хендерсон, Б.Е., Росс, Р. К. и Пайк, М.К., 1991, Наука 254:1131, "О первичной профилактике рака"; Номура, А., Штемерманн, Г.А., Кайеу, П.Х., Като, И., Перец-Перец, Г. и Блейзер, М.Дж. (1991) Новая Англия, журнал "Медицина", 325:1132 "Инфекция
геликобактер пилори и гастральная карцинома среди японских американцев на Гаваях"; Парсоннет, Дж„
Фридман, Г.Д., Вандерштин, Д.П., Чан, Й., Фогелман, Дж.Х., Орентрайх, Н. и Сибли, Р.К. (1991) Новая Англия, журнал "Медицина" 325:1127; Форман, Д., Сайтас, Ф., Ньэлл, Д.Г., Стейси, А.Р., Борэм, Дж.Пето, Р.,
Кэмпбелл, Т.К., Ли, Дж. и Чень, Дж. (1990) Международный журнал "Рак" 46:608 "Географическая связь
распространенности антител геликобактер пилори и смертности в результате заболевания гастральным раком в сельской местности Китая").
Многие желудочно-кишечные патогенные организмы являются грамотрицательными бактериями, по отношению к которым низин обычно считался инертным (Херст, А., 1981, "Низин", Достижения в области
прикладной микробиологии, том 27, стр. 85-121). Например, Helicobacter pylori (который на предшествующем уровне техники также идентифицировался как Campylobacter pylori) представляет собой грамотрицательную микроаэрофильную бациллу, которая колонизирует гастральную мукозу. Со времени первой публикации в связи с гистологическим гастритом (1983 г.) отмечалась зависимость между подавлением инфекции
H.pylori и улучшением в сфере гастральных нарушений, однако несмотря на то, что испытывались многочисленные антибиотики против инфекции Helicobacter pylori ни один из них не получил подтверждения приемлемого и ни один агент или режим не был одобрен для применения против этой бактерии. В редких случаях добивались искоренения этого организма при долгосрочном применении антибиотиков, которые сами по
себе могли продуцировать неприемлемые побочные эффекты (Петерсон, B.Ë., 1991, Новая Англия, журнал
"Медицина" 324:1043 "Helicobacter pylori и пептическая язвенная болезнь", Уоррен, Дж.Р., 1983, Ланцет
1:1273, "Неопознанные изогнутые бациллы на гастральном эпителии при активном хроническом гастрите";
Морган и др., 1988, Гастроэнтерология 95:1178, "Нитрофураны при лечении гастрита в связи с Campylobacter pylori; Глупцинский, У. и др. 1988, американский журнал "Гастроэнтерология" 83:365 "Гастрит в связи с
Campylobacter pylori: испытание амоксициллином, контролируемое двублиндированным плацебо"; Ровз, Е.А.
и др., 1988, Гастроэнтерология 94:33 "Хронический антральный активный гастрит в связи с Campylobacter
pylori"; Глупцинский, У. 1990, "Helicobacter pylori, гастрит и пептическая язва"; Малфертейнер, П., Дичунейт, Х., Изд. Шпрингер-Ферлаг, Берлин, Германия, стр. 49-58: Ровз, Е.А. и Титгат, Г.Н., 1990, Ланцет
335:1233 "Лечение дуоденальной язвы в связи с искоренением H.pylori"; О'Риордан, Т. и др., 1990, Пищеварительный канал 31:999, "Стимуляторная антибиотическая терапия в сфере дуоденальных язв, леченных
субцитратом коллоидного висмута"; Вейл, Дж. и др., 1990, Алиментарная фармакологическая терапия 4:651,
"Инфекция H.pylori, обработанная трехкалийным дицитратовисмутатом и соединением метронидазола";
Кофлан, Дж., Г., Гиллиган, Д., Хамфрис, X. и др., 1987, Ланцет 2:1109 "Campylobacter pylori и рецидив дуоденальной язвы - 12-месячное доскональное обследование"; Маршалл, Б.Дж., Гудвин, К.С., Уоррен, Дж.,Р.
и др., 1988, Ланцет 2:1437, "Возможное двублиндированное испытание рецидива дуоденальной язвы после
искоренения Campylobacter pylori").
Антимикробное действие лантионинсодержащего бактериоцинового низина ограничено по отношению к
определенным грамположительным микроорганизмам и является оптимальным при рН 5,0. Антимикробное
действие низина усиливается при применении его в комбинации с таким хелатором, как этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТК). Было обнаружено, что действие низин-хелаторных композиций значительно сильнее или оптимально при рН большем, чем 5,0. Например, было определено, что антимикробное действие
композиции, включающей низин и ЭДТК, в отношении золотистого стафилококка (Staphylococcus aureus)
значительно сильнее при рН 8,0, чем действие той же композиции на золотистый стафилококк при рН 5,0.
Было также обнаружено, что комбинация хелатора с низином является активнодействующей по отношению
к грамотрицательным бактериям, что обычно не свойственно самому низину.
Объектом изобретения является бактерицидная фармацевтическая композиция, содержащая эффективное
количество лантионинсодержащего бактериоцина и фармацевтически приемлемый носитель, который дополнительно содержит кислотный носитель в количестве 0,1-3,0 % с рН 2,0-5,0.
В предпочтительном варианте она дополнительно еще содержит хелатирующий агент.
В качестве хелатирующего агента она может содержать цитрат, ЭДТК либо цитрат и ЭДТК.
Предпочтительно бактериоцин выбирают из группы, состоящей из низина, субтилина, эпидермина, пеп 5,
анковенина, галлидермина, дуромицина или циннамицина, предпочтительно в качестве бактериоцина композиция содержит низин.
В наиболее предпочтительном варианте композиция в качестве бактериоцина содержит низин, а в качестве хелатирующего агента - цитрат или ЭДТК.
Предпочтительно кислотный носитель выбирают из группы, состоящей из ацетата, пропионата, цитрата,
лактата, сукцината, фумарата, малоната, адипата, сорбата, фосфата или аскорбата.
2
BY 4174 C1
Другим объектом изобретения является способ лечения или профилактики желудочно-кишечных заболеваний, вызванных патогенными микроорганизмами, в котором используют фармацевтическую композицию
по изобретению в терапевтически эффективном количестве.
Фармацевтическую композицию по изобретению предпочтительно используют для лечения или профилактики заболеваний, вызванных грамотрицательными бактериями, патогенными микроорганизмами, представляющими собой разновидность Helicobacter, Salmonella, Escherichia, Clostridia, Bacillus, Bacteroides,
Campylobacter или Yersinia, предпочтительно Helicobacter pylori или Campylobacter jejuni.
Лантионинсодержащие бактериоциновые композиции по изобретению активны при кислотном рН ниже
5,0 и проявляют значительную активность в отношении грамотрицательных бактерий. Эти активные при
низком рН композиции могут применяться, например, в методике лечения или профилактики инфекций или
роста микроорганизмов в желудочно-кишечном тракте человека и животных. Эти композиции, будучи введенными в желудочно-кишечный тракт, поведут себя как бактерициды даже в среде желудка с низким рН.
Это антибактериальное действие может быть использовано в сдерживании роста инфекций, вызванных такими болезнетворными организмами, как геликобактер (Helicobacter), эшерихия (Escherichia), сальмонелла
(Salmonella), бацилла (Bacillus), клостридия (Clostridia), бактероид (Bacteroides), кампилобактер (Campylobacter) и ерсиния (Yersinia). Такие бактериоциновые композиции, активные при низком рН, могут поэтому
применяться при лечении различных заболеваний или симптомов, вызванных присутствием этих патогенных
бактерий.
Фармацевтические низиновые композиции, согласно данному изобретению, являются быстросрабатывающими, так что после введения их в желудок и желудочно-кишечный тракт их активность не должна лимитироваться скоростью очищения содержания желудка. Более того, в отличие от антибиотиков, глотание
низиновых композиций безопасно. Фармацевтические композиции в лечебном режиме могут применяться
самостоятельно или в комбинации с другими фармацевтическими агентами или препаратами.
Эффективность настоящего изобретения была продемонстрирована на примере кишечных бактерий
E.coli, которые обнаруживаются в пищеварительном канале млекопитающих и нередко являются нарушителями правильной работы желудочно-кишечного тракта. Выживаемость E.coli остается неизменной после
воздействия на них ЭДТК или цитрата, а также после воздействия на них низина. Кроме того, суспензии
E.coli под воздействием кислоты прекрасно выживают в кислотной среде, если рН не падает ниже 2,5. Однако, как это изложено ниже, когда низин соединяется с ЭДТК в диапазоне значений кислотного рН, наблюдается значительное ослабление жизнеспособности бактерий после только одной минуты воздействия этих низиновых композиций. При рН 3,5 за счет низина можно отнести сокращение количества жизнеспособных
бактерий на более чем 6 логарифмов после подвергания их воздействию низин-хелаторных композиций в течение только одной минуты. При рН ниже 3,5 очевидно некоторое ослабление потенции низиновых композиций, но тем не менее остается приблизительное тысячекратное увеличение активности низина даже при рН
2,5 (табл. 1).
Низин, активированный ЭДТК, является бактерицидным по отношению к E.coli в присутствии разнообразных кислотных носителей, включая ацетат, цитрат, лактат и сукцинат, как показано в табл. 2-5. Как это
проиллюстрировано результатами, полученными при рН 3,5, быстрая бактерицидная активность низиновых
композиций может зависеть от выбора кислотного носителя. Во всех указанных случаях по мере увеличения
концентрации каждого кислотного аниона наблюдается уменьшение бактерицидной активности низиновых
соединений. Тем не менее каждый из этих кислотных носителей подходит для выражения активности низина
с холаторным усилением. Воздействие этих низиновых соединений на бактерии в течение периода времени
большего, чем одна минута, эффективно в отношении сокращения количества бактерий, даже если рецептурные состава содержат менее эффективные концентрации кислотных носителей.
Незамедлительная эффективность различных низиновых композиций с хелаторным усилением была оценена в кислотных носителях методой анализа бактерицидной суспензий.
Клетки E.coli от ночного триптиказового соевого питательного агара (TSA) ресуспендировались до плотности, измеряемой как абсорбция 1,0 при 600 nm в стерильном ddH2O. При анализе каждого пробного бактерицидного состава реакция клеток начиналась с добавлением к 970 µl пробного состава 30 µl клеток. Реакционная смесь инкубировалась при 37 °С в течение, по крайней мере, одной минуты, а затем
центрифугировалась в микрофуге в течение 1 мин. Клеточный осадок смывался ресуспензией в 1 µl нейтрализационного буфера. (Нейтрализационный буфер: 50 mM Tris -HCl pH 7,0; 5 mM MgSÎ4; 20 mM CaCl2; 0,1
M NaCl и 0,1 % желатина. Вначале был приготовлен Tris-буфер и отрегулирован pH. Затем добавлялись соли
и желатин и раствор помешивали при нагревании до состояния полной прозрачности. Далее раствор автоклавировался в течение 20 мин. Нейтрализованный буфер не разбавлялся.) Клетки центрифугировались в
микрофуге в течение одной минуты, а затем ресуспендировались в 1 ml нейтрализационного буфера. Количество жизнеспособных микроорганизмов определялось путем распластывания 100 µl бактериальной суспензии и ряда ее разведений в нейтрализационном буфере на питательный агар и подсчитывания выживающих колоний после 24 ч при 37 °С. Процентное выживание относительно необработанных стандартов
исчислялось от подсчитанных величин.
3
BY 4174 C1
Активность низина, усиленного ЭДТК, проявляется при низком pH. При pH ниже 3,5 степень усиления
снижается, предположительно, по мере титрования карбоксильных групп хелатора. Тем не менее наблюдалось тысячекратное усиление действия низина посредством ЭДТК даже при pH 2,5. См. результаты, представленные в табл. 1. В табл. 1 и последующих табл. 2, 4 и 8-13 величины с предшествующим знаком "<"
представляют выживаемость в процентном исчислении, основанную на исходной концентрации жизнеспособных бактерий (выраженных как колониеобразующие единицы (cfu)/ml) в анализируемой бактериальной
суспензии и в аликвотном объеме данной суспензии, взятом для анализа, соответствующем определению невыживаемости колоний.
Таблица 1
Зависимость активации (посредством ЭДТК) низина
в отношении Escherichia coli от кислотного рН
ЭДТК, mМ
Величина рН
Низин,
µg/ml
7,0
2,5
3,0
3,5
4,0
а
Выживаемость в % на 1 мин
0
0
100b
100
0
100
0,28
3,37
4,43
100
100
1,0
0
0,07
5,41
1,0
100
0,01
0,005
0,0007
<10-4
<10-4
а
- инкубации, производимые при 37 °С в 20 mM буфера (Na ацетат), отрегулированного по рН.
b
- исходное количество жизнеспособных микроорганизмов 4 х 107 колониеобразующих единиц/ml.
Таблица 2
Зависимость хелаторной активации низин-ацетата в отношении Escherichia coli
от концентрации ацетата
ЭДТК, ММ
2,0
Низин, µg/ml
0
(% вес/объем) ацетат рН 3,5
0,1
0,3
1,0
Выживаемость в % на 1 мина
55
80
90
9,6
70
100
40
25
25
0,0005
<10-4
0,02
3,0
0
0
100b
10,1
0
100
100
1,0
0
10,7
1,0
100
0,4
а
- инкубации, производимые при 37 °С.
b
- исходное количество жизнеспособных микроорганизмов 2 х 107 колониеобразующих единиц/ml.
Таблица 3
Зависимость хелаторной активации низин-цитрата
в отношении Escherichia coli от концентрации цитрата
ЭДТК,
ММ
Низин,
µg/ml
(% вес/объем) цитрат рН 3,5
0
0
0
1,0
1,0
а
b
0
100
0
100
100b
-
0,1
0,3
Выживаемость в % на 1 мина
100
56,3
0,003
0,0007
100
50,0
0,0006
0,0002
1,0
3,0
72,9
0,56
47,9
0,69
100
14,6
100
20,8
- инкубации, производимые при 37 °С.
- исходное количество жизнеспособных микроорганизмов 5 х 107 колониеобразующих единиц/ml.
4
BY 4174 C1
Таблица 4
Зависимость хелаторной активации низин-лактата
в отношении Escherichia coli от концентрации лактата
ЭДТК,
mМ
Низин,
µg/ml
(% вес/объем) лактат рН 3,5
0
0
0
1,0
1,0
а
b
100b
-
1,0
3,0
35,6
17,8
0,91
0,20
4,2
26,7
1,58
2,84
- инкубации, производимые при 37 °С.
- исходное количество жизнеспособных микроорганизмов 5 х 107 колониеобразующих единиц/ml.
Таблица 5
Зависимость хелаторной активации низин-сукцината
в отношении Escherichia coli от концентрации сукцината
ЭДТК,
mМ
0
0
1,0
1,0
0
100
0
100
0,1
0,3
Выживаемость в % на 1 мина
22,2
46,7
4,4
0,24
5,1
0,46
<10-4
0,02
Низин,
µg/ml
0
100
0
100
(% вес/объем) лактат pH 3,5
0
0,1
Выживаемость в % на 1 мина
100b
85,5
18,3
56,8
0,02
а
0,3
1,0
3,0
29,9
66,6
63,6
6,21
36,7
83,4
46,2
14,2
13,9
28,4
43,2
4,73
- инкубации, производимые при 37 °C.
- исходное количество жизнеспособных микроорганизмов 3,4 х 106 колониеобразующих единиц/ml.
При рН 3,5 активность низина, усиленная посредством ЭДТК, наблюдалась в присутствии всех испытываемых кислотных анионов (табл. 2-5). При рН 3,5 лактат при концентрации 0,3 % являлся до некоторой степени ингибитором активности низина, усиленного посредством ЭДТК. Тем не менее эта активность все же
остается усиленной более чем в 1000 раз, имея в виду только 0,3 %-ный лактат, а 0,1 %-ный лактат уже не
подавляет активность низина, усиленного посредством ЭДТК.
При рН 3,5 концентрация ацетата до 0,3 % и цитрата до 0,3 % проявляют свою совместимость с бактерицидной активностью низина с хелаторным усилением в отношении суспензий E.coli. Эти анионы проявляются как наиболее многообещающие в качестве кислотных носителей в составе низина, усиленного посредством ЭДТК. Цитрат - один из наиболее подходящих кислотных носителей для соединений низина, усиленного
посредством ЭДТК.
Цитрат является естественной кормовой субстанцией и промежуточным метаболитом, а также в своем
праве - эффективным усилителем бактерицидной активности низина (табл. 3). Можно надеяться, что соединения низин-цитрата будут безвредными и эффективными для сдерживания или устранения роста нежелаемых микроорганизмов в желудочно-кишечном тракте человека и животных.
Цитрат является метаболитом, он не подавляет рост бактерий, и бактерии растут прекрасно на питательном агаре с добавлением цитрата. Однако низин в присутствии цитрата проявляет активность в отношении
грамотрицательных бактерий. Таким образом, является возможным продемонстрировать активность низина
в отношении грамотрицательных бактерий путем произведения анализов на торможение роста на питательном агаре с добавлением различных концентраций цитрата. Этот анализ агара-низин-цитрата имеет гораздо
более широкое применение. Анализ предусматривает метод отбора потенциальных агентов, иных чем цитрат, в соединении с низином ради их потенциальных свойств, позволяющих им быть усилителями присущей низину бактерицидной активности.
Примеры других органических кислот в комбинации с низином - ацетат, пропинат, лактат, сукцинат, фумарат, малонат, адипат, сорбат, фосфат и аскорбат.
Другие агенты, потенционирующие активность низина, включают в себя неионогенные и амфотерные
поверхностно-активные вещества и эмульгаторы, четвертичные соединения, моноглицериды и жирные кислоты.
Низин-цитрат-агаровый анализ производится следующим образом. E.coli ресуспендируется до оптической плотности 1,0 при А600. Берется 100 µl пробы бактериальной суспензии и равномерно распластывается
на триптиказовый соевый питательный агар с различными концентрациями цитрата (например, 0,1 %, 0,3 %,
b
5
BY 4174 C1
1,0 %, 3,0 %), затем инкубируется в течение 1 ч при 37 °С. Потом готовится низиновый маточный раствор и
ряд его растворов, разведенных в 0,1 % альбумине бычьей сыворотки (BSA); далее берется по 5 µl от каждого раствора и помещается на газон с растущими бактериями. Пластинки (возможен вариант перевода "чашки". Прим. перев.) с TSA затем инкубируются в течение 24 ч при 37 °С. После 24 ч при 37 °С % E.coli, выращенные на TSA с добавлением цитрата, формируют сливающийся газон. Активность низина в отношении
бактерий, выращенных в присутствии цитрата, демонстрируется чистыми зонами на бактериальном газоне,
где был расположен ряд разведенных низиновых проб. Эффективность низина в отношении грамотрицательных бактерий может быть оценена путем определения минимального количества низина, необходимого
для продуцирования частой зоны торможения роста. По мере увеличения концентрации цитрата в питательном агаре уменьшается количество низина, требуемого для торможения роста E.coli, как это подтверждается
данными, представленными в табл. 6.
Таблица 6
Активность низина в отношении Е.coli, выращенных на питательном агаре
в присутствии цитрата
% цитрата
NIC1 низина, µg/ml
0
3 333
0,1
370
0,3
123
1,0
13,7
3,0
0,06
1
- номинальная ингибиторная концентрация низина, минимально необходимого для предотвращения
роста E.coli штамма АТС8739, выращенных на триптиказовом соевом агаре с добавлением различных концентраций цитрата, как это обозначено выше.
Активность низина, усиленного посредством ЭДТК, цитрата или других хелаторов также была продемонстрирована в отношении нескольких штаммов Helicobacter pylori, а также других родственных видов, в частности Campylovacter jejuni, методом анализа бактерицидной суспензии. Примеры представлены в табл. 7-13.
Свежевыращенные клетки Helicobacter pylori, выращенные на пластинке с питательным агаром (триптиказовый соевый агар, BBL 11043, с добавлением 5 % дефибринированной овечьей крови) были собраны с
последующим выращиванием при 37 °С в течение 72-96 ч в камере системы Гаспак ® BBL с оболочками
микроаэрофильной системы BBL Кампи ПакТМ, при этом применялся кампилобактерный микроаэрофильный газовый генератор (BBL 71034). Эти клетки затем были ресуспендированы в стерильной деионизированной дистиллированной воде до клеточной плотности 1,0 А600 для того, чтобы обеспечить исходную суспензию. Анализ начинался с добавления 50 µl бактериальной суспензии и 950 µl испытываемого раствора,
инкубированного при 37 °С в течение 5 мин, а затем центрифугированного в течение одной минуты в микрофуге. Клеточный осадок вымывался ресуспендированием в 1 ml стерильного нейтрализационного буфера,
описываемого ранее, и центрифугировался в течение одной минуты в микрофуге. Клетки затем ресуспендировались в бульоне Brucella-Albimi (BBL) и последовательно также разбавлялись перед посевом на питательный агар. Количество жизнеспособных микроорганизмов определялось путем распластывания 100 µl
бактериальной суспензии и ее разведении на питательный агар, описанный выше, и путем подсчитывания
выживающих колоний после 72-96 ч инкубации при 37 °С при умеренной атмосфере, описанной ранее. Процентное выживание относительно необработанных стандартов исчислялось, исходя из подсчитанных величин.
Концентрационная зависимость активности низина в отношении Helicobacter pylori в присутствии и отсутствии 0,1 % нитрата при рН 5,0 проиллюстрирована на примере данных, представленных в табл. 7. Несмотря на то что H.pylori является грамотрицательной бактерией, низин, считающийся активным только в
отношении грампозитивных бактерий, неожиданно проявляет некоторую бактерицидную активность в отношении этого организма. Однако активность низина в отношении H.pylori значительно усилена присутствием цитрата.
Концентрационная зависимость активности низина в отношении H.pylori от цитрата, при рН 5,0 и рН 7,0
проиллюстрирована на примере данных, представленных в табл. 8. В общем, цитрат сам по себе мало влияет
на жизнеспособность этого бактериального вида при рН 5,0, тем не менее при рН 7,0 жизнеспособность этого организма несколько снижается при более высоких концентрациях цитрата. Влияние, оказываемое одним
цитратом, само по себе удивительно, так как цитрат является метаболитом. Усиленная активность, свойственная низину в присутствии цитрата, является достаточной для того, чтобы полностью убить 105 cfu/ml суспензию H.pylori в течение 5 мин при 37 °С.
Данные, представленные в табл. 9, показывают, что активность низина в отношении H.pylori при рН 5,0
и рН 7,0 также значительно усиливается в присутствии хелатора ЭДТК. Этот хелатор сам по себе не оказывает большого влияния на жизнеспособность этих организмов, если не иметь в виду более высокие концен6
BY 4174 C1
трации. Однако активности, свойственной низину с усилением посредством ЭДТК, вполне достаточно
для уничтожения 10 5 cfu/ml суспензии H.pylori в течение 5 мин при 37 °С.
Бактерицидная активность низина в отношении H.pylori в присутствии или отсутствии цитрата или ЭДТК
в диапазоне значений рН проиллюстрирована на примере данных, представленных в табл. 10 и табл. 11, соответственно. Несмотря на факт изоляции H.pylori по отношению к желудку, полость которого является кислотной, жизнеспособность этого организма оказывается удивительно низкой после подвергания его воздействию условий с низким рН. H.pylori колонизирует мукозальный эпителий желудка, менее кислотную
микросреду, чем та, которой является желудочная полость.
Несмотря на ограниченную жизнеспособность H.pylori при низком рН в этих экспериментах, данные показывают, что низин с цитратом или ЭДТК может быть бактериальным в отношении H.pylori при условиях,
подобных тем, которые преобладают в желудке и его мукозальном эпителии, где H.pylori способна буйно
разрастаться.
Campylobaster jejuni является грамотрицательной бактерией, которая колонизирует кишечник птиц и млекопитающихся и имеет связь с пищевым отравлением. Бактерицидная активность низина в присутствии и отсутствии цитрата или ЭДТК в отношении С.jejuni проиллюстрирована на примере данных, представленных в
табл. 12 и табл. 13, соответственно. Низин сам по себе чрезвычайно эффективен в отношении этой грамотрицательной бактерии. При рН 5,0 более высокие концентрации цитрата также показали свою токсичность в
отношении этой бактерии. Таким образом, соединения низина с цитратом или ЭДТК могут быть эффективными в отношении С.jejuni, как это проиллюстрировано на примере данных в табл. 12 и 13.
Таблица 7
Бактерицидная активность низина в отношении Helicobacter pylori.
Активность в отношении низиновых концентраций
а
b
Штамм
АТСС#
Цитрат
РН 5,0
АТСС
43579
0
0,1
Низин (µg/ml)
0
10
30
Выживаемость в % на 5 мина
100b
1,41
0,39
86,2
0,21
0,008
100
300
0,085
0,001
0,0056
1,89х10-5
- инкубации, проводимые при 37 °С.
- исходное количество жизнеспособных организмов 3,19 х 107 cfu/ml.
Таблица 8
Бактерицидная активность низина в отношении Helicobacter pylori.
Активность в отношении цитрата при рН 5,0 и рН 7,0
Штамм
АТСС#
рН
Низин
(µg/ml)
(% вес/объем) цитрат
0
АТСС
43579
АТСС
43504
5,0
АТСС
43579
АТСС
43504
7,0
5,0
7,0
0
100
0
0
100
100
0
100
0
100
0,1
0,3
Выживаемость в % на 5 мина
100
100
<0,01
<0,01
83,6
42,9
25,8
4,39
0,033
0,066
<3,l x l0-3
0,92
12,1
0,26
<8,l x l0-3
<8,l x l0-3
17,7
8,94
<0,01
<0,01
100b
9,62
100с
100d
n/a.
0,043
100e
0,78
100f
2,08
а
- инкубации, производимые при 37 °С в течение 5 мин.
- исходное количество жизнеспособных микроорганизмов 1,04 х 104 cfu/ml.
с
- исходное количество жизнеспособных микроорганизмов 1,40 х 105 cfu/ml.
d
- исходное количество жизнеспособных микроорганизмов 3,26 х 105 cfu/ml.
e
- исходное количество жизнеспособных микроорганизмов 1,24 х 105 cfu/ml.
f
- исходное количество жизнеспособных микроорганизмов 9,62 х 104 cfu/ml.
b
7
1,0
100
<0,01
22,1
50,9
0,14
2,44
0,02
<8,l x l0-3
0,82
<0,01
BY 4174 C1
Таблица 9
Бактерицидная активность низина в отношении Helicobacter pylori.
Активность в отношении ЭДТК при рН 5,0 и рН 7,0
Штамм
АТСС#
рН
Низин
(µg/ml)
(mM) ЭДТК
0
АТСС
43579
АТСС
43526
5,0
7,0
0
100
0
100
1,0
10
Выживаемость в % на 5 мина
13,63
8,82
<5,0 x 10-3
<5,0 x 10-3
94,1
21,0
<0,03
<0,03
100b
4,7
100с
5,88
100
0,43
<5,0 x 10-3
1,62
<0,03
а
- инкубации, производимые при 37 °С в течение 5 мин.
- исходное количество жизнеспособных микроорганизмов 2,04 х 105 cfu/ml.
с
- исходное количество жизнеспособных микроорганизмов 3,40 х 104 cfu/ml.
b
Таблица 10
Штамм
АТСС#
АТСС
43579
Бактерицидная активность низина в отношении Helicobacter pylori.
Зависимость в отношении цитрата в диапазоне рН от 2,5 до 5,0
Цитрат, %
Низин
Величина рН
(µg/ml)
2,5
3,0
3,5
4,0
Выживаемость в % на 5 мина
0
0
0
100
0
100
0,1
0
<5,0 x 10-4
1,1 х 10-3
0,18
9,56
0,1
100
<5,0 x 10-4
1,1 х 10-3
1,1 х 10-3
2,0 х 10-3
5,0
100b
8,6 х 10-3е
0,30с
97,2b
2,7 х 10-3b
Продолжение табл. 10
АТСС
43504
0
0
0
0
0,1
0,1
0,3
0,3
0
0
100
100
0
100
0
100
0,14
<0,004
0,027
<0,027
<0,004
<0,004
<0,027
<0,027
а
<0,004
<0,004
29,7
2,7
0,36
<0,004
17,6
0,32
100d
100e
0,69d
4,86е
68,5d
0,022d
100е
0,18е
- инкубации в течение 5 мин при 37 °С в цитрате, соответствующем рН или ацетате 20 mM, рН 5,0.
- исходное количество жизнеспособных микроорганизмов 1,85 х 106 cfu/ml.
с
- среднее от 5 экспериментов.
d
- исходное количество жизнеспособных микроорганизмов 2,7 х 105 cfu/ml.
e
- исходное количество жизнеспособных микроорганизмов 3,7 х 104 cfu/ml.
b
8
BY 4174 C1
Таблица 11
Бактерицидная активность низина в отношении Helicobacter pylori.
Активность в отношении ЭДТК в диапазоне рН от 2,5 до 5,0
Штамм
АТСС#
ЭДТК, mМ
Низин
(µg/ml)
Величина рН
2,5
АТСС
43504
0
0
0
0
1,0
1,0
1,0
1,0
0
0
100
100
0
0
100
100
3,0
3,5
4,0
Выживаемость в % нa 5 мина
<0,021
94,2
11,6
0,001
0,015
16,5
<0,021
0,012
<0,021
<0,001
0,005
0,54
0,023
0,013
<0,021
<0,001
5,0
100b
100с
0,021d
7,03e
10,0b
100с
0,53b
0,32с
а
- инкубации в течение 5 мин при 37 °С в цитрате, соответствующем рН или ацетате 20 mM, рН 5,0.
- исходное количество жизнеспособных микроорганизмов 8,6 х 104 cfu/ml.
с
- исходное количество жизнеспособных микроорганизмов 9,82 х 105 cfu/ml.
d
- инкубировано в присутствии 0,1 %-ного цитрата.
e
- инкубировано в присутствии 20 mM ацетата.
b
Таблица 12
Бактерицидная активность низина в отношении Campylobaster jejuni АТСС29428.
Зависимость в отношении цитрата при рН 5,0 (штамм АТСС29428)
Низин, µg/ml
0
0
100
а
b
100b
<6,4 х 10-3
(%вес/объем) Цитрат рН 5,0
0,1
0,3
Выживаемость в % нa 5 мина
2,9
<6,4 x 10-3
-3
<6,4 х 10
<6,4 x 10-3
1,0
<6,4 x 10-3
<6,4 x 10-3
- инкубации, производимые при 37 °С в течение 5 мин.
- исходное количество жизнеспособных микроорганизмов 1,57 х 105 cfu/ml.
Таблица 13
Бактерицидная активность низина в отношении Campylobaster jejuni АТСС29428
Зависимость в отношении ЭДТК при рН 5,0 (штамм АТСС29428)
mМ ЭДТК рН 5,0
Низин, µg/ml
0
1,0
10
100
Выживаемость в % нa 5 мина
0
100b
56,5
76,1
76,1
100
<5,0 х 10-4
<5,0 х 10-4
<5,0 х 10-4
<5,0 х 10-4
а
- инкубации, производимые при 37 °С в течение 5 мин.
- исходное количество жизнеспособных микроорганизмов 1,84 х 106 cfu/ml.
Активность низина, усиленная посредством ЭДТК, цитрата или других хелаторов может быть также наглядно показана в отношении видов Salmonella путем анализов бактерицидной суспензии. Свежевыращенные клетки S.typhimurium берутся с пластинки питательного агара (триптиказовый соевый агар BBL 11043)
после выращивания в течение 24 ч при 37 °С. Клетки ресуспендируются до клеточной плотности 1,0 А600 для
обеспечения подходящей исходной суспензии. Анализ начинается с добавления 30 µl бактериальной суспензии к 970 µl контрольного раствора и инкубирования в течение, по крайней мере, одной минуты, а затем
центрифугирования в течение одной минуты в микрофуге. Клеточный осадок вымывается посредством ресуспензий 1 ml стерильного нейтрализационного буфера, снова ресуспендируется, а затем последовательно
разбавляется в нейтрализационном буфере. Количество жизнеспособных микроорганизмов определяется
распластыванием 100 µl бактериальной суспензии и ее разведений на питательный агар и подсчитыванием
b
9
BY 4174 C1
выживающих колоний после 24 ч инкубации при 37 °С. Процентная выживаемость относительно необработанных стандартов исчисляется, исходя из подсчитанных величин.
Бактериоциновые соединения данного изобретения, активные при низком рН, предпочтительно вводятся
орально в виде фармацевтического препарата, который содержит эффективное количество лантионинсодержащего бактериоцина и фармацевтически приемлемый носитель. Носитель может также включать в себя
эффективное количество хелатора и/или кислотного носителя, и/или поверхностно-активного вещества, или
эмульгатора, моноглицерида или жирной кислоты. Лантионинсодержащий бактериоцин может быть выбран
из группы, состоящей из низина, субтилина, эпидермина, пеп 5, анковенина, галлидермина, дуромицина или
циннамицина. Соответствующие хелирующие агенты включают в себя (но не ограничиваются этим) ЭДТК,
СаЭДТК, СаNа2ЭДТК и другие тетрацетаты алкилдиамина, а также цитрат. В отдельных случаях хелатор и
кислотный носитель могут быть одним и тем же, например тогда, когда кислотный носитель и хелатор оба
представляют собой цитрат. Подходящими кислотными носителями для применения в этом изобретении являются ацетат, пропионат, цитрат, лактат, сукцинат, фумарат, малонат, адипат, сорбат, фосфат и аскорбат.
Соединения данного изобретения также эффективны при слегка кислотных уровнях рН (например, рН
5,0) и даже более высоких уровнях рН (например, рН 8,0) против патогенных бактерий, которые могут
обитать в желудочно-кишечном тракте, такие как E.coli и S.tuphimurium, как это указывается в выданном
патенте США 5.135.910. Раскрытие патента США 5.135.910 настоящим инкорпорируется ссылкой на совместную собственность.
Фармацевтические соединения этого изобретения могут, таким образом, также формулироваться как антацидные соединения или вводиться в соединения с антацидом, результатом чего, например, явится повышение рН желудочной среды по сравнению с тем, что имело бы место до введения. При таких условиях низиновые хелаторные соединения окажутся еще более эффективными в отношении патогенных бактерий.
Фармацевтически приемлемый носитель может быть в виде твердого, полутвердого или жидкого растворителя или капсулы. В определенных вариантах осуществления изобретения кислотный носитель и фармацевтический носитель могут быть одним и тем же. Другими фармацевтически приемлемыми носителями могут быть производные целлюлозы, желатин, лактоза, крахмал и др.
Фармацевтические соединения могут быть в виде растворов, коллоидов или эмульсий, порошков, таблеток, капсул или гелей.
Сухие виды соединений, активные при низком рН, могут быть спрессованы в таблетки, которые могут
иметь оболочки из концентрированного раствора сахара и которые могут содержать другие фармацевтически приемлемые заместители, такие как гуммиарабик, желатин, тальк или двуокись титана и могут быть
также покрыты различными красителями. Можно изготовить твердые желатиновые капсулы, содержащие
гранулы бактериоцина, кислотный носитель и хелирующий агент в комбинации с твердым носителем, таким
как лактоза, картофельный крахмал, кукурузный крахмал, производные целлюлозы или желатин.
Жидкие препараты для орального введения могут быть изготовлены в виде сиропов или суспензий, содержащих пептидный бактериоцин, хелируюший агент, кислотный носитель и сахар, воду и глицерин или
пропиленгликоль. При желании такие жидкие препараты могут содержать красители, вкусовые вещества,
сластители, такие как сахарин, и сгустители, такие как производные целлюлозы.
Доставка дозированной формы может быть достигнута, по всей видимости, усовершенствованием простых водных составов путем включения сгустителей, эмульгаторов или партикулята для достижения эффекта
коллоидной суспензии. Альтернативно могут вводиться осмотически сбалансированные растворы, содержащие подходящие дозы в таких малых объемах, как 10 ml, или таких больших объемах, как 4 л. Осмотически
сбалансированные растворы, подобные этим, могли бы быть применимы в качестве промывочной жидкости
желудочно-кишечного тракта (Ди Палма, Дж. А. и Брейди К.Э., 1989, американский журнал "Гастроэнтерология" 84:1008. "Очищение ободочной кишки для диагностических и хирургических процедур: полиэтиленгликолевый промывочный раствор"; Ди Палма, Дж. А. и Маршал, Дж.Б., 1990, Желудочно-кишечная
эндоскопия 1990, 36:285, "Сравнивание нового бессульфатного полиэтиленгликолевого электролитного
промывочного раствора со стандартным раствором для колоноскопического промывания"; Фордтран, Дж.С.
и др., 1990, Гастроэнтерология 98:11. "Раствор с низким содержанием соды для желудочно-кишечного
промывания"). Можно надеяться, что путем включения описанных здесь бактерицидных соединений возможно создание улучшенных промывочных растворов для очищения желудочно-кишечного тракта.
Типичная дневная доза предложенных композиций может варьироваться в соответствии с обрабатываемой патогенномикроорганической инфекцией, расположением инфекции и симптомами излечиваемой болезни. В общем, можно полагать, что оральные дозировки можно варьировать от 0,1 mg на дозу до 300 mg на
дозу лантионинсодержащего бактериоцинового вещества и от 0,1 g на дозу до 30 g на дозу хелатора.
Например, так как объем желудочного содержимого варьирует как функция времени, прошедшего после
последнего приема пищи, простые водные составы, пригодные для желудочно-кишечного применения, могут быть приготовлены следующим образом.
10
BY 4174 C1
Для получения конечной концентрации в желудке при 0,1 % цитрата + 0,001 % низина (10 ug/ml), помещенных в 10 ml и составляющих, приблизительно, 100 ml в желудке.
Дозировка 1: 1,0 mg низина и 0,1 g цитрата
Na цитрат
низин
сахарин
полисорбат 20
глицерин
вода
1,0 %
0,01 %
0,005 %
1,0 %
10,0 %
87,985 %.
Для получения конечной концентрации в желудке при 3,0 % цитрата + 0,03 % низина (300 ug/ml), помещенных в 10 ml и составляющих 100 ml в желудке.
Дозировка 2: 30 mg низина и 3,0 g цитрата
Na цитрат
низин
сахарин
полисорбат 20
глицерин
вода
30 %
0,3 %
0,005 %
1,0 %
0,0 %
58,695 %.
Для получения конечной концентрации в желудке при 0,1 % цитрата + 0,001 % низина (10 ug/ml), помещенных в 10 ml и составляющих 1000 ml в желудке.
Дозировка 3: 10 mg низина и 1,0 g цитрата
Na цитрат
10,0 %
низин
0,1 %
сахарин
0,005 %
полисорбат 20
1,0 %
глицерин
10,0 %
вода
78,895 %.
Для получения конечной концентрации в желудке при 3,0 % цитрата + 0,03 % низина (300 ug/ml), помещенных в 100 ml и составляющих 1000 ml в желудке.
Дозировка 4: 300 mg низина и 30 g цитрата
Na цитрат
30,0 %
низин
0,3 %
сахарин
0,005 %
полисорбат 20
1,0 %
глицерин
10,0 %
вода
58,695 %.
Для получения конечной концентрации в желудке при 3,0 % цитрата + 0,03 % низина (300 ug/ml), помещенных в 100 ml и составляющих 100 ml в желудке.
Дозировка 5: 60 mg низина и 6,0 g цитрата
Na цитрат
6,0 %
низин
0,06 %
сахарин
0,005 %
полисорбат 20
1,0 %
глицерин
10,0 %
вода
82,935 %.
Предполагается также, что в зависимости от типа патогенного микроорганизма и лечимой болезни в режим лечения могут включаться иные препараты и фармацевтические агенты или как часть вводимой фармацевтической композиции, или в режимах лечения, которые объединяют как бактериоциновое соединение,
активное при низком рН, так и другой препарат, эффективный в лечении желудочно-кишечного тракта. Например, в лечении диареи, которая может возникнуть путем заражения патогенным микроорганизмом, таким
как один из видов Salmonella, бактериоциновое соединение, активное при низком рН, может вводиться в
фармацевтический препарат, который также содержит каолин, пектин или другой связующий агент. Такие
симптомы могут также излечиваться совместным введением бактериоциновой композиции и связующего
агента, кроме того, при таких режимах лечения могут применяться антацидные составы, и, как предполагается, антацид не будет влиять на активность низиново-хелаторной композиции.
При обработке инфекции патогенного микроорганизма Helicobacter pylori бактериоциновое соединение,
активное при низком рН, может вводиться в соединении с другим веществом, фармацевтически активным в
отношении H.pylori, таким как соль висмута, например субцитрат или субсалицилат висмута. Предполагаемые соединения могут вводиться в соединении с другими агентами, такими как циметидин, ранитидин,
11
BY 4174 C1
омепразол, антациды, ингибиторы уреазы или их комбинации, для лечения некоторых болезней и симптомов, связанных с присутствием H.pylori в желудочно-кишечном тракте. Предполагается, что в этих направлениях терапии активные фармацевтические агенты могут вводиться одновременно или вперемежку с предполагаемыми фармацевтическими соединениями, а режим введения по необходимости может варьироваться
во время курса лечения.
H.pylori изолируется от дентальной плакии, которая может служить источником рецидива инфекции желудка (Деза, Х.Г., Гилл, Х.Х., Шанкаран, К., Мехта, П.Р. и Прабха, С.Р. (1991) «Дентальная плакия: постоянный источник Helicobaster pylori Скандинавский журнал «Гастроэнтерология», 26:1205 и Шеймз, Б., Крайден, С., Фукаса, М., Бабида, К. и Пеннер, Дж.Л. (1989) «Доказательство случаев возникновения одного и
того же штамма Campylobaster pylori в желудке и дентальной плакии». Журнал «Клиническая микробиология», 27:2849).
Следовательно, можно предвидеть, что бактериоциновые соединения, пригодные для применения против
Н.pylori в дентальной плакии могут быть применимы вместе с бактериоциновыми соединениями, активными
при низком рН в отношении Н.pylori в желудочно-кишечном тракте.
Государственный патентный комитет Республики Беларусь.
220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66.
12
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
245 Кб
Теги
by4174, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа