close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY4324

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(19)
BY (11) 4324
(13)
C1
7
(51) G 01N 33/531
(12)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОСОРБЕНТОВ ДЛЯ
ИММУНОАНАЛИЗА
(21) Номер заявки: 970480
(22) 1997.08.29
(46) 2002.03.30
(71) Заявители: Свиридов О.В., Стрельченок О.А., Чащин
В.Л. (BY)
(72) Авторы: Свиридов О.В., Стрельченок О.А.,
Чащин В.Л., Вашкевич И.И., Прядко А.Г.,
Свирид В.Д., Щербань А.И. (BY)
(73) Патентообладатели: Свиридов Олег Васильевич,
Стрельченок Олег Анатольевич, Чащин Вадим
Леонидович (BY)
BY 4324 C1
(57)
1. Способ получения иммуносорбентов для иммуноанализа, включающий предварительную обработку
твердого носителя гамма-излучением, иммобилизацию на указанном носителе специфического биотинсвязывающего белка напрямую или через специфическую связь с конъюгатом производного биотина и инертного белка, иммобилизованного на твердой фазе, специфическую иммобилизацию на полученном полупродукте конъюгата производного биотина и антитела или антигена, при этом в качестве антитела используют
антивидовое антитело с последующим, в случае необходимости, связыванием с видовым антителом к анализируемому антигену, стабилизацию целевого продукта путем обработки раствором инертного пленкообразующего материала и высушивания.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве носителя используют пластмассовые изделия, в частности, из полиэтилена, полипропилена, полистирола или композиционных материалов на их основе.
3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что обработку гамма-излучением ведут до поглощенной дозы 25-100 кГр, предпочтительно от источника 60Со.
Фиг. 1
4. Способ по п. 1 или 3, отличающийся тем, что поверхность носителя после воздействия гаммаизлучения дополнительно подвергают обработке инертным органическим растворителем.
BY 4324 C1
5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что в качестве инертного органического растворителя используют
органический растворитель, не разрушающий поверхность пластмассового изделия и не вызывающий ее видимых повреждений.
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что пленкообразующий материал выбирают из группы, включающей сахарозу, лактозу, поливинилпирролидон.
7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что целевой продукт дополнительно стабилизируют сшивающим
бифункциональным реагентом.
8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что сшивающий бифункциональный реагент представляет собой
глутаровый альдегид.
(56)
EP 0405578 B1, 1995.
RU 92015456 А, 1995.
RU 2082982 C1, 1997.
ЕР 0620438 A1, 1994.
JP 03128460 A, 1991.
Изобретение относится к области медицинского иммуноанализа, а именно к технологиям лабораторного
изготовления и промышленного производства отдельных реагентов и комплектных наборов реактивов для
иммуноанализа.
Базовыми компонентами современных наборов для иммуноанализа являются иммуносорбенты - твердофазные реагенты, которые включают иммобилизованные на нерастворимом носителе антитела для связывания анализируемых антигенов или же антигены для связывания анализируемых антител. Наиболее удобными
носителями являются формованные пластмассовые изделия, например, пробирки или микропланшеты с лунками, а также помещаемые в пробирки миниатюрные изделия с большой площадью поверхности, такие как
шарики, турбинки и т.п. Наиболее распространенными материалами для таких изделий являются полистирол, полиэтилен и полипропилен. Макромолекулы антител закрепляют на рабочей поверхности носителя
чаще всего следующими тремя способами: 1) прямая физическая (пассивная) адсорбция, 2) ковалентное
присоединение за счет активированных функциональных групп, "привитых" к поверхности пластика, 3) опосредованная (активная) адсорбция с участием сил биоспецифического сродства, например, через высокоаффинные авидин-биотиновые системы (константа сродства порядка 1015M-1) [1-3].
Главными требованиями к технологии нанесения антител или антигенов на пластмассовые изделия являются следующие: 1) максимально полное и равномерное покрытие рабочей поверхности предпочтительно
монослоем активных молекул для обеспечения большой и инвариабельной связывающей емкости, 2) высокая устойчивость покрытия в условиях иммуноанализа и при хранении твердофазного реагента, так как "утечка" антител или антигенов вследствие разрушения связей с носителем приводит к ошибкам в анализе и порче
реагента [1].
В качестве прототипа заявляемого изобретения выбран способ получения твердой фазы, применяемой в
иммуноферментном анализе в качестве антигенсвязывающего реагента (в нашей терминологии - иммуносорбент) [4].
Указанный иммуносорбент является твердой фазой, на которой иммобилизованно биотинилированное
антитело опосредованно через соединение, выбранное из группы, состоящей из авидина, стрептавидина и
какого-либо их производного, причем названное соединение связано с биотиновой частью биотинилированного антитела и, кроме того, связано с твердой фазой напрямую или через связь между другим производным
биотина и высокомолекулярным соединением, связанным с твердой фазой. Способ заключается в следующем. На рабочую поверхность пластмассового изделия наносят первый слой покрытия из инертного белка
(бычий сывороточный альбумин; БСА), ковалентно конъюгированного с биотином. Конъюгат биотин-БСА
растворен в 0,05 М натрий-карбонатном буфере (рН 9,6) в концентрации 10 мкг/мл. Физическую адсорбцию
проводят при комнатной температуре в течение 1 ч. После промывки наносят второй слой покрытия, состоящий из авидина. Нековалентное биоспецифическое взаимодействие между биотином из первого слоя и
авидином протекает при концентрации авидина 50 мкг/мл в 0,1 М натрий-фосфатном буфере (рН 7,0) и температуре 37 °С в течение 1 ч. В варианте прямого нанесения авидина в составе первого адсорбционного слоя
этот белок растворяют в буфере с рН 9,6, в раствор (500 мкг/мл) помещают полистирольный носитель, выдерживают при комнатной температуре в течение 20 ч, жидкую фазу удаляют, промывают твердую фазу несколько раз физиологическим буфером, выдерживают 20 ч при комнатной температуре в растворе бычьего
сывороточного альбумина (БСА) и получают продукт с прямой иммобилизацией специфического биотинсвязывающего белка. После промывки поверхность покрывают слоем антител, ковалентно конъюгированных с
биотином. Это нековалентное включение биотинилированных антител (против альфа-фетопротеина; АФП) в
2
BY 4324 C1
свободные места связывания на авидине второго слоя протекает из раствора с концентрацией 1,6 мкг/мл в
0,01 М натрий-фосфатном буфере (рН 7,0), содержащем 0,1 М NaCl и 0,2 % БСА, при температуре 37 °С в
течение 15 мин. После промывки покрытую антителами поверхность обрабатывают раствором БСА (30
мкг/мл) в 0,05 М натрий-карбонатном буфере (рН 9,6) при 37 °С в течение 1 ч.
Недостатки способа-прототипа проявляются в свойствах целевых продуктов: 1) недостаточная емкость и
повышенная вариабельность связывания антигенов целевыми продуктами из-за малой и неравномерной адсорбируемости связывающих биомолекул по существующему способу, 2) неустойчивость целевых продуктов в условиях транспортирования, хранения и применения медицинским потребителем.
Задачей настоящего изобретения является способ получения иммуносорбентов для иммуноанализа, которые 1) характеризуются высокой емкостью и низкой вариабельностью связывания антигенов или антител, 2)
имеют более широкую сферу применения в иммуноанализе, 3) обладают долговременной устойчивостью
при выдерживании в естественных условиях и при жестких воздействиях.
Поставленная задача решена заявляемым способом получения иммуносорбентов для иммуноанализа, который состоит в следующем:
Твердый носитель, в качестве которого используют формованное пластмассовое изделие (пробирки,
микропланшеты, шарики, турбинки) из полистирола, полиэтилена, полипропилена или композиционных материалов на их основе, подвергают обработке гамма-излучением, предпочтительно от источника 60Со до
поглощенной дозы 25-100 кГр. Для закрепления полезных изменений в поверхности, вызванных радиацией,
носитель в случае необходимости дополнительно обрабатывают инертным органическим растворителем.
Причем в качестве инертного органического растворителя используют органический растворитель, не разрушающий пластмассовое изделие и не вызывающий видимых повреждений его рабочей поверхности. На
обработанный твердый носитель за счет сил физической адсорбции белка наносят первый слой покрытия из
специфического биотинсвязывающего белка (стрептавидин, авидин или их производные) или конъюгата
биотин-инертный белок. В случае применения конъюгата биотин-инертный белок получают промежуточный
продукт, который обрабатывают раствором специфического биотинсвязывающего белка. При этом биотинсвязывающий белок закрепляется на первом слое за счет сил биоспецифического сродства между одним из
своих четырех активных центров и биотином. В результате образуются полезные полупродукты с одним или
двумя слоями покрытия, содержащие активный биотинсвязывающий белок во внешнем слое. Эти полупродукты, во-первых, могут самостоятельно применяться в иммуноанализе и, во-вторых, используются для последующей модификации по заявляемому способу. Для этого покрытую био-тинсвязывающим белком поверхность пластмассового изделия обрабатывают раствором конъюгата биотин-антитело или биотинантиген. Этот слой закрепляется на предыдущем слое за счет сил биоспецифического сродства между незанятыми активными центрами биотинсвязывающего белка и биотином. В результате получают иммуносорбент, который после описываемых ниже стадий стабилизации может применяться как конечный продукт в
иммуноанализе или использоваться в заявляемом способе как полупродукт для нанесения следующего слоя
покрытия. В этом случае в составе конъюгата с биотином используется антивидовое антитело, а иммуносорбент, содержащий данный конъюгат, обрабатывают раствором видового антитела к анализируемому антигену. При этом нанесенный слой закрепляется на предыдущем слое за счет сил биоспецифического сродства
между антивидовым и видовым антителами. После нанесения каждого слоя биопокрытия избыток реактивов
в жидкой фазе удаляется промывкой. Целевые продукты стабилизируют физически путем нанесения защитной пленки из растворимых в воде материалов и высушивания. Пленкообразующий материал выбирают из
группы, включающей сахарозу, лактозу, поливинилпирролидон. Возможна дополнительная химическая стабилизация целевого продукта путем обработки раствором сшивающего бифункционального реагента. При
этом сшивающий бифункциональный реагент представляет собой, в частности, глутаровый альдегид.
Заявляемый способ имеет следующие существенные отличительные признаки: 1) обработка пластмассового изделия гамма-лучами и, при необходимости, органическим растворителем перед биопокрытием, 2) использование антивидового антитела в качестве антитела в конъюгате биотин-антитело с последующим, в
случае необходимости, связыванием полученного иммуносорбента с видовым антителом к анализируемому
антигену 3) использование конъюгата биотин-антиген с целью получения иммуносорбента для иммуноанализа антитела, 4) стабилизация целевых продуктов физической обработкой и для получения дополнительного эффекта - химической обработкой.
Каждый из названных отличительных признаков дает следующие положительные эффекты, которые
нельзя было предвидеть при постановке цели изобретения путем простых логических рассуждений:
1. Обработка гамма-лучами и дополнительно органическим растворителем существенно повышает емкость и снижает вариабельность связывания анализируемых антигенов или антител целевыми продуктами
заявляемого способа.
Это достигается за счет повышения качества биопокрытия твердого носителя. По-видимому, радиационная обработка приводит к появлению дополнительных центров пассивной адсорбции и их равномерного
распределения по поверхности пластмассового изделия.
3
BY 4324 C1
Известно применение гамма-облучения при радиационной прививочной сополимеризации с целью получения полимера, содержащего привитые функциональные группы, для химического присоединения макромолекул [2]. Известно также использование гамма-радиации от источника 60Со при поглощенной дозе 10-100
кГр для включения низкомолекулярных соединений в формованные изделия из полистирола с целью прививки к поверхности полимера функциональных групп для химического присоединения антител [5]. В литературе также указывается, что гамма-облучение дозами около 100 кГр таких неорганических сорбентов, как
силикагель или окись алюминия увеличивает емкость физической адсорбции по отношению к малым молекулам за счет образования в поверхностном слое дополнительных дефектов, которые могут выступать в качестве новых центров адсорбции [2]. Однако, по литературным данным, существующие методы контроля не
выявляют даже "ничтожных" радиационных повреждений полистирола или полиэтилена, обычных материалов, из которых формуются пластмассовые изделия для иммуноанализа, при поглощенной дозе 100 кГр. Изменение физических свойств, которое проявляется, в частности, как разрушение кристаллитов (уменьшение
степени кристалличности) полиэтилена, полипропилена и других пластмасс, имеющимися методами детектируют при очень большой поглощенной дозе (около 35 МГр [2]). Следовательно, биологическое покрытие
по заявляемому способу является не только средством достижения цели изобретения, но и может служить
высокочувствительным тестом на поверхностные изменения в пластике под действием радиации.
Изменения физических свойств поверхности пластмассы, вызванные гамма-радиацией и имеющие характер обратимых явлений [2], скорее всего закрепляются во времени при выдерживании изделия в органическом растворителе. Кроме того, органический растворитель может способствовать образованию и равномерному распределению дополнительных центров адсорбции уже "химического" происхождения.
2. Использование антивидовых антител существенно расширяет возможности применения способа в технологии производства средств иммуноанализа и, в частности, дает возможность нанести на твердую фазу
практически любое видовое антитело к любому анализируемому антигену прямо из исходной биологической
жидкости, не прибегая к очистке.
3. Применение конъюгата биотин-антиген также расширяет сферу применения способа и позволяет использовать его в производстве средств иммуноанализа для определения аутоантител в качестве патологических маркеров.
4. Физическая стабилизация путем обработки, например, растворами сахарозы, лактозы или поливинилпирролидона и высушивания обеспечивает сохранение активных центров иммобилизованных белков за счет
образования защитной пленки на рабочей поверхности иммуносорбента. Дополнительная химическая стабилизация путем обработки бифункциональным реагентом, например глутаровым альдегидом, ковалентно
"сшивает" по аминогруппам белки из различных слоев покрытия и таким образом прочно закрепляет биоспецифически ориентированные белковые слои на носителе. В результате целевой продукт заявляемого способа приобретает повышенную по сравнению с прототипом устойчивость в экстремальных условиях, которые могут возникнуть в процессе его изготовления, транспортирования, хранения и применения.
В примерах, поясняющих изобретение, проводят прямое экспериментальное сравнение способапрототипа и заявляемого способа по следующим параметрам качества иммуносорбентов: 1) масса биотинсвязывающего белка (стрептавидина), адсорбированного напрямую или через конъюгат инертный белокбиотин на рабочей поверхности пластмассового изделия, 2) максимальная связывающая емкость в отношении анализируемого антигена или антитела, 3) коэффициент вариации связывания антигена или антитела, 4)
степень уменьшения связывающей активности при хранении в естественных условиях ускоренного старения
(72 ч при 37 °С) и в агрессивных условиях экстремальных воздействий (обработка покрытых пробирок 0,05
М буфером глицин-HCl (рН 2,6), содержащим 6 М гуанидинхлорид и 30 % ацетонитрила).
В качестве носителей биопокрытия используются следующие пластмассовые изделия: 1) пробирки из полистирола, стандартные с внутренним диаметром 10 мм и длиной 75 мм, по ТУ РБ 147 500615.001-95, серийная продукция научно-производственного кооператива "Бион", Минск, далее по тексту - пробирки
"Бион", 2) пробирки из полистирола 12х75 мм, серийная продукция фирмы ElKay Products, Inc., США, номер
по каталогу 000-2052-unt, партия № J9142, далее по тексту - пробирки "Е1Кау", 3) микропланшеты (9х13 см)
из полистирола с 96 лунками (сборные из 12 полосок по 8 лунок), серийная продукция фирмы "Biohit OY",
Финляндия, номер по каталогу 781041 (прозрачные, для колориметрии), далее по тексту - микропланшеты
"Biohit", 4) микропланшеты того же формата, полистирольные, серийная продукция фирмы "Labsystems Оу",
Финляндия, номер по каталогу 9502887 (матовые, для люминометрии), далее по тексту - микропланшеты
"Labsystems" 5) турбинки миниатюрные (масса 1 шт. - 0,1 г) из композита полиэтилена и полипропилена
для внесения в пробирки, система "Elsa", серийная продукция фирмы "Cis biointernational", Франция, далее
по тексту - турбинки "Elsa".
Материалы для биопокрытия приготавливают следующим образом. Не содержащие протеазной активности инертные белки, которые являются массовыми продуктами биоиндустрии - например, БСА, общий иммуноглобулин сыворотки быка, яичный альбумин ("Serva") - биотинилируют N-оксисукцинимидным эфиром
биотина ("Sigma"), а конъюгаты очищенных антител или антигенов с биотином получают с использованием
4
BY 4324 C1
N-оксисукцинимидного эфира аминокапроильного производного биотина ("Sigma"). Стрептавидин выделяют из культуральной жидкости штамма Streptomyces avidini ВКМ Ас 1047 осаждением сульфатом аммония
(насыщение 70 %) и используют без дальнейшей очистки, контролируя концентрацию стрептавидина в растворах биоспецифическим методом, или же очищают аффинной хроматографией на иминобиотин-агарозе и
количественно определяют белок по коэффициенту экстинкции [7]. Антивидовые антитела получают в чистом виде с помощью антиген-аффинной хроматографии антисыворотки животного одного вида на сорбенте,
содержащем в качестве иммобилизованного антигена иммуноглобулин животного другого вида. Антитела к
целевому (определяемому в иммуноанализе) антигену частично очищают из асцитической жидкости или поликлональной антисыворотки последовательным осаждением каприловой кислотой и сульфатом аммония
или же выделяют в чистом виде аффинной хроматографией. Антигены, применяющиеся для получения антителосвязывающих иммуносорбентов, экстрагируют из ткани щитовидной железы человека и далее очищают традиционными методами белковой химии, описанными для тирео-пероксидазы (ТПО) [8] и тиреоглобулина (Тг) [9].
Целевые продукты заявляемого и известного способов испытывают в иммуноаналитических системах
различных типов: радиоиммунной, иммунорадиометрической, иммуноферментной и иммунолюминометрической. Качественные и количественные характеристики заявляемого способа и способа-прототипа определяют также в радиометрических экспериментах с раздельным применением меченных йодом-125 препаратов: конъюгатов биотин - инертный белок, чистого стрептавидина ("Amersham"), чистого биотинилированного анти-кроличьего IgG и чистого кроличьего IgG -антитела к ферритину человека, которые по своим биохимическим и адсорбционным свойствам полностью соответствуют исходным немеченым веществам.
Перечень фигур чертежей:
фиг 1. Медицинский радиоиммунный анализ тироксинсвязывающего глобулина. 1 - твердофазный ТСГсвязывающий реагент по заявляемому способу; 2 - твердофазный ТСГ-связывающий реагент по способупрототипу; а - калибровочные кривые; б - изменение коэффициента вариации (К.В.) в диапазоне калибровочной кривой;
фиг 2. Медицинский иммунорадиометрический анализ альфа-фетопротеина. 1 - твердофазный АФПсвязывающий реагент по заявляемому способу; 2 - твердофазный АФП-связывающий реагент по способупрототипу; а - калибровочные кривые; б - изменение коэффициента вариации (К.В.) в диапазоне калибровочной кривой;
фиг 3. Медицинский радиоиммуноанализ эстрадиола. 1 - твердофазный Е2-связывающий реагент по заявляемому способу; 2 - твердофазный Е2-связывающий реагент по способу-прототипу; а - калибровочные кривые; б - изменение коэффициента вариации (К.В.) в диапазоне калибровочной кривой;
фиг 4. Медицинский иммуноферментный анализ трийодтиронина. 1 - твердофазный Т3-связывающий
реагент по заявляемому способу; 2 - твердофазный Т3-связывающий реагент по способу-прототипу; а - калибровочные кривые; б - изменение коэффициента вариации (К.В.) в диапазоне калибровочной кривой;
фиг 5. Медицинский иммунолюминометрический анализ тестостерона. 1 - твердофазный тестостеронсвязывающий реагент по заявляемому способу; 2 - твердофазный тестостеронсвязывающий реагент по способупрототипу; а - калибровочные кривые; б - изменение коэффициента вариации (К.В.) в диапазоне калибровочной кривой;
фиг 6. Медицинский иммунорадиометрический анализ ферритина. 1 - твердофазный ферритинсвязывающий реагент по заявляемому способу; 2 - твердофазный ферритинсвязывающий реагент по способупрототипу; а - калибровочные кривые; б - изменение коэффициента вариации (К.В.) в диапазоне калибровочной кривой;
фиг 7. Медицинский иммуноферментный анализ аутоантител к тиреопероксидазе. 1 - твердофазный АтТПО-связывающий реагент по заявляемому способу; 2 -твердофазный АтТПО-связывающий реагент по способу-прототипу; а - калибровочные кривые; б - изменение коэффициента вариации (К.В.) в диапазоне калибровочной кривой;
фиг 8. Медицинский иммунорадиометрический анализ аутоантител к тиреоглобулину. 1 - твердофазный
АтТг-связывающий реагент по заявляемому способу; 2 -твердофазный АтТг-связывающий реагент по способу-прототипу; а - калибровочные кривые; б - изменение коэффициента вариации (К.В.) в диапазоне калибровочной кривой;
фиг 9. Медицинский радиоиммунный анализ инсулина. 1 - полупродукт твердофазного инсулинсвязывающего реагента по заявляемому способу; 2 - полупродукт твердофазного инсулинсвязывающего реагента
по способу-прототипу; а - калибровочные кривые; б - изменение коэффициента вариации (К.В.) в диапазоне
калибровочной кривой.
Для лучшего понимания сущности изобретения приводятся конкретные примеры его выполнения. Во
всех этих примерах параллельно с заявляемым способом осуществляют способ-прототип по описанной для
него методике [4] с использованием необработанных пластмассовых изделий и тех же материалов для биопокрытия, что описаны в конкретном примере для заявляемого способа. Полученные по способу-прототипу
5
BY 4324 C1
целевые продукты испытывают в тех же экспериментальных условиях, что и соответствующие продукты по
заявляемому способу.
Пример 1.
Получение иммуносорбента для радиоиммунного анализа (РИА) тироксинсвязывающего глобулина
(ТСГ) путем обработки полистирольных пробирок.
Партию пробирок "Бион" (100 шт) помещают в полиэтиленовый мешок и подвергают действию гаммаизлучения от изотопа 60Со в универсальной гамма-установке УГУ 420 в течение времени (20 ч), достаточного для поглощения дозы 100 кГр. После извлечения из контейнера все пробирки одновременно обрабатывают в одном технологическом режиме с использованием аппаратов для дозированного распределения жидкостей и промывки. В пробирки вносят по 1,0 мл 96 %-ного этилового спирта, выдерживают в течение ночи
(14-18 ч) при комнатной температуре, органический растворитель полностью удаляют и пробирки промывают дважды дистиллированной водой по 4 мл.
Далее пробирки обрабатывают по двум вариантам. Вариант 1 включает последовательное нанесение
двух слоев биопокрытия из конъюгата инертный белок-биотин и биотинсвязывающего белка. Вариант 2 предусматривает однослойное покрытие путем прямой адсорбции биотинсвязывающего белка.
Вариант 1. В пробирки приливают по 1,0 мл раствора 10 мкг/мл конъюгата БСА-биотин и 0 или около 2
кБк/мл [125I]БСА-биотин в 0,05 М натрий-бикарбонатном буфере (рН 9,1), инкубируют при постоянном
встряхивании на вибрационном смесителе 2 ч при 37 °С, а затем жидкость из пробирок удаляют, промывают дважды дистиллированной водой (по 1 мл), один раз 1 мл натрий-бикарбонатного буфера, содержащего
0,1 М NaCl и 0,02 % Твин-80, и дважды дистиллированной водой (по 1 мл).
В пробирки вносят по 1,0 мл раствора 100 мкг/мл стрептавидина и около 2 или 0 кБк/мл
[125I]стрептавидина в 0,05 М натрий-бикарбонатном буфере (рН 9,1), содержащем 1 мг/мл БСА, инкубируют
2 ч при температуре 37 °С, а затем жидкость из пробирок удаляют и осуществляют промывку, как описано
выше.
Вариант 2. В пробирки вносят по 1,0 мл раствора 200 мкг/мл стрептавидина и около 2 или 0 кБк/мл
[125I]стрептавидина в 0,05 М натрий-бикарбонатном буфере (рН 9,1), не содержащем БСА, инкубируют 2 ч
при температуре 37 °С, а затем жидкость из пробирок удаляют и осуществляют промывку, как описано выше.
Далее пробирки из вариантов 1 и 2 обрабатывают одинаково.
В пробирки вносят по 0,5 мл раствора 2 мкг/мл аффинно-очищенных поликлональных антител к ТСГ человека в 0,05 М натрий-фосфатном буфере (рН 7,6), содержащем 1 мг/мл БСА, инкубируют 2 ч при комнатной температуре при постоянном встряхивании, а затем жидкость из пробирок удаляют и осуществляют
промывку, как описано выше.
В пробирки добавляют по 0,5 мл свежеприготовленного раствора 0,5 мг/мл глутарового альдегида в 0,05
М натрий-фосфатном буфере (рН 7,5), содержащем 1 мг/мл БСА, инкубируют при постоянном встряхивании
1 ч при 37 °С, жидкость из пробирок удаляют и осуществляют промывку, как описано выше.
В пробирки вносят по 1,0 мл раствора 50 мг/мл сахарозы и 1 мг/мл БСА в 0,05 М натрий-фосфатном буфере (рН 7,5), выдерживают в течение ночи (14-18 ч) при комнатной температуре, жидкость полностью удаляют, приливают по 1,0 мл раствора 1 мг/мл сахарозы в дистиллированной воде, выдерживают 10 мин, жидкость полностью удаляют и сушат пробирки в сушильном шкафу с внутренней принудительной вентиляцией
при 37 °С в течение 4 ч.
Анализ твердофазных полупродуктов проводят путем измерения общей активности радиоиндикаторов
([125I]БСА-биотина или [125I]стрептавидина) в первом или втором биослоях. Конечный продукт испытывают
в радиоиммуноанализе ТСГ с применением компонентов и методики серийного жидкофазного набора РИАТСГ, а также подвергают полученный твердофазный реагент тесту на ускоренное старение и тесту на экстремальные воздействия.
Результаты сравнительных испытаний продуктов по заявляемому и известному способам представлены в
табл. 1-6 и на рис. 1.
Экспериментальное сравнение промежуточных продуктов показывает, что заявляемый способ дает покрытые пробирки, содержащие в 1,5-3 раза большее количество стрептавидина, чем существующий способ
(табл. 1 и 2). Это происходит за счет улучшенной физической адсорбции стрептавидина (табл. 1) и большей
доступности остатков биотина в предыдущем слое (табл. 2).
Иммуносорбент для связывания ТСГ в радиоиммуноанализе, полученный по заявляемому способу, имеет
в 3 раза большую емкость (табл. 3) и в 2,5 раза меньший коэффициент вариации (табл. 4) связывания антигена, устойчивее на 15 % при хранении в естественных условиях (табл. 5) и в 5 раз при экстремальных воздействиях (табл. 6), чем такой же твердофазный реагент, изготовленный по способу-прототипу.
Система для медицинского микроанализа РИА-ТСГ на основе иммуносорбента, полученного по заявляемому способу, характеризуется большей достоверностью и точностью результатов измерений по сравнению
6
BY 4324 C1
с системой на основе аналогичного реагента, изготовленного по способу-прототипу, так как имеет более широкий диапазон определяемых концентраций и низкую вариабельность определений (рис. 1).
Пример 2.
Получение иммуносорбента для иммунорадиометрического анализа (ИРМА) альфа-фетопротеина (АФП)
путем обработки полистирольных пробирок.
Заявляемый способ применяют, как описано в примере 1, со следующими изменениями.
На стадии физико-химической обработки используют пробирки "ЕlКау", поглощенная доза гаммарадиации составляет 50 кГр, а в качестве органического растворителя используют ледяную уксусную кислоту.
В варианте 1 на стадии формирования первого слоя покрытия раствор 5 мкг/мл конъюгата биотиниммуноглобулин быка инкубируют без встряхивания в течение ночи (14-18 ч) при комнатной температуре, а
на стадии нанесения второго слоя покрытия раствор 20 мкг/мл стрептавидина инкубируют 14-18 ч при комнатной температуре.
В варианте 2 прямую иммобилизацию стрептавидина ведут в течение 14-18 ч из раствора с концентрацией 40 мкг/мл.
На следующей стадии в пробирки (из вариантов 1 или 2) вносят раствор 1 мкг/мл очищенных осаждением и затем биотинилированных моноклональных антител к АФП человека в буфере, содержащем 5 об. %
сыворотки крови лошади в качестве белка-наполнителя (взамен БСА) и инкубируют 14-18 ч при комнатной
температуре.
На стадии химической стабилизации встряхивание с раствором 0,2 мг/мл глутарового альдегида проводят
2 ч при комнатной температуре.
На стадии физической стабилизации пробирки обрабатывают раствором 50 мг/мл лактозы и сушат в течение ночи (14-18 ч) под вакуумом (остаточное давление менее 0,1 торр) при комнатной температуре.
Проводят испытания полупродуктов, как описано в примере 1, и испытывают иммуносорбент в иммунорадиометрическом анализе АФП с применением компонентов и методики лабораторной системы ИРМААФП.
Результаты сравнительных испытаний продуктов по заявляемому и известному способам представлены в
табл. 1-6 и на рис. 2.
Иммуносорбент для связывания АФП в иммунорадиометрическом анализе, полученный по заявляемому
способу, имеет в 3 раза большую емкость (табл. 3) и в 1,2 раза меньший коэффициент вариации (табл. 4) связывания антигена, устойчивее на 15 % при хранении в естественных условиях (табл. 5) и в 5 раз при экстремальных воздействиях (табл. 6), чем такой же твердофазный реагент, изготовленный по способу-прототипу.
Система для медицинского микроанализа ИРМА-АФП на основе иммуно-сорбента, полученного по заявляемому способу, характеризуется большей достоверностью и точностью результатов измерений по сравнению с системой на основе аналогичного реагента, изготовленного по способу-прототипу, так как имеет более
широкий диапазон определяемых концентраций и низкую вариабельность определений (рис. 2).
Пример 3.
Получение иммуносорбента для РИА эстрадиола (Е2) путем обработки полистирольных пробирок.
Заявляемый способ применяют как описано в примере 1 со следующими изменениями после стадии покрытия пробирок стрептавидином.
В пробирки вносят по 0,5 мл раствора 2 мкг/мл очищенного из антисыворотки барана аффинной хроматографией и биотинилированного антитела (IgG) к иммуноглобулину кролика в 0,05 М натрий-фосфатном
буфере (рН 7,5), содержащем 0 или около 2 кБк/мл меченного йодом-125 того же очищенного и биотинилированного антитела в качестве радиоиндикатора и 1 мг/мл БСА, а затем инкубируют и обрабатывают как
описано в примере 1.
На следующей стадии покрытия в пробирки прибавляют по 0,5 мл раствора необработанной поликлональной антисыворотки кролика к эстрадиолу (разбавление 1:150000) в 0,05 М натрий-фосфатном буфере
(рН 6,0), содержащем 1 мг/мл БСА, а затем инкубируют и обрабатывают, как на стадии формирования предыдущего слоя, описано в примере 1.
Проводят анализ промежуточных продуктов, как описано в примере 1, и испытывают иммуносорбент в
радиоиммунном анализе E2 с применением компонентов и методики серийного жидкофазного набора РИАE2.
Результаты сравнительных испытаний продуктов по заявляемому и известному способам представлены в
табл. 1-6 и на рис. 3. Иммуносорбент для связывания Е2 в радиоиммуноанализе, полученный по заявляемому
способу, имеет в 2 раза меньший коэффициент вариации связывания антигена (табл. 4), устойчивее в 4 раза
при хранении в естественных условиях (табл. 5) и в 5 раз при экстремальных воздействиях (табл. 6), чем такой же твердофазный реагент, изготовленный по способу-прототипу. Антигенсвязывающая емкость покрытых пробирок в случае иммуноанализа E2 гораздо ниже потенциальной емкости за счет намеренного нанесения очень малого количества антител как в способе-прототипе, так и в заявляемом способе. Однако более
7
BY 4324 C1
равномерное распределение антител по предыдущему высокоемкому биослою в пробирках, покрытых по заявляемому способу, обеспечивает низкую вариабельность связывания E2.
Система для медицинского микроанализа РИА-Е2 на основе иммуносорбента, полученного по заявляемому способу, характеризуется большей точностью результатов измерений по сравнению с системой на основе аналогичного реагента, изготовленного по способу-прототипу, так как имеет низкую вариабельность
определений (рис. 3).
Пример 4.
Получение иммуносорбента для иммуноферментного анализа (ИФА) трийодтиронина (T3) путем обработки лунок полистирольных микропланшетов.
Партию микропланшетов "Biohit" (10 шт) помещают полиэтиленовый мешок и подвергают действию
гамма-излучения от изотопа 60Со в универсальной гамма-установке УГУ 420 в течение времени (5 ч), достаточного для поглощения дозы 25 кГр. После извлечения из контейнера все планшеты одновременно обрабатывают в одном технологическом режиме с использованием полуавтоматического 8-канального дозатора
жидкостей. Во все 96 (8х12) лунок микропланшета приливают по 0,3 мл концентрированной муравьиной
кислоты, выдерживают в течение ночи (14-16 ч) при комнатной температуре, органический растворитель
полностью удаляют и лунки промывают дистиллированной водой дважды по 0,3 мл. Далее лунки обрабатывают по двум вариантам. Вариант 1 включает последовательное нанесение двух слоев биопокрытия из
конъюгата инертный белок-биотин и биотинсвязывающего белка. Вариант 2 предусматривает однослойное
покрытие путем прямой адсорбции биотинсвязывающего белка.
Вариант 1. Во все лунки микропланшета приливают по 0,3 мл раствора 10 мкг/мл конъюгата БСА-биотин
и 0 или около 2 кБк/мл [125I]БСА-биотин в 0,05 М натрий-бикарбонатном буфере (рН 9,1), инкубируют при
постоянном встряхивании на вибрационном смесителе 2 ч при 37 °С, а затем жидкость из пробирок удаляют,
промывают дважды дистиллированной водой (по 0,3 мл), один раз 1 мл натрий-бикарбонатного буфера, содержащего 0,1 М NaCl и 0,02 % Твин-80, и дважды дистиллированной водой (по 0,3 мл).
Во все лунки вносят по 0,3 мл раствора 50 мкг/мл стрептавидина и около 2 или 0 КБ/мл
[125I]стрептавидина в 0,05 М натрий-бикарбонатном буфере (рН 9,1), содержащем 1 мг/мл БСА, инкубируют
с постоянным встряхиванием 2 ч при температуре 37 °С, а затем жидкость из лунок микропланшета удаляют
и осуществляют промывку, как описано выше.
Вариант 2. Во все лунки вносят по 0,3 мл раствора 100 мкг/мл стрептавидина и около 2 или 0 КБ/мл
[125I]стрептавидина в 0,05 М натрий-бикарбонатном буфере (рН 9,1), не содержащем БСА, инкубируют с постоянным встряхиванием 2 ч при температуре 37 °С, а затем жидкость из лунок микропланшета удаляют и
осуществляют промывку, как описано выше.
Далее лунки из вариантов 1 и 2 обрабатывают одинаково. Во все лунки вносят по 0,2 мл раствора 2
мкг/мл очищенного из антисыворотки барана аффинной хроматографией и биотинилированного антитела
(IgG) к иммуноглобулину кролика в 0,05 М натрий-фосфатном буфере (рН 7,5), содержащем 1 мг/мл БСА,
инкубируют при постоянном встряхивании 2 ч при температуре 37 °С, а затем жидкость из лунок микропланшета удаляют и осуществляют промывку, как описано выше.
Во все лунки вносят по 0,2 мл раствора необработанной поликлональной антисыворотки кролика к Т3
(разбавление 1: 30 000) в 0,05 М натрий-фосфатном буфере (рН 6,0), содержащем 1 мг/мл БСА, инкубируют
при постоянном встряхивании 2 ч при 37 °С, а затем жидкость из лунок удаляют и осуществляют промывку,
как описано выше.
Во все лунки добавляют по 0,2 мл свежеприготовленного раствора 0,1 мг/мл глутарового альдегида в 0,05
М натрий-фосфатном буфере (рН 7,5), содержащего 1 мг/мл БСА, инкубируют при постоянном встряхивании 1 ч при 37 °С, жидкость из лунок удаляют и осуществляют промывку, как описано выше.
Во все лунки вносят по 0,3 мл раствора 20 мг/мл поливинилпирролидона и 1 мг/мл БСА в 0,05 М натрийфосфатном буфере (рН 7,5), выдерживают в течение ночи (14-18 ч) при комнатной температуре, жидкость
полностью удаляют, приливают по 0,3 мл раствора 1 мг/мл сахарозы в дистиллированной воде, выдерживают 10 мин, жидкость полностью удаляют и сушат микропланшеты в сушильном шкафу с внутренней принудительной вентиляцией при 37 °С в течение 4ч.
Проводят испытания полупродуктов, как описано в примере 1, и испытывают полученный твердофазный
реагент в иммуноферментном анализе Т3 с применением компонентов и методики лабораторной системы
ИФА-Т3, а также подвергают реагент тесту на ускоренное старение.
Результаты сравнительных испытаний продуктов по заявляемому и известному способам представлены в
табл. 1-5 и на рис. 4. Иммуносорбент для связывания Т3 в радиоиммуноанализе, полученный по заявляемому
способу, имеет в 1,7 раза меньший коэффициент вариации связывания антигена (табл. 4), и устойчивее в 4
раза при хранении в естественных условиях (табл. 5), чем такой же твердофазный реагент, изготовленный по
способу-прототипу. Антигенсвязывающая емкость покрытых пробирок в случае иммуноанализа Т3 гораздо
ниже потенциальной емкости за счет намеренного нанесения очень малого количества антител как в способе-прототипе, так и в заявляемом способе. Однако более равномерное распределение антител по предыду8
BY 4324 C1
щему высокоемкому биослою в пробирках, покрытых по заявляемому способу, обеспечивает низкую вариабельность связывания Т3.
Система для медицинского микроанализа ИФА-Т3 на основе иммуносорбента, полученного по заявляемому способу, характеризуется большей точностью результатов измерений по сравнению с системой на основе аналогичного реагента, изготовленного по способу-прототипу, так как имеет более низкую вариабельность определений (рис. 4).
Пример 5.
Получение иммуносорбента для иммунолюминометрического анализа (ИЛМА) тестостерона путем обработки лунок полистирольных микропланшетов.
Заявляемый способ применяют, как описано в примере 4, со следующими изменениями.
На стадии физико-химической обработки микропланшетов поглощенная доза гамма-радиации составляет
50 кГр, а в качестве органического растворителя используют ацетонитрил.
В варианте 1 раствор 2 мкг/мл конъюгата БСА-биотин инкубируют без встряхивания в течение ночи (1418 ч) при комнатной температуре, для нанесения второго слоя покрытия раствор 20 мкг/мл стрептавидина
инкубируют 14-18 ч при комнатной температуре.
В варианте 2 раствор 40 мкг/мл стрептавидина инкубируют 14-18 ч при комнатной температуре.
На следующей стадии в пробирки вносят раствор 1 мкг/мл очищенных осаждением и затем биотинилированных моноклональных антител к тестостерону в буфере, содержащем 1 мг/мл БСА, и инкубируют 14-18 ч
при комнатной температуре.
На стадии химической стабилизации встряхивание с раствором 0,3 мг/мл глутарового альдегида проводят
2 ч при комнатной температуре.
На стадии физической стабилизации после обработки микропланшетов стабилизирующими растворами и
промывок осуществляют процесс высушивания в течение ночи (14-18 ч) под вакуумом (остаточное давление
менее 0,1 торр) при комнатной температуре.
Проводят испытания полупродуктов, как описано в примере 1, испытывают конечный твердофазный реагент в иммунолюминометрическом анализе тестостерона с применением компонентов и методики лабораторной системы ИЛМА-тестостерон.
Результаты сравнительных испытаний продуктов по заявляемому и известному способам представлены в
табл. 1-5 и на рис. 5. Иммуносорбент для связывания тестостерона в иммунолюминометрическом анализе,
полученный по заявляемому способу, имеет в 4 раза меньший коэффициент вариации связывания антигена
(табл. 4) и в 2 раза устойчивее при хранении в естественных условиях (табл. 5), чем такой же твердофазный
реагент, изготовленный по способу-прототипу. Антигенсвязывающая емкость покрытых пробирок в случае
иммуноанализа тестостерона гораздо ниже потенциальной емкости за счет намеренного нанесения очень малого количества антител как в способе-прототипе, так и в заявляемом способе. Однако более равномерное
распределение антител по предыдущему высокоемкому биослою в пробирках, покрытых по заявляемому
способу, обеспечивает низкую вариабельность связывания тестостерона.
Система для медицинского микроанализа ИЛМА-тестостерон на основе иммуносорбента, полученного
по заявляемому способу, характеризуется большей точностью результатов измерений по сравнению с системой на основе аналогичного реагента, изготовленного по способу-прототипу, так как имеет низкую вариабельность определений (рис. 5).
Пример 6.
Получение иммуносорбента для ИРМА ферритина путем обработки турбинок из композита полиэтилена
и полипропилена.
Партию (100 шт) турбинок "Elsa" помещают полиэтиленовый мешок и подвергают действию гаммаизлучения от изотопа 60Со в универсальной гамма-установке УГУ 420 в течение времени (5 ч), достаточного
для поглощения дозы 25 кГр. После извлечения из контейнера все турбинки помещают в колбу и обрабатывают различными растворами при постоянном перемешивании на ротационном смесителе. В колбу добавляют 50 мл диметилсульфоксида, инкубируют в течение ночи (14-18 ч) при комнатной температуре, органический растворитель удаляют и промывают турбинки дистиллированной водой дважды по 50 мл.
Далее турбинки обрабатывают по двум вариантам. Вариант 1 включает последовательное нанесение двух
слоев биопокрытия из конъюгата инертный белок-биотин и биотинсвязывающего белка. Вариант 2 предусматривает однослойное покрытие путем прямой адсорбции биотинсвязывающего белка.
Вариант 1. На стадии формирования первого биослоя в колбу вносят 50 мл раствора 5 мкг/мл конъюгата
БСА-биотин в 0,05 М натрий-бикарбонатном буфере (рН 9,1), инкубируют 4 ч при комнатной температуре,
а затем жидкость из колбы удаляют, промывают турбинки дважды дистиллированной водой (по 50 мл),
один раз 50 мл натрий-бикарбонатного буфера, содержащего 0,1 М NaCl и 0,02 % Твин-80, и дважды дистиллированной водой (по 50 мл).
На следующей стадии в колбу прибавляют 50 мл раствора 50 мкг/мл стрептавидина в 0,05 М натрийбикарбонатном буфере (рН 9,1), содержащем 1 мг/мл БСА, инкубируют 4 ч при комнатной температуре, а
затем жидкость из колбы удаляют и осуществляют промывку, как описано выше.
9
BY 4324 C1
Вариант 2. В колбу прибавляют 50 мл раствора 100 мкг/мл стрептавидина в 0,05 М натрийбикарбонатном буфере (рН 9,1), не содержащем БСА, инкубируют 4 ч при комнатной температуре, а затем
жидкость из колбы удаляют и осуществляют промывку, как описано выше.
Далее турбинки из вариантов 1 и 2 обрабатывают одинаково. В колбу приливают 50 мл раствора 2 мкг/мл
очищенного из антисыворотки барана аффинной хроматографией и биотинилированного антитела к IgG
кролика в 0,05 М натрий-фосфатном буфере (рН 7,5), содержащем 1 мг/мл БСА, инкубируют 4 ч при комнатной температуре, жидкость из колбы удаляют и осуществляют промывку, как описано выше. Затем в колбу вносят 50 мл раствора 1 мкг/мл очищенного из антисыворотки кролика аффинной хроматографией и антитела (IgG) к ферритину человека в 0,05 М натрий-фосфатном буфере (рН 7,5), содержащем 0 или около 1
кБк/мл меченного йодом-125 очищенного антитела к ферритину в качестве радиоиндикатора и 1 мг/мл БСА,
инкубируют 4 ч при комнатной температуре, жидкость из колбы удаляют и осуществляют промывку, как
описано выше. На стадии химической стабилизации в колбу добавляют 50 мл свежеприготовленного раствора 0,2 мг/мл глутарового альдегида в 0,05 М натрий-фосфатном буфере (рН 7,5), содержащего 1 мг/мл БСА,
инкубируют 2 ч при комнатной температуре, жидкость из колбы удаляют и осуществляют промывку, как
описано выше.
На стадии физической стабилизации в колбу вносят 50 мл раствора 100 мг/мл сахарозы и 1 мг/мл БСА в
0,05 М натрий-фосфатном буфере (рН 7,5), инкубируют 4 ч при комнатной температуре, жидкость полностью удаляют, приливают 50 мл раствора 2 мг/мл сахарозы в дистиллированной воде, инкубируют 10 мин,
жидкость полностью удаляют, турбинки переносят в сушильный шкаф с внутренней вентиляцией и выдерживают 4 ч при 37 °С. Проводят испытания полученного твердофазного реагента в иммунорадиометрическом анализе ферритина с применением компонентов и методики серийного жидкофазного набора ИРМАферритин, подвергают реагент тесту на ускоренное старение и тесту на экстремальные воздействия. Результаты сравнительных испытаний продуктов по заявляемому и известному способам представлены в табл. 1-6
и на рис. 6. Иммуносорбент для связывания ферритина в иммунорадиометрическом анализе, полученный по
заявляемому способу, имеет в 2,6 раза большую емкость (табл. 3) и в 2 раза меньший коэффициент вариации
(табл. 4) связывания антигена, устойчивее на 20 % при хранении в естественных условиях (табл. 5) и в 8 раз
при экстремальных воздействиях (табл. 6), чем такой же твердофазный реагент, изготовленный по способупрототипу.
Система для медицинского микроанализа ИРМА-ферритин на основе иммуносорбента, полученного по
заявляемому способу, характеризуется большей достоверностью и точностью результатов измерений по
сравнению с системой на основе аналогичного реагента, изготовленного по способу-прототипу, так как имеет более широкий диапазон определяемых концентраций и низкую вариабельность определений (рис. 6).
Пример 7.
Получение иммуносорбента для ИФА аутоантител к тиреопероксидазе (АтТПО) путем обработки лунок
полистирольных микропланшетов.
Заявляемый способ применяют как описано в примере 4 со следующими изменениями. На стадии физико-химической обработки микропланшетов поглощенная доза гамма-радиации составляет 50 кГр, а в качестве органического растворителя используют ацетонитрил.
В варианте 1 на стадии формирования первого слоя покрытия раствор 3 мкг/мл конъюгата овальбуминбиотин инкубируют без встряхивания в течение ночи (14-18 ч) при комнатной температуре. На стадии нанесения второго слоя покрытия раствор 30 мкг/мл стрептавидина инкубируют 4 ч при комнатной температуре.
В варианте 2 раствор 60 мкг/мл стрептавидина инкубируют 4 ч при комнатной температуре.
На следующей стадии во все лунки вносят по 0,25 мкл раствора 1 мкг/мл конъюгата ТПО-биотин в 0,05
М трис-HCl буфере (рН 7,4), содержащем 5 мг/мл БСА, 0,15 М NaCl и 0,05 % твин 20. Планшеты инкубируют при постоянном встряхивании 4 ч при 37 °С, жидкость из лунок удаляют и осуществляют промывку тем
же буфером.
На стадии физической стабилизации лунки планшета обрабатывают раствором 20 мг/мл сахарозы в 0,05
М трис-HCl буфере (рН 7,4), содержащем 1 мг/мл БСА, в течение ночи при 4 °С. Жидкость удаляют, приливают по 0,3 мл раствора 1 мг/мл сахарозы в дистиллированной воде и выдерживают 10 мин при комнатной
температуре. После удаления жидкости планшеты высушивают в течение ночи под вакуумом (остаточное
давление менее 0,1 торр) при комнатной температуре.
Полученный твердофазный антителосвязывающий реагент испытывают в ИФА с применением компонентов и методики стандартного набора реактивов ТРО Ab ELISA ("Биокод", Бельгия), в котором связанное
антитело из крови человека метится антивидовыми антителами, конъюгированными с ферментом, а также
подвергают реагент тесту на ускоренное старение.
Результаты сравнительных испытаний продуктов по заявляемому и известному способам представлены в
табл. 1-5 и на рис. 7. Иммуносорбент для связывания аутоантител к ТПО в иммуноферментном анализе, полученный по заявляемому способу, имеет в 1,5 раза большую емкость (табл. 3) и в 1,5 раза меньший коэффициент вариации (табл. 4) связывания антитела, устойчивее на 36 % при хранении в естественных условиях
(табл. 5).
10
BY 4324 C1
Система для медицинского микроанализа ИФА-АтТПО на основе иммуно-сорбента, полученного по заявляемому способу, характеризуется большей достоверностью и точностью результатов измерений по сравнению с системой на основе аналогичного твердофазного реагента, изготовленного по способу-прототипу,
так как имеет более широкий диапазон определяемых концентраций и низкую вариабельность определений
(рис. 7).
Пример 8.
Получение иммуносорбента для ИРМА аутоантител к тиреоглобулину (АтТг) путем обработки турбинок
из композита полиэтилена и полипропилена.
Заявляемый способ применяют, как описано в примере 6, со следующими изменениями.
На стадии физико-химической обработки турбинок поглощенная доза гамма-радиации составляет 50 кГр,
а в качестве органического растворителя применяют муравьиную кислоту.
В варианте 1 на стадии формирования первого биослоя в колбу вносят 50 мл раствора 5 мкг/мл конъюгата БСА-биотин в 0,05 М натрий-бикарбонатном буфере (рН 9,1)и инкубируют в течение ночи (14-18 ч) при
комнатной температуре. На следующей стадии турбинки обрабатывают раствором 50 мкг/мл стрептавидина
в 0,05 М натрий-бикарбонатном буфере (рН 9,1)в течение 2 ч при 37 °С.
В варианте 2 используют раствор 100 мкг/мл стрептавидина. На следующей стадии в колбу приливают 50
мл раствора 1 мкг/мл конъюгата тиреоглобулинбиотин в 0,05 М трис-HCl буфере (рН 8,0), содержащем 1
мг/мл БСА, и инкубируют 3 ч при 37 °С.
Проводят испытания полученного иммуносорбента в ИРМА с применением компонентов и методики лабораторной системы ИРМА-АтТг, в которой связанное антитело из крови человека метится радиойодированным белком А, и подвергают реагент тесту на ускоренное старение.
Результаты сравнительных испытаний продуктов по заявляемому и известному способам представлены в
табл. 1-5 и на рис. 8. Иммуносорбент для связывания аутоантител к тиреоглобулину в иммунорадиометрическом анализе, полученный по заявляемому способу, имеет в 1,7 раза большую емкость (табл. 3) и в 1,5 раза
меньший коэффициент вариации (табл. 4) связывания антитела, устойчивее на 22 % при хранении в естественных условиях (табл. 5).
Система для медицинского микроанализа ИРМА-АтТг на основе иммуносорбента, полученного по заявляемому способу, характеризуется большей достоверностью и точностью результатов измерений по сравнению с системой на основе аналогичного твердофазного реагента, изготовленного по способу-прототипу, так
как имеет более широкий диапазон определяемых концентраций и низкую вариабельность определений
(рис. 8).
Пример 9.
Получение иммуносорбента в качестве разделяющего твердофазного реагента и его использование в РИА
инсулина.
Заявляемый способ применяют, как описано в примере 3, со следующими изменениями.
Стадии физической и химической стабилизации проводят после нанесения конъюгата биотинантивидовое антитело.
Проводят испытания полученного продукта в качестве разделяющего твердофазного реагента в РИА инсулина с использованием компонентов серийного жидкофазного набора реактивов РИА-инсулин. Для этого
в пробирки, покрытые антивидовым антителом, последовательно прибавляют 0,1 мл пробы (калибровочной, контрольной или неизвестной), 0,2 мл [125I] инсулина и 0,2 мл цельной антисыворотки к инсулину. Пробирки инкубируют при постоянном встряхивании 4 ч при комнатной температуре. Затем жидкость из пробирок удаляют, пробирки дважды промывают дистиллированной водой и измеряют связанную с твердофазным
реагентом активность [125I]инсулина в сцинтилляционном гамма-счетчике. Кроме того, подвергают реагент
тесту на ускоренное старение и тесту на экстремальные воздействия.
Результаты сравнительных испытаний продуктов по заявляемому и известному способам, представлены в
табл. 1-5 и на рис. 9. Иммуносорбент, который получен по заявляемому способу, имеет в 1,2 раза большую
емкость (табл. 3) и в 2,1 раза меньший коэффициент вариации (табл. 4) связывания комплекса видовое антитело-антиген, устойчивее на 8 % при хранении в естественных условиях (табл. 5) и в 2,8 раза при экстремальных воздействиях (табл. 6).
Система для медицинского микроанализа РИА-инсулин на основе иммуно-сорбента, полученного по заявляемому способу, характеризуется большей достоверностью и точностью результатов измерений по сравнению с системой на основе аналогичного твердофазного реагента, изготовленного по способу-прототипу,
так как имеет более широкий диапазон определяемых концентраций и низкую вариабельность определений
(рис. 9).
11
BY 4324 C1
Таблица 1
Физическая адсорбция специфического биотинсвязывающего белка (стрептавидина)
Пример №
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Носитель, иммуноаналитическая система
Пробирки "Бион"; РИА-ТСГ
Пробирки "ЕlКау"; ИРМА-АФП
Пробирки "Бион"; РИА-Е2
Планшеты "Biohit"; ИФА-Т3
Планшеты "Labsystems"; ИЛМА-тестостерон
Турбинки "Elsa"; ИРМА-ферритин
Планшеты "Biohit"; ИФА-АтТПО
Турбинки "Elsa"; ИРМА-АтТг
Пробирки "Бион"; РИА-инсулин
Стрептавидин, нг/носитель
прототип
изобретение
620
990
690
970
540
760
270
410
240
380
310
460
270
380
290
450
540
760
Таблица 2
Биоспецифическое связывание стрептавидина
Пример №
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Носитель, иммуноаналитическая система
Пробирки "Бион"; РИА-ТСГ
Пробирки "ЕlКау"; ИРМА-АФП
Пробирки "Бион"; РИА-Е2
Планшеты "Biohit"; ИФА-Т3
Планшеты "Labsystems"; ИЛМА-тестостерон
Турбинки "Elsa"; ИРМА-ферритин
Планшеты "Biohit"; ИФА-АтТПО
Турбинки "Elsa"; ИРМА-АтТг
Пробирки "Бион"; РИА-инсулин
Пример №
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Стрептавидин, нг/носитель
прототип
изобретение
350
960
310
980
250
840
260
710
230
700
160
480
250
700
180
490
350
960
Таблица 3
Связывающая емкость целевых иммуносорбентов
Вмах, вес. ед./носитель
Носитель, иммуноаналитическая система
прототип
изобретение
Пробирки "Бион"; РИА-ТСГ
200 нг
600 нг
Пробирки "ЕlКау"; ИРМА-АФП
25 нг
76 нг
Пробирки "Бион"; РИА-Е2
50 фмоль
50 фмоль
Планшеты "Biohit"; ИФА-Т3
95 фмоль
95 фмоль
Планшеты "Labsystems"; ИЛМА-тестостерон
500 фмоль
500 фмоль
Турбинки "Elsa"; ИРМА-ферритин
10 нг
26 нг
Планшеты "Biohit"; ИФА-АтТПО
150 фмоль
220 фмоль
Турбинки "Elsa"; ИРМА-АтТг
60 фмоль
100 фмоль
Пробирки "Бион"; РИА-инсулин
65 пкг
80 пкг
Таблица 4
Вариабельность связывания антигенов (антител) целевыми иммуносорбентами
Пример №
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Носитель, иммуноаналитическая система
Пробирки "Бион"; РИА-ТСГ
Пробирки "ЕlКау"; ИРМА-АФП
Пробирки "Бион"; РИА-Е2
Планшеты "Biohit"; ИФА-Т3
Планшеты "Labsystems"; ИЛМА-тестостерон
Турбинки "Elsa"; ИРМА-ферритин
Планшеты "Biohit"; ИФА-АтТПО
Турбинки "Elsa"; ИРМА-АтТг
Пробирки "Бион"; РИА-инсулин
Коэффициент вариации*, %
прототип
изобретение
8,4
3,3
8,2
6,9
8,0
4,3
9,4
5,4
8,6
2,2
7,9
3,8
12,0
8,0
12,4
7,4
10,6
5,0
*Указан для пробы контрольной сыворотки, сертифицированной Государственным НИИ лекарственных
средств и контрольных сывороток, МЗМП РФ.
12
BY 4324 C1
Таблица 5
Устойчивость иммуносорбентов при хранении в естественных условиях
Вмах, % от исходного*
прототип
изобретение
1
Пробирки "Бион"; РИА-ТСГ
79
94
2
Пробирки "ЕlКау"; ИРМА-АФП
66
98
3
Пробирки "Бион"; РИА-Е2
21
90
4
Планшеты "Biohit"; ИФА-Т3
24
93
5
Планшеты "Labsystems"; ИЛМА-тестостерон
48
97
6
Турбинки "Elsa"; ИРМА-ферритин
78
98
7
Планшеты "Biohit"; ИФА-АтТПО
64
90
8
Турбинки "Elsa"; ИРМА-АтТг
70
92
9
Пробирки "Бион"; РИА-инсулин
90
98
* Для свежеприготовленных твердефазных реагентов исходные значения параметра, характеризующего
емкость (Вмах) связывания антигена (антитела), приняты за 100 %.
Таблица 6
Устойчивость полезных промежуточных и конечных продуктов при экстремальных воздействиях
Пример №
Носитель, иммуноаналитическая система
Десорбция, % *
прототип
изобретение
1
Пробирки "Бион"; 1-й слой; стрептавидин
4
3
2
Пробирки "ЕlКау"; 2-й слой; стрептавидин
11
5
9
Пробирки "Бион"; 2-й слой; стрептавидин
14
5
3
Пробирки "Бион"; 3-й слой; IgG(анти-вид.)
40
8
6
Турбинки "Elsa"; 4-й слой; IgG(видовой)
84
11
* Приведено количество радиомеченого компонента, удаленного из соответствующего биослоя конечного
твердофазного реагента в результате экстремального воздействия (в % к начальному содержанию компонента).
Таким образом, приведенные примеры подтверждают существенные отличия, положительные эффекты и
полезность заявляемого способа для иммуноанализа антигенов различных классов (стероиды, йодтиронины,
пептиды, белки) с широким диапазоном молекулярных масс (360 дальтон - 400 000 дальтон) и для иммуноанализа аутоантител в системах разных типов (РИА, ИРМА, ИФА, ИЛМА) с использованием нескольких
наиболее распространенных форм твердофазных носителей (пробирки, микропланшеты, миниатюрные турбинки), изготовленных из разных видов пластмасс.
Результаты испытаний показывают, что заявляемый способ обеспечивает получение качественно нового
иммуносорбента, который можно описать следующим образом: сформированный на твердом полимерном
носителе, биоспецифически ориентированный, физико-химически стабилизированный многослойный белковый комплекс для связывания антигена или антитела в иммуноанализе, характеризующийся более высокой
устойчивостью, большей емкостью и меньшей вариабельностью связывания антигена или антитела по сравнению с целевым продуктом, полученным по способу-прототипу.
Пример №
Носитель, биопокрытие
Источники информации:
1. Butler J.E., Peterman J.H., Suter M., Dierks S.E. The immunochemistry of solid-phase sandwich enzymelinked immunosorbent assays/ Federation Proc. 1987. - V. 46, № 8. - P. 2548-2556.
2. Пикаев А.К. Современная радиационная химия. Твердое тело и полимеры. Прикладные аспекты. - M:
Наука, 1987. - С. 56-59, 350-355, 186-194.
3. Wilchek M., Bayer E.A. Avidin-Biotin Immobilization Systems / In: Immobilized macromolecules. Ed. Secyter U.B. - Springer, 1993. - P. 51-60.
4. Европейский патент № 90112454.5, кл. C01 N 33/543. G01 33 58, 1990.
5. Varga J.M., Fritsch P. Immobilization of small molecules and proteins by radio-derivatized polystyrene//
FASEB J. 1990. - V.4, № 9. - P. 2671-2677.
6. Merck Spectrum 1996. P. 32-33.
7. Hofmann К., Wood S.W., Brinton C.C., Montibeller J.A., Finn F.M. Iminobiotin affinity columns and their
application to retrieval of streptavidin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. - V. 77, № 8. - P. 4666-4668.
8. Taurog A., Dorris M.L., Yokogama N., Slaughler C. Purification and characterization of large, tryptic fragment of human thyroid peroxidase with high catalytic activity // Arch. Biochem. Biophys. 1990. - V. 278, № 2. P. 333-341.
9. Derrien Y., Michel R., Roche J. Recherches sur la preparation et les proprietes de la thyroglobuline pure //
Biochim. Biophys. Acta. 1948. - V. 2. - P. 454-470.
13
BY 4324 C1
Фиг. 2
Фиг. 3
Фиг. 4
Фиг. 5
14
BY 4324 C1
Фиг. 6
Фиг. 7
Фиг. 8
Фиг. 9
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66.
15
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
3
Размер файла
289 Кб
Теги
by4324, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа