close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY4371

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(19)
BY (11) 4371
(13)
C1
7
(51) A 61K 35/74
(12)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ДЛЯ ИММУНОКОРРЕКЦИИ
(21) Номер заявки: а 19980808
(22) 1998.08.27
(46) 2002.03.30
(71) Заявитель: Зайцев В.В., Карпуть И.М., Бабина
М.П., Ковзов В.В., Прощенко В.М. (BY)
(72) Авторы: Зайцев В.В., Карпуть И.М., Бабина
М.П., Ковзов В.В., Прощенко В.М. (BY)
(73) Патентообладатель: Зайцев
Владимир
Владимирович, Карпуть Иван Матвеевич, Бабина
Мария
Павловна,
Ковзов
Владимир
Владимирович, Прощенко Виктор Михайлович
(BY)
(57)
Способ получения препарата для иммунокоррекции, предусматривающий экстракцию биомассы бактерий и выделение целевого продукта, отличающийся тем, что экстракцию биомассы проводят из бактерий
Salmonellum pullorum-gallinarum штамм 24 КСТ 0,5 %-ным раствором аммиака при температуре 80 °С в течение 60 мин, затем инкубируют смесь экстракта и формалинизированных эритроцитов барана, взятых в соотношении 1:1, при температуре 80 °С в течение 60 мин, и отделяют адсорбированный экстракт от эритроцитов путем центрифугирования при 3000 об./мин.
BY 4371 C1
(56)
SU 594173, 1978.
RU 2100028 С1, 1997.
RU 1077089 С, 1994.
Изобретение относится к ветеринарии, а именно к способу получения иммуномодулятора из биомассы
сальмонеллезных бактерий.
Известен способ получения иммуномодулятора, в частности сальмозана-О-антигена S. typhi [1,4]. Сальмозан готовят водно-фенольным методом с последующим осторожным гидролизом уксусной кислотой [2].
Описан способ получения ЛПС из авирулентного штамма 6 S Shigella sonnei, выделенный водно-фенольной
экстракцией при 65 °С по методу O.Westphal с соавторами [6] и очищенный гельфильтрацией на сефадексе
G-200 [3]. ЛПС из бактерий B.pertussis штамма 475 выделен по методу O.Westphal с соавторами [6] и очищен путем трехкратного переосаждения и дальнейшего центрифугирования при 150000 g в течение двух часов [5]. Наиболее близким к изобретению является способ получения биологически активного препарата из
сальмонелла тифи [2]. Однако препарат, полученный из биомассы сальмонелла тифи, обладает высокой токсичностью и реактогенностью. Кроме того, выход целевого биологического продукта из сальмонелла тифи
низкий.
Задача изобретения - увеличение выхода целевого продукта, снижение его токсичности и упрощение способа получения.
Поставленная цель достигается тем, что биомасса пуллорных бактерий Salmonellum pullorum-gallinarum
штамм 24 КСТ экстрагируется 0,5 %-ным раствором аммиака. Полученный экстракт центрифугируют при 9
тыс. об./мин и обрабатывают формализированными эритроцитами барана.
Сущность изобретения.
Способ получения иммуномодулятора, предусматривающий экстракцию биомассы бактерий и выделение
целевого продукта, отличающийся тем, что экстракцию биомассы проводят из бактерий Salmonellum pullorum-gallinarum штамма 24 КСТ 0,5 %-ным раствором аммиака при температуре 80 °С в течение 60 мин, за-
BY 4371 C1
тем инкубируют смесь экстракта и формалинизированных эритроцитов барана, взятых в соотношении 1:1, при
температуре 80 °С в течение 60 мин и отделяют адсорбированный экстракт от эритроцитов путем центрифугирования при 3000 об./мин.
Пример 1.
Пуллорных бактерий выращивают на двухкомпонентной среде из гидролизатов белков крови. Полученную биомассу бактерий отделяют от питательной среды путем центрифугирования при 9 тыс. об./мин. 0,5 %ным раствором аммиака. Гидролиз бактериальной суспензии пуллорных бактерий осуществляют при температуре 80 °С в течение 60 мин. Экстракт освобождают от бактериальных клеток путем центрифугирования
при 9 тыс. об./мин и смешивают с формализированными эритроцитами барана в соотношении 1:1. Смесь инкубируют при 80 °С в течение 60 минут. Адсорбированный экстракт из пуллорных бактерий отделяют от
эритроцитов путем центрифугирования при 3 тыс. об./мин.
Полученный препарат расфасовывают в стеклянные флаконы, герметично укупоривают и стерилизуют
текучим паром.
Выход целевого продукта составляет 11,4 % от исходной биомассы пуллорных бактерий.
Пример 2.
Способ осуществляют аналогично примеру 1, но гидролиз биомассы пуллорных бактерий производят в
0,4 %-ном растворе аммиака. Выход целевого продукта составляет 29,0 %.
Пример 3.
Способ осуществляют аналогично примеру 1, но гидролиз биомассы пуллорных бактерий производят в
0,6 %-ном растворе аммиака. Выход целевого продукта составляет 19,2 %.
Пример 4.
Способ осуществляют аналогично примеру 1, но гидролиз биомассы пуллорных бактерий производят в
0,5 %-ном растворе аммиака при температуре 85 °С. Биологическая активность целевого продукта снижается
на 22 %.
Пример 5.
Способ осуществляют аналогично примеру 1, но гидролиз биомассы пуллорных бактерий производят в
0,5 %-ном растворе аммиака при температуре 75 °С. Биологическая активность целевого продукта снижается
на 42 %.
Пример 6.
Способ осуществляют аналогично примеру 1, но экстракт адсорбируют эритроцитами в соотношении
1,0:1,5. Выход целевого продукта снижается на 34 %.
Пример 7.
Способ осуществляют аналогично примеру 1, но экстракт адсорбируют эритроцитами в соотношении
1,0:0,5.
Токсичность целевого продукта повышается на 72 % и он не пригоден для практического применения.
Пример 8.
Способ осуществляют аналогично примеру 1, но гидролиз биомассу пуллорных бактерий производят при
температуре 80 °С в течение 50 минут. Выход целевого продукта составил 8,6 %.
Пример 9.
Способ осуществляют аналогично примеру 1, но гидролиз биомассы пуллорных бактерий производят при
температуре 80 °С в течение 70 минут. Выход целевого продукта составил 8,4 %.
Экспериментально установлено, что как снижение до 0,3 %, так и повышение до 0,5 % концентрации аммиака приводит к снижению выхода целевого продукта.
При гидролизе биомассы пуллорных бактерий выше или ниже температуры 80 °С отмечается снижение
биологической активности целевого продукта на 22-42 %.
Снижение концентрации эритроцитов при адсорбции экстракта в два раза приводит к резкому повышению токсичности препарата, а повышение в 1:5 раза к снижению выхода целевого продукта.
Таким образом, использование предложенного способа получения иммуномодулятора позволит расширить арсенал лечебных препаратов в ветеринарии и медицине.
Пример 10.
Полученный иммуномодулятор-полисахарид используют телятам в дозе 0,1 мл/кг массы двукратно с интервалом семь дней.
Сравнительная оценка эффективности применения полисахарида по сравнению с известным препаратом
этой группы пирогеналом проводилась в комплексной терапии больных энзоотическим зобом.
Телятам первой подопытной группы однократно внутримышечно вводили иммуномодулятор в дозе 0,1
мл/кг массы внутримышечно. Животным второй подопытной группы в возрастающих дозах внутримышечно
вводили пирогенал в течение четырех дней в возрастающих дозах 1,5; 3,5 и 5 мкг на животное. Результаты
исследований показывают, что оба препарата профилактируют иммунодефицитное состояние, однако более
выраженное стимулирующее влияние на показатели естественной резистентности и иммунной реактивности
отмечается от применения полученного препарата (табл. 1, 2). Так у телят, обработанных указанным препа2
BY 4371 C1
ратом, была выше фагоцитарная активность нейтрофилов и содержание иммуноглобулинов. Одновременно
возрастали среднесуточные приросты живой массы на 125 г.
Пример 11.
Препарат используют поросятам парентерально в дозе 0,1 мл/кг массы двукратно с интервалом семь дней
для профилактики иммунодефицитного состояния и гастроэнтеритов.
С этой целью первой группе животных в дозе 0,1 мг/кг живой массы двукратно с интервалом семь дней
вводили полученный полисахарид. Второй подопытной группе (контрольной) применяли внутримышечно
пирогенал трехкратно с интервалом три-четыре дня в дозах 2,5; 5,0; 10 мкг на животное. Использование полисахарида достоверно способствовало повышению показателей естественной резистентности и иммунной
реактивности, снижению заболеваемости поросят с симптомами диареи (табл. 3).
Пример 12.
Подопытным цыплятам выпаивали препарат в дозе 0,5 мл в двенадцатидневном возрасте и 1 мл в 19дневном возрасте. Сроки применения препарата подобраны с учетом иммунологической перестройки цыплят. Цыплята контрольной группы препарат не получали. Полученные результаты показывают, что новый
микробный полисахарид при энтеральном способе применения оказывает выраженный и длительный стимулирующий эффект. У цыплят отмечается достоверное повышение количества лейкоцитов за счет Т-, потом
В-лимфоцитов, усиливается фагоцитарная активность псевдоэозинофилов, лизоцимная и бактерицидная активность сыворотки крови, увеличивается содержание иммуноглобулинов за счет класса А и G. Снижается
заболеваемость цыплят болезнями с диарейным синдромом.
Таблица 1
Клеточные факторы иммунной защиты телят (M ± m, Р)
Показатели
1
10,1 ± 1,01
7,12 ± 0,56
4,31 ± 0,43
2,04 ± 0,14
66,2 ± 5,98
6,00 ± 0,35
9,92 ± 0,58
Лейкоциты, 109/л
Лимфоциты, 109/л
Т-лимфоциты, 109/л
В-лимфоциты, 109/л
Фагоцитарная активность нейтрофилов, %
Фагоцитарный индекс, ед
Фагоцитарное число, ед
Группы телят
2
7,9 ± 1,02
6,27 ± 1,22
3,30 ± 0,65
1,83 ± 0,41
41,0 ± 5,02*
3,06 ± 0,4**
7,32 ± 0,27*
3
5,83 ± 0,56*
3,86 ± 0,52*
2,58 ± 0,27*
1,0 5± 0,21*
33,3 ± 2,79*
2,90 ± 0,61*
8,45 ± 1,12
Примечание: 1 - телята, обработанные микробным полисахаридом;
2 - телята, обработанные пирогеналом;
3 - телята контрольной группы;
* - уровень значимости критерия достоверности Р < 0,05;
** - Р < 0,1 (к 1-й группе).
Таблица 2
Гуморальные факторы иммунной защиты телят (M ± m, Р)
Показатели
1
74,9 ± 2,44
4,35 ± 0,42
54,4 ± 1,51
8,14 ± 0,67
5,08 ± 0,48
Бактерицидная активность сыворотки крови, %
Лизоцимная активность сыворотки крови, %
Общий белок сыворотки крови, г/л
Иммуноглобулины G + A, г/л
Иммуноглобулин М, г/л
Примечание: 1 - телята, обработанные микробным полисахаридом;
2 - телята, обработанные пирогеналом;
3 - телята контрольной группы;
* - уровень значимости критерия достоверности Р < 0,05;
** - Р < 0,1 (к 1-й группе).
3
Группы телят
2
76,3 ± 5,65
3,02 ± 0,54
47,6 ± 2,56
7,81 ± 0,61
3,00 ± 0,25*
3
57,3± 2,5**
2,70 ± 0,49
49,5 ± 0,51
5,48 ± 0,33*
2,86 + 011*
BY 4371 C1
Таблица 3
Показатели иммунного статуса и заболеваемость поросят
(исследования через 7 дней от последнего применения препаратов)
Показатели
Лейкоциты, /109
Лимфоциты, %
Общий белок, г/л
Иммуноглобулины G + A, %
Иммуноглобулины М, %
Гаптоглобины, %
Бактерицидная активность сыворотки крови, %
Заболеваемость, %
1
12,62 ± 0,37
65,0 ± 0,155
58,78 ± 2,140
11,69 ± 0,516
2,29 ± 0,361
3,87 ± 0,333
69,0 ± 2,64
10
Группы животных
2
22,73 ± 0,344
70,33 ± l,453
49,53 ± 0,213
3,74 ± 0,217
3,91 ± 0,505
следы
58,33 ± 3,18
12
3
12,35 ± 0,526
63,67 ± 4,055
51,30 ± 3,635
5,96 ± 1,793
3,11 ± 0,692
следы
43,17 ± 3,436
34
Примечание: 1 - поросята, обработанные микробным полисахаридом;
2 - поросята, обработанные пирогеналом;
3 - контрольные поросята.
Источники информации:
1. Дельвич А.А., Краснопрошина Л.И., Бобылева Г.В., Кувакина В.И. Протективная активность детоксицированного липополисахарида Neiseria meningitidis серогруппы А в опытах in vivo //Журнал микробиологии. - 1989. - № 5 .- С. 70.
2. Киржаев Ф.С., Бурмистрова Т.И. А. с. СССР 594173, кл. С12К 1/00, А61К 39/02. - 1975. -Опубл.
25.02.78. Бюл. № 7.
3. Тараненко Т.М., Дальвадяну С.М., Бахрах Е.Э. //Проблемы особо опасных инфекций. - Саратов, 1972. Вып. 3 (25). - С.93-98.
4. Boivin A., Mesrobcani L. // C.R. Sos. Biol.- 1933. - Vol. 144. - P.307-310.
5. Dalla Venezia N., Minka S., Brunetean M. et al. // Europ. J. Biochem. - 1985. - Vol. 151. - P. 399-404.
6. Staub A.M. //Meth. carbohydr. Chem. - 1965. - Vol.5. - P. 92-95.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66.
4
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
140 Кб
Теги
by4371, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа