close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY4414

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(19)
BY (11) 4414
(13)
C1
(51)
(12)
7
C 07K 5/06,
A 61K 38/04,
A 61P 37/08
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
СОЕДИНЕНИЕ, ОБЛАДАЮЩЕЕ ИНГИБИРУЮЩЕЙ ТРИПТАЗУ
АКТИВНОСТЬЮ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ НА ЕГО
ОСНОВЕ, СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ И СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ
ИММУНООПОСРЕДОВАННЫХ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ, СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ
ИММУНООПОСРЕДОВАННОГО ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ
КОЖИ
(21) Номер заявки: 950631
(22) 1995.10.11
(86) РСТ/US94/02706, 1994.03.11
(31) 08/030.770; 08/031.187
(32) 1993.03.12; 1993.03.12
(33) US; US
(46) 2002.03.30
(71) Заявитель: АксиС Фармасьютикалс, Инк. (US)
(72) Авторы: СПЕАР, Керри; ДЖОНСОН, Чарльз;
ГШВЕНД, Хайнц (US)
(73) Патентообладатель: АксиС Фармасьютикалс,
Инк. (US)
(56)
US 4201863 A, 1980, US 4456595 A, 1984, EP 372777 A2, 1990.
(57)
Изобретение относится к соединениям, обладающим ингибирующей триптазу активностью, фармацевтическим композициям на их основе, способам лечения и профилактики иммуноопосредованных воспалительных заболеваний дыхательных путей, способу лечения иммуноопосредованного воспалительного состояния
кожи.
Задача настоящего изобретения - повышение эффективности лечения и профилактики иммуноопосредованных воспалительных заболеваний.
Фиг. 1
BY 4414 C1
Ингибиторы триптазы в соответствии с настоящим изобретением представлены соединениями формулы
I:
R1
Ar
O
R5
R6
R7
N
N
R
O
2
R
,
(I)
3
R4
O
или их фармацевтически приемлемыми солями, где заместители и индексы имеют значения, указанные в
описании.
На основе этих соединений предложены фармацевтические композиции, которые особенно эффективны
для лечения и профилактики нарушений, связанных с иммуноопосредованными воспалительными заболеваниями дыхательных путей, а также фармацевтическая композиция для наружного применения при иммуноопосредованных воспалительных заболеваниях кожи.
Изобретение относится к соединениям, обладающим ингибирующей триптазу активностью, фармацевтическим композициям на их основе, способам лечения и профилактики иммуноопосредованных воспалительных заболеваний дыхательных путей, способу лечения иммуноопосредованного воспалительного состояния
кожи.
Низкомолекулярные соединения, ингибирующие ферменты, в частности протеазы, нашли широкое применение для лечения разнообразных болезненных патологий. Многие из таких соединений относятся к так
называемым пептидомиметикам, поскольку, как показывает само их название, они имитируют различные
части пептидных ингибиторов, состоящих только из конденсированных аминокислот. Такие низкомолекулярные пептидомиметические ингибиторы протеаз обладают явными преимуществами перед природными
пептидами и белками в том, что они могут быть более устойчивыми, вследствие чего обладают необходимыми фармакокинетическими и фармацевтическими свойствами.
К примеру, цинк-металлопротеаза, называемая преобразующим антигиотенсин ферментом (ПАФ), отвечает за расщепление ангиотенсина I в ангиотенсин II. Ингибирование ПАФ является средством регулирования высокого кровяного давления. ПАФ эффективно ингибируют меркаптоацильные производные пролина,
в частности дипептидный имитатор, названный каптоприлом (I-[(2S)-3-меркапто-2-метилпропионил]-Lпролин и его аналоги, как раскрывается Welle и Gordon в патенте США 4 456 595.
Серин-протеаза-тромбин является ключевым ферментом в коагуляционном каскаде, ответственным за
свертывание крови. Ингибирование тромбина лекарственным средством является способом уменьшить тенденцию крови к свертыванию с уменьшением тем самым возможности образования тромбов, которые могут
привести к сердечным приступам или шоку. Тромбин эффективно ингибируется рядом пептидомиметиков, в
частности, производными и заменителями аминокислоты, называемой аргинином. К одному из классов ингибирующих миметиков относится семейство N(2)-арилсульфонил-L-аргининамидов, в частности аргипидин
(аргатробан), описанный Okamoto и др. в патенте США 4 201 863.
Астма является сложным заболеванием, протекающим с участием множества биохимических медиаторов
как для острых, так и для хронических проявлений. Астма часто характеризуется прогрессирующим развитием гиперреактивности трахеи и бронхов как к иммуноспецифичным аллергенам, так и к общим химическим и физическим стимулам. Гиперреактивность астматической бронхиальном ткани, как полагают,
является результатом хронических воспалительных реакций, которые раздражают и повреждают эпителиальный слой стенок дыхательных путей и промотируют патологическое утолщение нижележащих тканей.
Исследования бронхиальной биопсией показали, что даже у больных с астмой в мягкой форме имеются признаки воспаления стенок дыхательных путей.
Одним из инициаторов воспалительной последовательности является аллергическая реакция на ингалируемые аллергены. Лейкоциты, несущие IgE рецепторы, в особенности тучные клетки и базофилы, но включая
также моноциты, макрофаги и эозинофилы, присутствуют в эпителиальных тканях и нижележащих тканях
гладких мышц бронхов, где они сначала активируются связыванием специфичных ингалируемых антигенов
с IgE рецепторами. Активированные тучные клетки выделяют ряд предварительно образованных или первичных химических медиаторов воспалительной реакции и ферментов. Кроме того, многочисленные вторичные медиаторы воспаления образуются in siti путем ферментативных реакций в активированных тучных
клетках, в том числе супероксидные медиаторы и медиаторы липидного происхождения. Дополнительно,
путем дегранулирования тучных клеток высвобождаются также несколько больших молекул: протеогликаны, пероксидаза, арилсульфатаза В, и особенно протеазы - триптазы и химотриптиновая протеиназа (химаза). См. "Лекарственная терапия астмы", Гл. 62, 1054-54.
2
BY 4414 C1
Это химическое высвобождение из тучных клеток, вероятно, приводит к ранней бронхостенозной реакции, возникающей у восприимчивых индивидуумов после воздействия аллергенами воздушного происхождения. Ранняя астматическая реакция максимальна спустя примерно пятнадцать минут после воздействия
аллергена, облегчение наступает в последующие один-два часа. У 25-35 % индивидуумов вслед за ранней астматической реакцией следует дальнейшее ухудшение функционирования дыхательных путей, которое начинается в пределах нескольких часов и достигает максимума через шесть-двенадцать часов после
воздействия аллергена. Такая поздняя астматическая реакция сопровождается заметным увеличением числа
воспалительных клеток, инфильтрующихся через бронхиальные гладкие мышцы и эпителиальные ткани и
диссеминирущихся в дыхательные пути. Такие клетки включают эозинофилы, нейтрофилы и лимфоциты, и
все указанные клетки привлекаются к месту выделения тучными клетками хемотактических агентов. Инфильтрующиеся клетки сами приобретают активность в течение поздней фазы реакции. Поздняя астматическая реакция, как полагают, является вторичной воспалительной реакцией, медиаторами которой частично
являются продукты секреторной активности макрофагов.
Схожий ряд воспалительных реакций протекает в слизистой верхнего дыхательного тракта, обычно в ответ на аллергены из воздуха. Как и при астме, тучные клетки активируются перекрестным сшиванием молекул IgE с конкретными антигенами. При аллергическом, перенниальном или вазомоторном ринитах тучные
клетки могут активироваться в отсутствие видимого воздействия конкретных антигенов. В любом случае
тучные клетки при дегранулировании выделяют первичные и вторичные медиаторы. К месту выделения
привлекаются эозинофилы и макрофаги с возникновением хронической воспалительной реакции. Разрушение эпителиальной ткани носа часто происходит при реакциях поздней фазы.
Триптаза является основной секреторной протеазой тучных клеток человека и, как полагают, участвует в
нейропептидном процессинге и воспалении тканей. Зрелая триптаза человека является гликозилированным,
связанным с гепарином тетрамером гетерогенных, каталитически активных субъединиц. Аминокислотная
последовательность мономера триптазы также как и его генная структура не имеют близких аналогов среди
многочисленных уже охарактеризованных серин-протеиназ.
Vanderslice et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3811-3815; Miller et al. (1990) J. Clin. Invest. 86,
864-870; Miller et al. (1989) J. Clin. Invest. 84, 1188-1195; Vanderslice et al. (1989) Biochemistry 28, 41484155; and Katunuma et al. (1990) Monographs in Allergy 27, 51-56.
Триптаза сохраняется в секреторных гранулах тучных клеток. После активации тучных клеток триптаза
человека может быть легко обнаружена в различных биологических жидкостях. Например, после анафилаксии триптаза появляется в кроветоке, где может быть обнаружена в течение нескольких часов. Schwartz et al.
(1987) N. Engl. J. Med. 316, 1622-1626. Проявление триптазы обнаружено в образцах назальной и легочной
промывной жидкости атопических субъектов, провоцированных специфичным антигеном. Castells and
Schwartz (1988) J. Allerg. Clin. Immunol. 82, 348-355; Wenzel et al. (1988) Am. Rev. Resp. Dis. 141, 563-568.
Уровень триптазы в легочной промывной жидкости, отобранной у атопических астматиков, повышается после провокации эндобронхиальным аллергеном (там же). У некоторых курильщиков сигарет наблюдается
поразительное повышение уровня триптазы в бронхоальвеолярной промывной жидкости по сравнению с
контрольной группой некурящих, и это наблюдение служит некоторой поддержкой гипотезе о том, что выделение протеина из активированных тучных клеток может вносить свой вклад в разрушение легких курильщиков при эмфиземе. Kalenderian et al. (1988) Chest 94, 119-123. Кроме того, показано, что триптаза
является эффективным митогеном, что предполагает ее участие в легочном фиброзе и промежуточных легочных заболеваниях. Ruoss et al. (1991) J. Clin. Ivest 88,493-499.
Триптаза участвует в самых разнообразных биологических процессах, включая разрушение сосудорасширяющих и бронхорелаксирующих нейропептидов (Caughey et al. (1988), J. Pharmacol. Exp. Ther. 244, 133-137;
Franconi et al. (1988) J. Pharmacol. Exp. Ther. 248, 947-951; and Tam et al. (1990) Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 3,
175-179). Эти исследования предполагают, что триптаза возможно увеличивает бронхостеноз при астме путем разрушения расширяющих бронхи пептидов.
Кроме того, показано, что триптаза расщепляет α-цепи фибриногена, а также высокомолекулярный кининоген с возможным выделением кининов, т.е. вместе с гепарином может выступать в роли местного антикоагулянта. Способность триптазы активировать простромелизин (pro-ММР-3) и просоллагеназу (pro-ММР1) через ММР-3 предполагает, что триптаза может участвовать в воспалении тканей и их ремоделировании.
Обнаружение этого также указывает на возможность участия в разрушении суставов при ревматоидном
артрите. Кроме того, показано, что триптаза расщепляет родственный гену кальцитонина пептид. Поскольку
этот пептид участвует в нейрогенном воспалении, триптаза может являться фактором в регуляции реакции
прилива крови при кожном нейрогенном воспалении. Caughey (1991) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 4, 387-394.
Недавно появилось сообщение о том, что различные формы триптазы расщепляют протромбин до тромбина и придают CD4 + Т-лимфоцитов способность распознавать ВИЧ вирусный белок оболочки gp120
(Katunuma et al. (1990) Monographs in Allergy 27, 51-66).
Астма стала наиболее обычной хронической болезнью в промышленных странах. Применяемые в настоящее время способы и лечебные средства не доказали свою эффективность в лечении астмы и других
3
BY 4414 C1
иммуноопосредованных заболеваний. По этой причине желательно создать усовершенствованные препараты
и способы, которые не имели бы недостатков обычных средств и способов и были бы эффективны в лечении
указанных заболеваний.
Настоящее изобретение относится к ингибиторам триптазы, представленным соединением формулы I:
R1
Ar
O
R5
R6
R7
N
,
N
R
2
R
(I)
3
O
R4
O
или его фармацевтически приемлемой солью, в котором
Ar - замещенный гидроксилом арил или замещенный гидроксилом гетероарил, где гидроксил находится в
орто-положении относительно боковой амидной цепи и где, если Ar - замещенный гидроксилом арил, тогда
ароматический цикл, содержащий боковую амидную цепь, не замещен галогеном и не содержит С1-С6алкильную группу в орто-положении к гидроксилу;
R1 - водород, С1-С6-алкил, арил-С1-С6-алкил, гетероарил-С1-С6-алкил;
R2 - водород или С1-С6-алкил;
R3 выбран из группы, содержащей:
NH
(C H 2)m
X
NH
2
,
NH
(C H 2)n
A
(C H 2)w
X
,
NH
2
NH
2
,
NH
2
,
NH
2
,
NH
(C H 2)p
(C H 2)q NH
NH
(C H 2)p
(C H 2)q
NH
(C H 2)p
(C H 2)r
(C H 2)s
X
(CH 2)t
(CH 2)p
NH
N
(CH 2)t
NH
2
,
NH
(CH 2)p
(C H 2)u
X
NH
(CH 2)v
NH
2
,
2,
где m - целое число 3-6; n - целое число 0-3; p - целое число 0-2; q - целое число 0-2; r - целое число 0-5; s целое число 0-2; t - целое число 1-3; u - 1 или 2; v - целое число 3-6; w - целое число 0-3; A - –СН = СН– или –
С≡С–, и Х - –NH– или –CH2–;
R4 - С1-С6-алкил;
R5 и R6 независимо водород или С1-С6-алкил,
или R4 и R5 вместе с азотом и углеродом, к которым они присоединены, образуют замещенный гидроксилом 4-членный, 5-членный или 6-членный гетероцикл и R6-водород,
или R4 и R6 вместе с азотом и углеродом, к которым они присоединены, образуют замещенный гидроксилом 4-членный, 5-членный или 6-членный гетероцикл и R5-водород;
R7 представляет группу –OR8 или –NR8R9, где R8 и R9 независимо выбраны из группы, включающей водород, С1-С6-алкил, арил, арил-С1-С6-алкил или гетероарил-С1-С6-алкил, или R8 и R9 вместе с азотом, к которому они присоединены, образуют замещенный гидроксилом 5-членный или 6-членный гетероцикл;
4
BY 4414 C1
при этом
арил означает фенил, бифенил, нафтил,
гетероарил означает пиридил, хиноксалинил, нафтиридинил.
По предпочтительному осуществлению Ar представляет
1-гидрокси-2-нафтил, 2-гидрокси-1-нафтил, 3-гидрокси-2-пиридил или 2-гидрокси-3-хиноксалил;
R1 - водород, С1-С6-алкил, арил-С1-С6-алкил, гетероарил-С1-С6-алкил;
R2 - водород или С1-С6-алкил;
R3 выбран из группы, содержащей:
NH
(C H 2)m
X
NH
2
,
NH
(C H 2)n
(C H 2)w
A
X
NH
2
NH
2
NH
2
,
NH
(C H 2)p
(C H 2)q NH
,
NH
(C H 2)p
,
где m - целое число 3-6; n - целое число 0-3; p - целое число 0-2; q - целое число 0-2; w - целое число 0-3; А –СН = СН– или –С≡С– и Х - –NН– или –СН2–;
R4 - С1-С6-алкил;
R5 и R6 независимо водород,
или R4 и R5 вместе с азотом и углеродом, к которым они присоединены, образуют замещенный гидроксилом 4-членный, 5-членный или 6-членный гетероцикл и R6 - водород;
R7- группа –ОН, –ОСН3, –NH2, -3'-аминокарбокси-1'-пиперидил или –N(CH3)2;
при этом арил и гетероарил имеют указанные выше значения.
Особенно предпочтительным соединением формулы I, обладающим ингибирующей триптазу активностью, является соединение 3 в таблицах I и II:
(C H 2)q
H
O
CONH
2
N
N
OH
O
H
N
NH
HN
2
Другим предпочтительным соединением формулы I, обладающим ингибирующей триптазу активностью,
является соединение 15 из таблиц I и II:
H
O
CONH
N
N
OH
O
H
N
NH
HN
5
2
2
BY 4414 C1
Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, способным ингибировать триптазу,
включающим в качестве активного ингредиента любое из описанных выше соединений формулы I в терапевтически эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель. Эти фармацевтические композиции могут быть изготовлены в виде различных форм, включая пероральные дозированные формы, а
также в виде растворов для инъекций и вливаний. В частности, изобретение относится к аэрозольной фармацевтической композиции для лечения иммуноопосредованных воспалительных заболеваний дыхательных
путей, содержащей в качестве активного ингредиента соединение формулы I в терапевтически эффективном
количестве и фармацевтически приемлемый носитель в виде аэрозольного раствора или сухого порошка,
предназначенной для лечения или профилактики астмы, и особенно, гиперреактивности, связанной с хронической астмой, а также хронического ринита. Аэрозольная композиция в соответствии с настоящим изобретением может быть использована в сочетании с противовоспалительными или иными средствами лечения
дыхательных путей, например, β-адренергическими агонистами, противовоспалительными кортикостероидами, антихолинергениками и т.п.
Изобретение включает также и фармацевтическую композицию для лечения иммуноопосредованных
воспалительных состояний кожи, включающую соединение формулы I в терапевтически эффективном количестве в сочетании с нетоксичным фармацевтически приемлемым носителем для наружного применения.
Настоящее изобретение относится также к способу лечения и способу профилактики иммуноопосредованных воспалительных заболеваний дыхательных путей и к способу лечения иммуноопосредованных воспалительных состояний кожи, согласно которым больной с иммуноопосредованным воспалительным
заболеванием, которое поддается лечению с помощью ингибитора триптазы, получает терапевтически эффективное количество соединения формулы I по настоящему изобретению.
Краткое описание диаграмм.
На рис. 1 приведен график, показывающий специфичную легочную устойчивость у овец как функцию
времени в часах после провокации антигеном. Чистыми квадратиками указаны контрольные величины и зачерненными кружками указаны величины для тех же животных после введения соединения 3 из таблиц I и II.
На рис. 2 приведен график, показывающий проявление гиперреактивности у овец к индуцируемому карбахолом бронхостенозу через 24 часа после провокации аллергеном в случае, если соединение 3 из таблиц I и
II вводят перед карбахолом. Темный сплошной столбик соответствует контролю (нулевая линия). Более
светлый сплошной столбик соответствует лекарственному средству (нулевая линия). Заштрихованный столбик соответствует контролю (после антигена). Белый столбик соответствует лекарственному средству (после
антигена).
Описание конкретных вариантов осуществления изобретения.
I. Определения и общие параметры.
Следующие определения приведены для иллюстрации и определения значения и объема разнообразных
терминов, применяемых для раскрытия изобретения.
"Иммуноопосредованное воспалительное заболевание" включает, в основном, заболевания, связанные с
выделением медиатора тучными клетками и восприимчивые к лечению ингибитором триптазы. Примеры подобных нарушений включают заболевания с гиперчувствительностью непосредственного типа, такие, как астма,
аллергический ринит, крапивница, ангио-эдема и экзематозный дерматит (атопический дерматит), и анафилаксия, а также гиперпролиферативное заболевание кожи, желудочные язвы, воспалительные заболевания в
кишечнике, воспалительные состояния кожи и т.п.
"Гиперреактивность" относится к поздней фазе бронхостеноза и гиперреактивности, связанной с хронической астмой. Гиперреактивность астматической бронхиальной ткани, как полагают, является результатом
хронических воспалительных реакций, которые раздражают и повреждают эпителиальный слой стенок дыхательных путей и промотируют патологическое утолщение нижележащих тканей.
"Галоген" относится к атомам фтора, брома, хлора и йода.
"Гидроксил" относится к группе -ОН.
"C1-С6-алкил" относится к алкильной группе с циклической разветвленной или прямой цепью от одного
до шести атомов углерода. Этот термин далее иллюстрируется такими группами, как метил, этил, н-пропил,
изопропил, н-бутил, трет-бутил, изобутил (или 2-метилпропил), циклопропилметил, изоамил, н-амил и гексил.
"Арил" или "Ar" относится к ароматической карбоциклической группе, имеющей единственный цикл
(например, фенил), несколько циклов (например, бифенил) или несколько конденсированных циклов, из которых хотя бы один цикл ароматический (например: 1,2,3,4-тетрагидронафтил, нафтил, антрил или фенантрил), которые могут быть необязательно незамещены или замещены, например: галогеном, C1-С6-алкилом,
C1-С6-алкокси, C1-С6-алкилтио, трифторметилом, C1-С6-ацилокси, арилом, гетероарилом и гидрокси. Однако
в соответствии с настоящим изобретением ароматический цикл, содержащий боковую амидную цепь, не
может быть дополнительно замещен галогеном. Кроме того, ароматический цикл, содержащий боковую
амидную цепь, не может содержать C1-С6-алкильную группу в орто-положении по отношению к гидроксильной группе (т.е. в мета-положении к боковой амидной цепи).
6
BY 4414 C1
"Гетероцикл" относится к насыщенной, ненасыщенной или ароматической карбоциклической группе, содержащей один цикл (например, морфолино, пиридил или фурил) или несколько конденсированных циклов
(например, нафтиридинил, хиноксалил, хинолинил, индолизинил или бенз[в]тиенил) и имеющий, по меньшей мере, один гетероатом, такой, как N, O или S в кольце, который незамещен или замещен, например, галогеном, C1-С6-алкилом, C1-С6-алкоксигруппой, C1-С6-алкилтиогруппой, трифторметилом, C1-С6ацилоксигруппой и гидроксигруппой.
Термин "гетероарил" или ''HetAr" относится к гетероциклу, в котором хотя бы один гетероциклический
цикл - ароматический.
"Арил-C1-С6-алкил" относится к группе -R-Ar, где Ar - арильная группа и R-алифатическая группа с прямой цепью или разветвленной цепью. Арилалкильные группы могут необязательно быть незамещены или
замещены, например, галогеном, C1-С6-алкилом, C1-С6-алкокси, C1-С6-алкилтио, трифторметилом, C1-С6ацилокси и гидрокси.
"Гетероарил-C1-С6-алкил" относится к группе -R-Het Ar, где Het Ar- гетероарильная группа и R- алифатическая группа с прямой цепью или разветвленной цепью. Арил-C1-С6-алкильные группы могут необязательно быть незамещены или замещены, например, галогеном, C1-С6-алкилом, C1-С6-алкокси, C1-С6-алкилтио,
трифторметилом, C1-С6-ацилокси и гидрокси.
Термин "фармацевтически приемлемая соль" относится к тем солям, которые сохраняют биологическую
активность и свойства родоначального соединения и которые не являются биологически или по каким-то
иным причинам нежелательными.
Термин "фармацевтически или терапевтически приемлемый носитель" относится к несущей среде, не
влияющей на проявление биологической активности активных компонентов, и которая нетоксична для хозяина или больного.
"Стереоизомер" относится к химическому соединению с той же молекулярной массой, химическим составом и строением, что и у другого соединения, но с различным построением атомов. То есть, некоторые
одинаковые химические фрагменты имеют различную ориентацию в пространстве, вследствие чего в чистом
виде способны вращать плоскость поляризации света. Однако некоторые чистые стереоизомеры могут обладать
столь слабым оптическим вращением, что его невозможно обнаружить с помощью современных приборов.
Соединения настоящего изобретения могут иметь один или несколько асимметрических атомов углерода,
вследствие чего включают разнообразные стереоизомеры. Все стереоизомеры включены в объем изобретения.
"Лечение" или "обработка" относится к любому введению ингибитора триптазы in vitro или in vivo и это
определение включает:
(I) подавление симптомов заболевания;
(II) уменьшение или подавление долговременных проявлений заболевания, и/или
(III) облегчение симптомов заболевания.
II. Ингибиторы триптазы.
Настоящее изобретение относится к композициям, включающим эффективный ингибитор серинпротеазы, и более конкретно, ингибитор триптазы, которые применимы для уменьшения иммуноопосредованных воспалительных заболеваний, в частности бронхостеноза, вызываемого аллергической провокацией
у астматических животных.
Ингибиторы триптазы являются веществами, замедляющими или не допускающими проявления активности триптазы. В соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения ингибиторы триптазы представлены соединением формулы I:
R1
Ar
O
R5
R6
R7
N
N
R
2
R
3
R4
O
O
(I)
или его фармацевтически приемлемой солью, в котором
Ar - замещенный гидроксилом арил или замещенный гидроксилом гетероарил, где гидроксил находится в
орто-положении относительно боковой амидной цепи и где, если Ar - замещенный гидроксилом арил, тогда
ароматический цикл, содержащий боковую амидную цепь, не замещен галогеном и не содержит С1-С6алкильную группу в орто-положении к гидроксилу;
R1 - водород, С1-С6-алкил, арил-С1-С6-алкил, гетероарил-С1-С6-алкил;
R2 - водород или С1-С6-алкил;
R3 выбран из группы, содержащей:
7
BY 4414 C1
NH
(C H 2)m
X
NH
2
,
NH
(C H 2)n
(C H 2)w
A
X
,
NH
2
NH
2
,
NH
2
,
NH
2
,
NH
(C H 2)p
(C H 2)q NH
NH
(C H 2)p
(C H 2)q
NH
(C H 2)p
(C H 2)r
(C H 2)s
X
(CH 2)t
(CH 2)p
NH
N
(CH 2)t
NH
2
,
NH
(CH 2)p
(C H 2)u
X
NH
(CH 2)v
NH
2
,
2,
где m - целое число 3-6; n - целое число 0-3; p - целое число 0-2; q - целое число 0-2; r - целое число 0-5; s целое число 0-2; t - целое число 1-3; u - 1 или 2; v - целое число 3-6; w - целое число 0-3; A - –СН = СН– или –
С≡С–, и Х - –NH– или –CH2–;
R4 - С1-С6-алкил;
R5 и R6 независимо водород или С1-С6-алкил,
или R4 и R5 вместе с азотом и углеродом, к которым они присоединены, образуют замещенный гидроксилом 4-членный, 5-членный или 6-членный гетероцикл и R6-водород,
или R4 и R6 вместе с азотом и углеродом, к которым они присоединены, образуют замещенный гидроксилом 4-членный, 5-членный или 6-членный гетероцикл и R5-водород;
R7 представляет группу –OR8 или –NR8R9, где R8 и R9 независимо выбраны из группы, включающей водород, С1-С6-алкил, арил, арил-С1-С6-алкил или гетероарил-С1-С6-алкил, или R8 и R9 вместе с азотом, к которому они присоединены, образуют замещенный гидроксилом 5-членный или 6-членный гетероцикл;
при этом
арил означает фенил, бифенил, нафтил,
гетероарил означает пиридил, хиноксалинил, нафтиридинил.
По предпочтительному осуществлению Ar представляет
1-гидрокси-2-нафтил, 2-гидрокси-1-нафтил, 3-гидрокси-2-пиридил или 2-гидрокси-3-хиноксалил;
R1 - водород, С1-С6-алкил, арил-С1-С6-алкил, гетероарил-С1-С6-алкил;
R2 - водород или С1-С6-алкил;
R3 выбран из группы, содержащей:
NH
(C H 2)m
X
NH
2
,
NH
(C H 2)n
A
(C H 2)w
8
X
NH
2
,
BY 4414 C1
NH
(C H 2)p
(C H 2)q NH
NH
2
,
NH
(C H 2)p
NH
2
,
где m - целое число 3-6; n - целое число 0-3; p - целое число 0-2; q - целое число 0-2; w - целое число 0-3; А –СН = СН– или –С≡С–, и Х - –NН– или –СН2–;
R4 - С1-С6-алкил;
R5 и R6 независимо водород,
или R4 и R5 вместе с азотом и углеродом, к которым они присоединены, образуют замещенный гидроксилом 4-членный, 5-членный или 6-членный гетероцикл и R6-водород;
R7 - группа –ОН, –ОСН3, –NH2, -3'-аминокарбокси-1'-пиперидил или –N(CH3)2;
при этом арил и гетероарил имеют указанные выше значения.
Предпочтительным ингибитором триптазы является соединение 3 из таблиц I и II:
(C H 2)q
H
O
CONH
2
N
N
OH
O
H
N
NH
HN
2
Кроме того, предпочтительным ингибитором триптазы является соединение 15 из таблиц I и II:
H
O
CONH
2
N
N
OH
O
H
N
NH
HN
2
Другим предпочтительным ингибитором триптазы является соединение 21 из таблиц I и II:
H
O
CONH
N
N
OH
O
HN
NH
HN
9
2
2
BY 4414 C1
Ингибиторы триптазы по настоящему изобретению могут быть синтезированы известными методами из
легко доступных продуктов, как более подробно описано далее.
Соединения по данному изобретению способны, в зависимости от природы функциональных групп, образовывать соли присоединения с разнообразными неорганическими и органическими кислотами и основаниями.
Эти соли могут быть образованы с неорганическими кислотами, такими как: хлористоводородная кислота,
бромистоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота и т.п., и органическими
кислотами, такими как: уксусная кислота, пропионовая кислота, гликолевая кислота, пировиноградная кислота, щавелевая кислота, яблочная кислота, малоновая кислота, янтарная кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота, винная кислота, лимонная кислота, бензойная кислота, коричная кислота, миндальная
кислота, метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, п-толуолсульфокислота, салициловая кислота
и т.п.
Соли могут быть образованы также из остатка карбоновой кислоты путем обработки щелочными металлами или основаниями щелочных металлов, например гидроксидами щелочных металлов и алкоксидами щелочных металлов, или щелочноземельными металлами или основаниями щелочноземельных металлов,
например гидроксидами щелочноземельных металлов и алкоксидами щелочноземельных металлов. Кроме
того, соли могут быть образованы из карбоновых кислот и органического основания, например, триэтиламина, диэтиламина, этаноламина, пиперидина, изопропиламина, холина, кофеина и т.п.
Соли могут быть образованы обычными способами, например взаимодействием продукта в виде свободной кислоты или основания с одним или несколькими эквивалентами соответствующего основания или кислоты в растворителе или среде, в которой соль нерастворима, или в растворителе, например воде, которую
затем удаляют в вакууме или сушкой вымораживанием, или обменом катионов существующей соли на другой катион на приемлемой ионообменной смоле.
III. In vitro и in vivo исследование.
Методики in vitro для отбора потенциальных ингибиторов по их способности подавлять триптазу известны специалистам. Stirzebecher и др. (1992) Biol. Chem. Hoppe. Seyler 373, 1025-1030. Как правило, в таких
анализах определяют индуцируемый триптазой гидролиз хромогенных веществ на пептидной основе. Подробности приводимой в качестве примера методики приводятся ниже.
Кроме того, активность соединений по настоящему изобретению может быть оценена in vivo на одной из
многочисленных моделей на животных. Larson "Экспериментальные модели обратимой непроходимости
дыхательных путей", в издании: Легкие. Научные основы, Crystal, West и др., ред., Равен Пресс, Нью-Йорк,
1991; Warner и др. (1990) Am. Rev. Respir. Dis. 141, 253-257.
Идеальной моделью на животных была бы модель, дублирующая главные клинические и физиологические признаки астмы человека, включая гиперреактивность дыхательных путей к химическим медиаторам и
физическим стимулам; обратимость непроходимости дыхательных путей под действием лекарственных
средств, полезных для человека (β-адренергетики, метилксантины, кортикостероиды и т.п.); воспаление дыхательных путей при инфильтрации активированных лейкоцитов и хронические воспалительные вырожденные изменения, такие, как утолщение мембранного основания, гипертрофия гладких мышц и повреждение
эпителия. Виды, используемые в качестве моделей на животных, включают мышей, крыс, морских свинок,
кроликов, собак и овец. Все они характеризуются определенными ограничениями, и выбор необходимой модели животного зависит от проблемы, которую предстоит решить.
Начальная астматическая реакция может быть оценена на морских свинках и собаках, и особенно на помеси базенджи с борзой, у которых развивается неспецифичная гиперреактивность дыхательных путей к
многочисленным неаллергенным веществам, например метахолину и лимонной кислоте. Некоторые отобранные овцы проявляют двойную реакцию после провокации антигеном с Ascaris белками. У животных с
двойственной реакцией вслед за начальной астматической реакцией (HAP) через 6-8 ч после провокации
следует поздняя астматическая реакция (ПАР). У животных, проявляющих ПАР гиперреактивность к холинергическому агонисту карбахолу, повышается через 24 провокации антигеном.
Для выявления противоастматического действия соединений по настоящему изобретению использована
модель на аллергических овцах. Введение композиций, представляющих собой аэрозольные растворы соединений по настоящему изобретению, аллергическим овцам до или после воздействия специфичными аллергенами показало, что такие препараты значительно уменьшают или устраняют позднюю астматическую
реакцию и последующую гиперреактивность.
Соединения по данному изобретению применимы также для лечения других иммуноопосредованных
воспалительных заболеваний, в которых в патологическое состояние вносит вклад активность триптазы. Такие заболевания включают воспалительные состояния, ассоциируемые с тучными клетками, например, ревматоидный ринит, ревматоидный спондилит, остеоартрит, подагрический артрит и прочие артритные
состояния, воспалительная болезнь кишечника, язва желудка и различные кожные состояния.
Эффективность соединений по настоящему изобретению для лечения широкого спектра иммуноопосредованных воспалительных нарушений может быть выявлена методиками, проводимыми либо in vitro, либо in
vivo. Так, противовоспалительная эффективность соединений настоящего изобретения может быть показана
10
BY 4414 C1
в анализах, хорошо известных специалистам, например, по методике обратимой пассивной реакции Артуса
(RPAP)-PAW (Ganguly и др. (1992) патент США 5, 123, 352). Анализы для определения терапевтической
ценности соединений в лечении различных кожных состояний, например гиперпролиферативной кожной болезни, хорошо известны специалистам, например тест с действием арахидоновой кислоты на кожу уха мыши
(там же). Противоязвенная активность соединений по настоящему изобретению может быть выявлена по методике, приведенной в работе: Chiu и др. (1984) Archives Internationales de Pharmacodynamie et de Therapie
270, 128-140.
IV. Введение in vivo.
Согласно настоящему изобретению, больному, страдающему иммуноопосредованным воспалительным
нарушением, вводят терапевтически или фармацевтически эффективное количество ингибитора триптазы и,
в частности, соединения формулы I.
Так, фармацевтическую композицию, включающую соединение формулы I, применяют для профилактики
или облегчения астмы. При использовании таких композиций для лечения астмы они могут быть введены
профилактически перед воздействием аллергена или иного преципитационного фактора или после такого
воздействия. Соединения по настоящему изобретению особенно полезны для уменьшения интенсивности
разрушения тканей на поздней фазе как сезонного, так и хронического ринита. С другой стороны настоящее
изобретение относится к профилактике и лечению других иммуноопосредованных воспалительных заболеваний, ассоциируемых с тучными клетками, например, крапивницы и ангиоэдемы, экзематозного дерматита
(атопического дерматита), анафилаксии, а также гиперпролиферативного заболевания кожи, язв желудка и
т.п.
Композиции, содержащие соединения, могут быть назначены в профилактических и/или в лечебных целях. В лечебном приложении препараты вводят уже страдающему заболеванием больному, и как указано
выше, в количестве, достаточном для излечения или хотя бы частичной остановки симптомов заболевания и
его осложнений. Необходимое для этого количество определяется как "терапевтически эффективное количество или доза". Необходимые для этого количества зависят от тяжести и протекания болезни, предшествующей терапии, общего состояния больного и реакции на лекарственное средство и оцениваются лечащим
врачом.
В профилактическом приложении композиции, содержащие соединения по изобретению, вводят больному, подверженному или каким-либо иным образом рискующему заболеть конкретным заболеванием. Такие
количества определяются как "профилактически эффективное количество или доза". И в этом случае точные
количества зависят от состояния здоровья больного, его веса и т.п.
Как только наступает улучшение состояния больного, если необходимо, вводят поддерживающую дозу.
Затем дозировка или частота введения, или то и другое, могут быть снижены, в зависимости от симптомов,
до уровня, при котором сохраняется улучшенное состояние. При смягчении симптомов заболевания до необходимого уровня лечение может быть прекращено. Однако больному может потребоваться периодическое
лечение на долговременной основе при каком-либо повторном появлении симптомов заболевания.
В целом, приемлемая эффективная доза ингибитора триптазы будет находиться в интервале 0,1-1000
миллиграмм (мг) в день для реципиента, предпочтительно в интервале 1-100 мг в день. Необходимая дозировка предпочтительно представлена в одной, двух, трех, четырех или более субдоз, вводимых с соответствующими интервалами в течение дня. Такие субдозы могут быть введены в виде единичных дозированных
форм, содержащих, например, 5-1000 мг, предпочтительно 10-100 мг активного компонента на единичную
дозированную форму.
Композиция, применяемая в указанных способах лечения, может быть в разнообразных формах, например в твердых, полужидких и жидких дозированных формах, таких, как таблетки, пилюли, порошки, жидкие
растворы или суспензии, липосомы, инъецируемые или вливаемые растворы. Предпочтительная форма зависит от предполагаемого пути введения и лечебного приложения.
Хотя активный компонент данного изобретения может быть введен в чистом виде, тем не менее предпочтительно представлять его в виде части фармацевтического препарата. Составы по настоящему изобретению
включают, по меньшей мере, одно соединение или ингибитор по настоящему изобретению в терапевтически
или фармацевтически эффективной дозе вместе с одним или несколькими фармацевтически или терапевтически приемлемыми носителями и необязательно другими терапевтическими ингредиентами. Различные соображения приведены, например, в издании Gilman et al. (eds) (1990) Goodman and Gilman's. The
Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press; and Remington's (см. выше). В указанных изданиях обсуждаются способы введения, например перорально, внутривенно, внутрибрюшинно или внутримышечно, и другие пути введения. Фармацевтически приемлемые носители включают воду, солевой раствор,
буферные системы и иные вещества, описанные, например, в Merck Index, Merck & Co., Rahway, NJ.
Как правило, если соединения по настоящему изобретению должны быть использованы для лечения астмы или аллергического ринита, эти соединения вводят в состав аэрозолей.
Термин "аэрозоль" включает любую суспендированную в газе фазу соединения по данному изобретению,
которую можно ингалировать в бронхиолы и носовые проходы. Конкретнее, термин "аэрозоль" включает га11
BY 4414 C1
зовую суспензию капелек соединения по настоящему изобретению, которую можно создать в дозирующем
ингаляторе или распылителе, или туманном пульверизаторе. Понятие аэрозоль включает также сухой порошковый препарат соединения по настоящему изобретению, суспендированный в воздухе или ином газеносителе, и который может вводиться, например, вдуванием из ингалирующего устройства.
В случае растворов, применяемых для изготовления аэрозолей по настоящему изобретению, предпочтительный интервал концентраций соединений настоящего изобретения составляет 0,1-100 миллиграмм
(мг)/миллилитр (мл), более предпочтительно 0,1-30 мг/мл и наиболее предпочтительно 1-10 мг/мл. Растворам обычно придается буферность путем добавления физиологически совместимого буфера, например фосфатного или бикарбонатного буфера. Обычный интервал рН составляет 5-9, предпочтительно 6,5-7,8, и
более предпочтительно 7-7,6. Как правило, для приведения осмолярности к физиологическому интервалу,
предпочтительно в пределах 10 % изотоничности, добавляют хлорид натрия. Состав таких растворов для
создания аэрозольных ингаляторов обсуждается в издании "Фармацевтика Ремингтона". Ganderton, Jones
"Поставка лекарств в дыхательный тракт", Ellis Horwood (1987); Gonda (1990) Cristal Reviews in Therapeutic
Drug Carrier Systems 6, 273-313; Raeburn и др. (1992) J. Pharmacol. Toxicol. Methods 27, 143-159.
Растворы соединений по настоящему изобретению могут быть превращены в аэрозоль любым известным
способом, обычно применяемым для приготовления фармацевтических аэрозольных ингаляторов. Обычно
такие способы заключаются в создании давления в контейнере с раствором или сосуд снабжается средством
для создания давления, обычно инертным газом-носителем, и пропускание сжатого газа через небольшое отверстие с подачей тем самым капелек раствора в рот и трахею животного, которому необходимо ввести лекарственное средство. Как правило, для облегчения введения лекарства в рот и трахею выходное отверстие
снабжено мундштуком.
По одному осуществлению устройства по настоящему изобретению содержат растворы соединений по
настоящему изобретению, которые присоединены или включены в любые обычные средства для создания аэрозолей при медикации астмы, например, дозирующие ингаляторы, струйные распылители или ультразвуковые распылители. Такие устройства могут включать мундштук, смонтированный вокруг отверстия.
Для осуществления лечения аллергического ринита устройство может содержать раствор соединения по
настоящему изобретению в насальном распылителе.
Сухой порошок, содержащий соединение по настоящему изобретению, необязательно с наполнителем,
представляет другое осуществление настоящего изобретения. Препарат может быть введен с помощью лекарственного порошкового ингалятора, содержащего вышеуказанный порошок.
Необходимо, конечно, учесть, что способы по настоящему изобретению могут быть реализованы в сочетании с другими агентами для лечения иммуноопосредованных воспалительных заболеваний и, в частности,
астмы. В таких сочетаниях особенно полезны β-адренергические агонисты, поскольку они способны обеспечить симптоматическое облегчение при начальной астматической реакции, в то время как соединения по настоящему изобретению дают облегчение при поздней астматической реакции. Предпочтительные βадренергические агонисты в указанных растворах включают любые из обычных β-агонистов, применяемых
для облегчения астмы, например: альбутерол, тербуталин, формотерол, фанотерол или преналин.
Другие агенты, применимые в сочетании с соединениями по настоящему изобретению, включают антихолинэргетики, такие, как ипратропийбромид, и противовоспалительные кортикостероиды (адренокортикальные стероиды), такие, как беклометазон, триамцинолон, флюризолид или дексаметазон.
Соединения по изобретению могут быть также использованы при лечении иммуноопосредованных воспалительных состояний кожи, таких, как крапивница и ангиоэдема, экзематозный дерматит, и гиперпролиферативных заболеваний кожи, например псориаз у млекопитающих. В результате наружного применения
соединения формулы I можно ожидать ремиссии симптомов заболевания. Так, объект, пораженный иммуноопосредованным воспалительным кожным заболеванием, может ожидать уменьшение шелушения, эритемы,
размера чешуек, зуда и других симптомов, связанных с кожным заболеванием. Дозировка лекарства и промежуток времени, необходимые для успешного лечения каждого отдельного больного, могут меняться, но
специалист способен выявить такие изменения и, соответственно, скорректировать курс лечения.
В объем изобретения включены также препараты для нанесения местно на кожу, содержащие соединение
формулы I, обычно в концентрации в области 0,001-10 % в смеси с нетоксичным фармацевтически приемлемым носителем для наружного применения. Такие препараты для наружного применения могут быть приготовлены смешиванием активного компонента по изобретению с обычно используемыми фармацевтическими
разбавителями и носителями, обычно применяемыми для приготовления в сухих, жидких кремовых и аэрозольных составах для наружного применения. Мази и кремы могут быть, например, изготовлены на водной
или масляной основе с добавлением приемлемых загустителей и/или желатинизирующих средств. Подобные
основы могут включать воду и/или масло, такое, как жидкое парафиновое или растительное масло, такое,
как арахисовое масло или касторовое масло. Загустители, которые могут быть использованы в соответствии
с природой основы, включают мягкий парафин, стеарат алюминия, цетостеариловый спирт, пропиленгликоль, полиэтиленгликоли, ланолин, гидрированный ланолин, пчелиный воск и т.п.
12
BY 4414 C1
Лосьоны могут быть приготовлены на водной или масляной основе и обычно также включают один или
несколько следующих компонентов: стабилизаторы, эмульгаторы, диспергирующие средства, суспендирующие средства, загустители, красители, ароматизаторы и т.п.
Порошки могут быть приготовлены с применением любой приемлемой порошковой основы, например,
талька, лактозы, крахмала и т.п. Капли могут быть приготовлены на водной основе или неводной основе,
включающей также одно или несколько диспергирующих средств, суспендирующих средств, солюбилизирущих средств и т.п.
Фармацевтические композиции для наружного применения по изобретению могут также включать один
или несколько консервантов или бактериостатических агентов, например метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, хлоркрезол, хлориды бензалкония и т.п. Фармацевтические композиции для наружного применения могут также содержать и другие активные компоненты, такие, как противомикробные средства, в
частности антибиотики, анестетики, анальгетики и противозудные средства.
Соединения по настоящему изобретению полезны также для лечения желудочных язв. Более конкретно,
соединения проявляют химиотерапевтическую активность, которая позволяет им облегчать симптомы язвенной болезни желудка и стрессового изъязвления и промотировать заживление желудочных и/или дуоденальных язв. Соединения могут быть использованы в сочетании с другими терапевтическими агентами, такими,
как противовоспалительными агентами и/или анальгетиками, такими, как аспирин, индометацин, фенилбутазон, ибупрофен, напроксен, толемтин и т.п.
Фармацевтические композиции могут быть введены парентеральным или пероральным путем с профилактическими и/или лечебными целями. В зависимости от пути введения фармацевтические композиции могут быть введены в виде разнообразных единичных дозированных форм. К примеру, пригодные для
перорального введения единичные дозированные формы включают порошки, таблетки, пилюли, капсулы и
драже.
Фармацевтические композиции могут быть введены внутривенно. Таким образом, настоящее изобретение касается композиций для внутривенного введения, которые представляют собой раствор соединения,
растворенного или суспендированного в приемлемом носителе, предпочтительно водном носителе. Могут
быть использованы самые различные водные носители, например вода, буферированная вода, 0,4 % солевой
раствор и т.п. Такие композиции иногда стерилизуют обычными хорошо известными способами стерилизации или подвергают стерильному фильтрованию. Полученные водные растворы могут быть расфасованы
для использования как таковые или могут быть лиофилизованы, и лиофилизованные препараты перед введением смешивают со стерильным водным раствором. Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, необходимые для приближения к физиологическому состоянию,
например регуляторы рН и буферные системы, стабилизирующие добавочные агенты, смачивающие средства и т.п., например, ацетат натрия, лактат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, монолаурат
сорбита, олеат триэтаноламина и т.п.
В твердых композициях могут быть использованы обычные нетоксичные твердые носители, например
фармацевтически чистый маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, натрий-сахарин, тальк, целлюлоза, глюкоза, сахароза, карбонат магния и т.п. Для перорального введения фармацевтически приемлемую токсичную
композицию получают с помощью любого обычно применяемого наполнителя, такого, как вышеперечисленные носители и, как правило, 0,1-95 % активного компонента, предпочтительно около 20 %.
Для лучшего понимания раскрываемого здесь изобретения приводятся следующие примеры. Следует
указать, что эти примеры имеют чисто иллюстративное назначение, и их не следует рассматривать, как ограничивающие изобретение.
Экспериментальная часть.
I. Общие соображения.
Исходные вещества, не описываемые здесь, являются коммерчески доступными, известными, или могут
быть получены известными специалистам способами. Соединения формулы I могут быть получены известными специалистам методами с использованием либо твердофазных, либо жидкофазных (в растворе) методов синтеза. Исходные соединения для получения соединений формулы I известны или могут быть получены
методами, хорошо известными специалистам. К примеру, методики твердофазного синтеза полипептидов
приводятся в издании: Твердофазный синтез пептидов. Практический подход (Solid Phase Peptide Synthesis A
Practical Approach (eds. E. Atherton and R.С. Sheppard) IRL Press at Oxford University Press (1989) и Merrifield,
J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149-2156 (1963). Химии пептидного свертывания посвящено также издание: Пептиды (The Peptides, Vol. 1,(eds. Gross E., and J. Meienhofer), Academic Press, Orlando (1979).
Другие методики включают методики, приведенные в работах: Geysen et al., J. Imm. Meth. 102, 259-274
(1987); Houghten et. al., Nature (1991) 354, 84-86 (1991).
В раскрываемых здесь способах получения соединений по настоящему изобретению необходимость в
защите групп общепризнана специалистами в области органической химии. Соответственно, применение
защитных групп является непременным атрибутом содержащихся в описании способов синтеза, хотя и не
всегда иллюстрируемым.
13
BY 4414 C1
Выделение и очистка описываемых конечных и промежуточных соединений, при желании, могут быть
осуществлены любым приемлемым способом разделения или очистки, таким, как например: фильтрование,
экстракция, кристаллизация, колоночная хроматография, тонко-слойная хроматография или толсто-слойная
хроматография, жидкостная хроматография высокого давления или комбинация указанных способов. Иллюстрацией характерных приемлемых методик разделения и выделения могут служить приводимые в нижеследующих примерах методики. Однако, разумеется, могут быть использованы и другие эквивалентные
методики разделения и выделения.
Для обнаружения аргинина и содержащих аргинин пептидов использован анализ Сакагучи (Sakaguchi).
Stewart and Young. "Solid Phase Peptide Synthesis", 2d Ed., Pierce Chemical Company, p. 114.
Готовят раствор I, содержащий, 0,01 % α-нафтола и 5 % мочевины в 95 %-ом этаноле. Раствор II получают растворением 2 грамм (г) брома в 100 миллилитрах (мл) 8 %-го раствора гидроксида натрия. К раствору I
добавляют 5 гранул гидроксида натрия. Подлежащий анализу образец наносят в виде пятна на пластинку для
тонкослойной хроматографии. Затем TCX пластинку опрыскивают раствором I. TCX пластинку сушат на
воздухе и затем опрыскивают раствором II. Красное пятно указывает на наличие аминоиминометановой
группы.
II. Твердофазный синтез соединений формулы I.
А. Получение соединения 3 из таблиц I и II.
В 30 миллилитрах (мл) смеси N,N-диметилформамид-(ДМФА)толуол (I:I, объем/объем (об./об.)), содержащей 30 % (по объему) пиперидина, суспендируют 4-(2',4'-диметоксифенил-флуоренилметилоксикарбонил-(Fmoc)-аминометил)феноксисмолу (Rink resin; Bachem, CA; 3,5 грамма (г) при загрузке 0,289 миллиэквивалента/грамм (мэкв./г), 1,01 миллимоль (ммоль)). Реакционную смесь перемешивают 5 мин и затем
фильтруют. Добавляют дополнительное количество раствора пиперидина (30 мл) и смесь перемешивают еще
5 мин. После фильтрования шарики смолы последовательно промывают ДМФА (6 раз) и хлористым метиленом (6 раз).
В ∼30 мл ДМФА растворяют Fmoc-L-пролин (Milligen, 6,06 ммоль), бензотриазол-I-илокси-трис(диметиламино)фосфонийгексафторфосфат (БОФ, Novabiochem; 6,06 ммоль) и I-гидроксибензотриазол
(ГБТ, Aldrich, 6,06 ммоль). Полученный прозрачный раствор добавляют к смоле Rink и взвесь перемешивают (с пробулькиванием азота) 4 часа. Реакционную смесь фильтруют и шарики смолы промывают вышеописанным способом. Fmoc-группу удаляют пиперидином по вышеприведенной методике.
К шарикам смолы добавляют раствор Fmoc-L-аргинина (PMC) (Milligen; 6,06 ммоль), БОФ (6,06 ммоль) и
ГБТ (6,06 ммоль) в ДМФА (30 мл), взвесь перемешивают 4 ч и затем фильтруют, промывают, обрабатывают
пиперидином и вновь промывают вышеприведенным способом.
Добавляют раствор 1-гидрокси-2-нафтойной кислоты (Aldrich; 1,14 г, 6,06 ммоль), 1,3-диизопропилкарбодиимида (ДИРКДИ; Aldrich, 0,949 мл, 6,06 ммоль) и ГБТ (0,819 г, 6,06 мл) и реакционную смесь перемешивают (механическая лопастная мешалка) 7 ч. После фильтрования, промывания и обработки пиперидином
(см. выше) смолу последовательно промывают ДМФА (6 раз), хлористым метиленом (6 раз) и метанолом (6
раз). Смолу суспендируют в метаноле и перемешивают (механическая лопастная мешалка) примерно сутки
(15 ч). Смолу отфильтровывают и дважды промывают метанолом.
Белое свободно текучее твердое вещество суспендируют в смеси трифторуксусная кислота (ТФУК)анизол-вода (90:5:5, 10 мл). Смола сразу жe приобретает розовую окраску и затем в течение 1-2 мин темнеет
до интенсивно-красного цвета. После перемешивания 5 мин реакционную смесь фильтруют. Эту методику
повторяют еще 2 раза со свежим количеством отщепляющего агента, но при каждом повторе время контактирования увеличивают до 10 мин.
Растворы ТФУК объединяют и полученный прозрачный оранжевый раствор оставляют на 3,5 ч при комнатной температуре. Концентрированием в вакууме получают бледно-желтое масло, которое оставляют под
вакуумом (<I торр) на 3 ч. Масло растворяют в 50 %-ом водном ацетонитриле (100 мл) и лиофилизацией получают сырой продукт в виде снежно-белого твердого вещества (471 мг).
Аналитическая ЖXBP (Polymer Labs 100А PLRP колонка, 1×150 миллиметров (мм), элюирование линейным градиентом 20-45 % ацетонитрила в течение 13 мин при скорости потока 0,1 мл/мин) показала, что
сырой продукт является по существу единственным соединением (время удерживания 10,35 мин, > 98 % согласно УФ поглощению). Очистку осуществляют с помощью ЖXBP с применением C18 колонки силикагеля
(Vydac; 22×250 мм, 15-20 мкм, 300 А, элюирование линейным градиентом 20-35 % в течение 30 мин при скорости потока 10 мл/мин). Потребовалось осуществить многократное впрыскивание по 30-35 мг. Аналогичные
фракции (время удерживания 44-48 мин) объединяют и их лиофилизацией получают пушистое белое твердое
вещество (351 мг), которое согласно ЖХВР является единственным соединением.
Macс-спектроскопия электронапылением (вычисленная молекулярная масса = 440,49, найдено M+1 = 441,1) и
ЯМР спектроскопия (протонная и 13С) соответствуют ожидаемому строению.
14
BY 4414 C1
1
Н-ЯМР (CD3OD)δ:7,89 (д, J = 8 Гц, 1H), 7,78 (д, J = 6 Гц, 1H), 7,76 (д, J = 6 Гц, 1H), 7,57 (дт, J = 8 и 1 Гц,
1H), 7,48 (дт, J = 8 и 1 Гц, 1H), 7,29 (д, J = 8 Гц, 1H), ~4,95 (нечеткий, 1H), 4,49 (дд, J = 8 и 5 Гц, 1H), 3,97 (дт,
J = 10 и 7 Гц, 1H), 3,23 (т, J = 7 Гц, 2H), 2,29 (м, 1H), 1,7-2,2 (м, 8H).
В. Получение других соединений формулы I.
По вышеприведенной методике части А и путем замены
1-гидрокси-2-нафтойной кислоты следующими соединениями:
2-гидрокси-4-метилбензойной кислотой,
3-гидрокси-2-хиноксалинкарбоновой кислотой,
3-гидрокси-2-нафтойной кислотой,
2-гидрокси-1-нафтойной кислотой,
3-гидрокси-2-пиридинкарбоновой кислотой,
4-гидрокси-7-метил-3-нафтиридинкарбоновой кислотой,
2-гидрокси-3-пиридинкарбоновой кислотой,
2-гидроксибензойной кислотой,
2,5-дигидроксибензойной кислотой, и
2-гидрокси-5-фенилбензойной кислотой (см. часть E ниже) получены следующие соединения:
Соединение 2 из таблиц I и II,
Соединение 9 из таблиц I и II,
Соединение 14 из таблиц I и II,
Соединение 15 из таблиц I и II,
Соединение 16 из таблиц I и II,
Соединение 17 из таблиц I и II,
Соединение 18 из таблиц I и II,
Соединение 19 из таблиц I и II,
Соединение 20 из таблиц I и II,
Соединение 21 из таблиц I и II.
С. Получение других соединений формулы I.
По вышеприведенной методике части А и с заменой Fmoc-L-пролина на Fmoc-D-пролин получено соединение 12 из таблицы III.
D. Получение дополнительных соединений формулы I.
Соединение 13 из таблиц I и II получено первоначальным присоединением Fmoc-L-фенилаланина к смоле
по методике, аналогичной вышеприведенной в части А методике присоединения Fmoc-L-пролина. Затем
Fmoc-группу удаляют и фенилаланин соединяют с Fmoc-L-пролином. Остальную часть синтеза Соединения
13 проводят использованием методики, приведенной выше в части А.
Аналогично, получение Соединений 6 и 7 из таблиц I и II включает соединение соответственно Fmocпиперидин-3-карбоновой кислоты или Fmoc-пиперидин-4-карбоновой кислоты со смолой, удаление Fmocгруппы и затем присоединение Fmoc-L-пролина. Остальную часть синтеза проводят по вышеприведенной в
части А методике.
E. Получение 2-гидрокси-5-фенилбензойной кислоты.
2-Гидрокси-5-фенилбензойную кислоту получают следующим образом. Раствор защищенного тетрагидропираном (ТГП)4-фенилфенола (474 ммоль, 2 ммоля, получен из 4-фенилфенола по стандартной методике,
приведенной у Green и Wuts на стр. 31-34) в безводном ТГФ (5 мл) охлаждают до -78 °С и обрабатывают нбутиллитием (2 мл 1,6 M раствора в гексане). Реакционную смесь перемешивают и нагревают до комнатной
температуры, в ходе нагревания образуется суспензия цвета загара. Спустя 2 ч реакционную смесь охлаждают до -78 °С и обрабатывают избытком безводного CO2 в течение нескольких минут. Реакционную смесь перемешивают и нагревают до комнатной температуры. Через 2 ч реакционную смесь распределяют между
этиловым эфиром и водным I н NaOH. Водный слой охлаждают льдом до 0 °С и подкисляют до рН 2 водной
I н HCl. Водный раствор обрабатывают хлористым метдленом. Органический слой сушат над сульфатом
магния. Концентрированием в вакууме получают сырой продукт в виде снежно-белого твердого вещества
(258 мг, 2-гидрокси-5-фенилбензойная кислота). ЯМР спектр сырого продукта соответствует ожидаемому
строению. 1Н-ЯМР (ДМCО-d6)δ:8,04 (д, J = 3 Гц, 1H), 7,76 (дд, J = 9 и 3 Гц, 1H), 7,62 (д, J = 7 Гц, 2H), 7,44 (т,
J = 7 Гц, 2H), 7,32 (т, J = 7 Гц, 1H), 7 (д, J = 9 Гц, 1H). Масса вычисленная = 466,5. Масса найденная 467,2.
Градиент в ЖХ 25-45 % ацетонитрила в течение 13 мин. Время удерживания в ЖX 3,5 мин. Продукт использован без дополнительной очистки.
III. Жидкофазный (в растворе) синтез соединений формулы I.
А. Получение Соединения 10 из Таблиц I и II.
К 20 г (L)-фенилаланина, охлажденного до -5 °С в бане с солью со льдом, добавляют 74 мл концентрированной серной кислоты. После установления температуры реакционной смеси добавляют 9,4 мл концентрированной азотной кислоты (по каплям в течение пяти минут). Реакционную смесь перемешивают 30 мин,
15
BY 4414 C1
после чего переносят в 700 мл молотого льда с водой. Добавлением концентрированного раствора гидроксида
аммония устанавливают рН 8-9. Раствор оставляют кристаллизоваться при комнатной температуре и затем
охлаждают примерно сутки при 4 °С. Светло-желтый кристаллический продукт фильтруют через твердую
фильтровальную бумагу, промывают холодной водой и сушат. Продукт перекристаллизован из горячей воды, фильтрат упаривают и перекристаллизовывают (2 раза) с общим выходом 55 %. T. пл. 218-222 °С (сырого продукта). TCX: Rf (F) 0,18. ЯМР (D2O-NaOD)δ:2,99 (дд, J = 13,4 и 7,2 Гц, 1H), 3,10(дд, J = 13,4 и 6 Гц,
1H), 3,57 (дд, J = 7,2 и 6 Гц, 1H), 7,48 (д, J = 8,6 Гц, 2H), 8,21 (д, J = 8,7 Гц, 2H).
Аминокислоты, защищенные трет-бутоксикарбонилом (BOC), могут быть получены стандартными методами. Greene и Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd Ed., John Wiley& Sons, Inc, New York, pp.
327-328 (1991).
К охлажденному до -20 °С ВОС-защищенному п-нитрофенил-аланину (3 г, 9,67 ммоль) в безводном хлористом метилене (5 мл) добавляют N-метилморфолин (NMM, 1,07 мл, 9,67 ммоль) с последующим прибавлением изобутилхлорформата (1,26 мл, 9,67 ммоль). Реакционную смесь перемешивают 15 мин при -20 °С.
Затем к смеси добавляют в твердом состоянии гидрохлорид метил-L-пролина (L-Pro-ОМе, 1,6 г, 9,67 ммоль)
с последующим прибавлением дополнительного количества NММ (1,07 мл, 9,67 ммоль). После перемешивания один час при -20 °С и один час при комнатной температуре реакционную смесь концентрируют в вакууме и затем разбавляют этилацетатом. Этилацетатный раствор промывают 10 %-ой водной лимонной
кислотой, водой и рассолом, сушат над сульфатом магния и концентрируют в вакууме. Колоночной хроматографией получают 2,4 г продукта (> 60 % выход).
ВОС-группу удаляют обработкой HCl в диоксане в стандартных условиях. Greene и Wuts (см. выше, стр.
328-329). К раствору 1-гидрокси-2-нафтойной кислоты (160 мг, 0,84 ммоль) в хлористом метилене и N,Nдиметилформамиде (1:1, 3 мл) добавляют 1-гидрокси-бензотриазол (159 мг, 1,17 ммоль). Раствор охлаждают
до 0 °С и к нему добавляют 1-(3-диметиламинопропил)-3-этил-карбодиимида гидрохлорид (EDCl, 161 мг,
0,84 ммоль). После перемешивания раствора 45 мин при 0 °С добавляют раствор вышеописанного дипептида
(300 мг, 0,84 ммоль) с последующим прибавлением NММ (93 мкл, 0,84 ммоль). Реакционную смесь перемешивают один час при 0 °С и 45 мин при комнатной температуре. Реакционную смесь концентрируют в вакууме и разбавляют этилацетатом и водой. Органический слой отделяют, промывают (4 раза) водой и затем
рассолом, сушат и концентрируют в вакууме. Хроматографией получают продукт присоединения (300 мг,
73 %).
К раствору продукта присоединения (410 мг, 0,83 ммоль) в этилацетате (20 мл) добавляют ледяную уксусную кислоту (10 капель) и 10 %-ый палладий на активированном угле (100 мг). Раствор гидрируют пять
часов. Реакционную смесь фильтруют на целите и концентрированием раствора в вакууме получают 375 мг
(98 %) продукта, который применяют без дополнительной очистки.
К раствору продукта вышеприведенной реакции гидрирования (200 мг, 0,45 ммоль) в безводном метаноле (10 мл) добавляют формамидинсульфоновую кислоту (118 мг, 0,95 ммоль, получен окислением продажной формамидинсульфиновой кислоты по методике, приведенной в работе: Maryanoff et al. (1986) J. Org.
Chem., 1882). Реакционную смесь перемешивают три дня. Реакционную смесь концентрируют в вакууме и
хроматографией выделенного продукта (элюирование смесью метанол-хлористый метилен) получают 17 мг
целевого соединения. Соединение 10 из таблицы III.
IV. Альтернативный способ жидкофазного (в растворе) синтеза соединений формулы I.
А. Получение Соединения 3 из таблиц I и II.
Раствор 1-бензилокси-2-нафтойной кислоты (2,247 г) в хлористом тиониле (15 мл) кипятят четыре часа.
Избыток реактива испаряют в вакууме. Остаток разбавляют безводным ДМФА (9 мл) и концентрируют примерно до 2 мл. К этому раствору добавляют 4-диметиламинопиридин (1,02 г). Смесь перемешивают при
комнатной температуре примерно сутки. Полученный пиридиниевый комплекс добавляют к перемешиваемому раствору нитро-L-аргинина (1,77 г), тетраметилгуанидина (1 мл) и хлорида лития (4,56 г) в ДМФА (60
мл). Смесь перемешивают 48 часов при комнатной температуре. Большую часть ДМФА испаряют в вакууме
и остаток распределяют между 1,5 нормальной (н) водной HCl и этилацетатом. Объединенные органические
слои промывают насыщенным водным раствором хлорида натрия и сушат над сульфатом магния. Концентрированием в вакууме получают сырой продукт (3,5 г; 1-бензилокси-2-нафтоил-N-нитро-L-аргининовая кислота). TCX: Rf продукта = 0,22 (применением пластинок с силикагелем и элюированием 10 % метанолуксусная кислота в хлороформе). Этот продукт применялся без дополнительной очистки.
Раствор 1-бензилокси-2-нафтоил-N-нитро-L-аргининовой кислоты (150 мг) в безводном ДМФА (5 мл)
охлаждают до -25 °С и обрабатывают изобутилхлорформатом (0,053 мл). Реакционную смесь перемешивают
и нагревают до комнатной температуры. Через 20 мин добавляют твердый L-пролинамид (в виде его HCl соли, 65,9 мг). Смесь перемешивают 16 ч и затем разбавляют этилацетатом. Этилацетатный раствор промывают 5 %-ой лимонной кислотой, насыщенным водным раствором бикарбоната натрия и насыщенным водным
раствором хлорида натрия и сушат над сульфатом магния. Раствор концентрируют в вакууме, остаток разбавляют этанолом (40 мл, содержит 10 % метанола и 10 % уксусной кислоты) и гидрируют под давлением 52
16
BY 4414 C1
фунта/кв.дюйм (359 кПа) в присутствии 10 % палладия на угле (10 мг) до полного завершения реакции (TCX
на силикагеле, элюирование смесью хлороформ-метанол 9:1), на что указывает исчезновение более быстро
движущегося пятна. Реакционную смесь фильтруют через целит, промывают этанолом и метанолом. Смесь
концентрируют в вакууме и очисткой жидкостной хроматографией высокого давления получают 1-гидрокси2-нафтоил-L-аргинил-L-пролинамид (41 мг, масс-спектр электронапылением: M+1 = 441), выделен в виде его
трифторацетатной соли.
В. Получение соединения I из таблицы III.
По вышеприведенной в части А методике и заменой 1-бензилокси-2-нафтойной кислоты на 2-бензилокси1-нафтойную кислоту и L-пролинамида на саркозинамид получено Соединение I из таблицы III.
С. Получение других соединений формулы I.
По вышеприведенной в части В методике и заменой саркозинамида следующими соединениями:
L-пролин-N,N-диметиламидом,
L-пролина метиловым эфиром, и
транс-4-гидрокси-L-пролина метиловым эфиром
получены следующие соединения:
Соединение 5 из таблиц I и II,
Соединение 8 из таблиц I и II, и
Соединение 4 из таблицы III.
V. Физические данные.
Таблица 1
Соединение
Масса вычисления
Масса, найденная
(М+1)1
ЖХ
Градиент2
ЖX
Время
удерживания (мин)
1
2
3
4
5
63
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
414,24
404,26
440,26
471,26
468,29
551,34
551,34
455,26
442,26
456,26
440,26
587,34
440,26
440,26
391,5
456,49
393,22
390,4
406,4
466,5
415,1
405,5
441,1
472,2
469,1
552,3
552,1
456,0
443,0
456,7
441,2
588,0
440,5
440,24
391,84
456,74
391,84
391,1
407,2
467,2
D
В
А
D
D
D
D
D
D
C
C
C
А
В
D
B
B
А
С
E
5,8
11,5
10,3
6,2
6,8
7,5
7,3
7,0
5,5
24,4
25,4
26,9
9,0
8,4
5,6
9,0
5,5
4,7
20,7
3,5
1. Все массы определены на масс-спектрометре с электронапылением финниган, если нет других указаний.
2. Во всех случаях использована бинарная градиентная система, состоящая из ацетонитрила и воды. Все
элюенты содержат 0,1 % трифторуксусной кислоты. А: 20-45 % ацетонитрила в течение 13 мин. В: 10-35 % ацетонитрила в течение 13 мин. С: 5-95 % ацетонитрила в течение 45 мин. D:2-95 % ацетонитрила в течение 10
мин. E: 25-45 % ацетонитрила в течение 13 мин.
3. Анализируемый продукт является смесью диастереомеров.
4. Массы определены на масс-спектрометре Биолон. Величины соответствуют M+1.
VI. In vitro анализ ингибирования триптазы.
Соединения (приблизительно 1 мг), подлежащие анализу, как ингибиторы триптазы, вновь растворяют в
диметилсульфоксиде (ДМСО) и разбавляют в соотношении 1:10 буфером, содержащим 50 миллимолей (мМ)
17
BY 4414 C1
Трис-НСl (рН 8,2), содержащим 100 мМ NaCl, 0,05 % Твин-20. На основе начального разбавления получают
семь последовательных 3-х кратных разбавлений в том же буфере с добавкой 10 % ДМСО. Аликвоты (50
мкл) от каждого из восьми разбавлений в серии переносят в отдельные U-образные лунки титрационного
микропланшета на 96 лунок. В каждую лунку вносят триптазу (25 мкл, 0,5 нM конечная концентрация), образцы перемешивают и инкубируют 1 час при комнатной температуре либо при естественном освещении (т.е.
освещении, имеющемся в комнате в ходе эксперимента), либо в условиях регулируемого "светлого" или
"темного" освещения. "Светлые условия" в данном случае относятся к интенсивности света в 400-450 футосвечей от флуоресцентной лампы. "Темные условия" относятся к контейнерам с образцами, завернутыми в
алюминиевую фольгу. Затем инициируют ферментативную реакцию добавлением синтетического трипептидного субстрата формулы: тозил-Gly ProLys-п-нитроанилид (25 мкл, 0,5 мМ конечная концентрация). Титрационные микропланшеты сразу же переносят на UV/МАХ кинетический микропланшетный считыватель
(Молекьюлар Девисиз) и гидролиз хромогенного субстрата исследуют спектрофотометрически при 405 нм в
течение 5 мин. В этих условиях ферментативным анализом обычно получают кривые линейного роста. Для определения кажущихся констант ингибирования для каждого ингибитора проводят измерение начальной скорости, рассчитанной на основании кривых роста применением программы кинетического анализа, названной
"БатчКай" (выпускается фирмой Биокин Лтд., Мэдисон, Вайоминг). Указанная программа создана для обработки регрессий и отложенных на кривой нелинейных данных.
В таблице II перечислены константы ингибирования (Ki', микромолярная (мкМ)), определенные для нескольких соединений настоящего изобретения, где R1 - водород; R2 - водород; R3 - группа формулы: -(CH2)3NH-(С = NH)-NH2; R4 и R5 вместе с азотом и углеродом, к которым они присоединены, образуют пятичленный
гетероцикл и R6 - водород. Согласно настоящему изобретению, соединение называется "активным" или эффективным, как ингибитор триптазы, если его Ki' меньше 1000 мкМ. В отличие от Кi константа Кi' может и не
быть истинной константой диссоциации комплекса фермент-ингибитор; Кi' равна Ki для неконкурентного
ингибитора и прямо пропорциональна Кi для конкурентных и неконкурентных ингибиторов.
Действие света на растворы испытуемых соединений в аналитической среде может уменьшить значение
Кi'. Как правило, условия анализа чувствительны к свету, и колебания в интенсивности естественного освещения могут повлиять на воспроизводимость результатов анализа. С учетом такого потенциального источника ошибки отдельные анализы проведены в темных условиях. Значения Кi', приведенные в таблицах II и III
без скобок, определены в условиях естественного освещения. Значения Кi', приведенные в скобках, определены в "темных" условиях (определение см. выше). Значения Ki', приведенные со звездочкой (*), определены
в "светлых" условиях согласно вышеприведенному определению (т.е. при интенсивности света в 400-450
фут-свечей).
Таблица II
Соединение
Кi'
R7
2
>500
-NН2
Ar
CH
OH
3
OH
3
0.3* (82)
-NН2
5
15
-N(CH3)2
OH
CONH
6
OH
2
82
OH
7
664
CONH
18
2
BY 4414 C1
OH
8
208
-ОСН3
N
9
23* (56)
-NН2
N
N
13
0.6* (110)
14
752* (707)
CONH
OH
OH
2
N
-NН2
OH
OH
15
0.84
-NН2
N
16
8* (63)
-NН2
OH
CH
17
900
3
N
N
-NН2
OH
N
18
452
-NН2
19
8* (2450)
-NН2
OH
OH
HO
20
20
-NН2
OH
21
18* (149)
-NН2
OH
В таблице III перечислены константы ингибирования (Ki', микромоли (мкМ)), определенные для нескольких соединений настоящего изобретения. Согласно настоящему изобретению, соединение называется "активным" или эффективным, как ингибитор триптазы, если его Ki' меньше 1000 мкМ.
19
BY 4414 C1
Таблица III
Соединение
Ki'
Строение
H
O
N
N
1
3* (637)
CONH
OH
CH
O
2
3
H
N
NH
HN
2
O
H
O
OCH
N
3
H
N
4
749
OH
O
OH
H
N
NH
HN
2
H
O
CONH
2
N
N
OH
10
O
CH
2
2.5* (18)
N
NH
2
H
NH
H
O
CONH
2
N
N
11
OH
0.3* (40)
O
OH
H
N
NH
HN
H
2
O
CONH
N
N
12
OH
2.5* (818)
O
H
N
HN
20
NH
2
2
BY 4414 C1
VII. Дополнительные показатели ингибирования триптазы соединением 3 из таблиц I и II.
А. Зависимость от рН
Проведен анализ соединения 3 как ингибитора триптазы при четырех различных значениях рН в следующей буферной системе: 120 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 0,13 мМ NaH2PO4, 0,896 мМ Na2HPO4. Конечная
применяемая буферная система включает 0,05 % Твин-20. В таблице IV приведены значения Кi' для соединения 3 при различных значениях рН.
Таблица IV
pH
6,5
7,0
7,5
8,0
Кi' (мкМ)
14
8,0
5,4
6,1
В. Оптимальный анализ при рН 7,5.
Изобретателями было обнаружено, что соединение 3 менее чувствительно к свету в следующей буферной
системе: 120 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 0,13 мМ NaH2PO4, 0,896 мМ Na2HPO4 и 0,05 % Твин-20 с рН 7,5. Так,
вышеописанную методику анализа реализуют в условиях, когда разбавление соединения 3 и добавление
триптазы проводят при естественном освещении и комнатной температуре. Аналитический планшет заворачивают в алюминиевую фольгу для 1-часового инкубирования перед добавлением субстрата, что также осуществляют при естественном освещении. Этапы разбавления и добавления триптазы должны завершаться в
пределах 5 минут. Кроме того, соединение 3 должно быть повторно растворено в ДМСО.
VIII. In vivo испытания
В данных исследованиях использована модель астмы на аллергических овцах. Методика исследовании
опубликована ранее (Abraham et al. (1983) Am. Rev. Respir. Dis., 128, 839-844; Allegra et al. (1983) J. Appl.
Physiol. 55, 726-730; Russi et al. (1985) J. Appl. Physiol. 59, 1416-1422; Soler et al. (1989) J. Appl. Physiol. 67,
406-413). Каждая овца служила своим собственным контролем. Вес тела подопытных животных находился в
интервале 20-50 килограмм.
В данных исследованиях 9 мг соединение 3 из таблиц I и II растворяют в 3 мл буферного солевого раствора и общий раствор вводят в виде аэрозоля за 0,5 часа, спустя 4 часа и через 24 часа после провокации
антигеном (полная доза = 27; n = 6). Соединение 3 проявляет тенденцию к уменьшению ранней реакции и
ослабляет позднюю реакцию, как показано на рис. 1. В контрольном опыте (только носитель) провокация
антигеном вызывает раннее и позднее возрастание в виде пика над нулевой линией для специфичной устойчивости легких (СУЛ) в 374 ± 104 % и 212 ± 21 % (среднее значение ± С.О.). Напротив, при получении овцами соединения 3 из таблиц I и II раннее и позднее возрастание для СУЛ составляет 280 ± 39 % и 72 ± 9 %
(р < 0,05 относительно контроля, оценочный тест Вилькоксона). Пик ранней реакции рассматривается как
средняя величина от максимальных значений, полученных сразу же после провокации. Пики поздних реакций
подсчитывают усреднением максимальных величин реакции, полученных для каждого животного в пределах 68 ч. Такой подход является консервативным, и исключает возможное уменьшение поздней реакции вследствие простого усреднения.
Через двадцать четыре часа после провокации антигеном как у контрольных, так и у получавших лекарство овец развивается гиперреактивность дыхательных путей. (Гиперреактивность дыхательных путей выражают в виде РС400, т.е. концентрации карбахола, вызывающей 400 % повышение СУЛ. Так, уменьшение
значения РС400 указывает на то, что дыхательные пути стали гиперреактивными). Соединение 3 из таблиц I и II
блокирует 24-часовую гиперреактивность. См. рис. 2. Нулевая линия для РС400 составляет 22 ± 3,7 единиц дыхания в контрольном опыте с падением до 9,1 ± 1,3 единиц дыхания после провокации антигеном (р < 0,05 относительно нулевой линии). Напротив, в опытах с лекарственным средством РС400 остается неизменным
относительно нулевой линии (16 ± 3,8 единиц дыхания против 17,6 ± 3,5 единиц дыхания после провокации антигеном). Таким образом, введение соединения 3 из таблиц I и II приводит к статистически значимому улучшению
функционирования дыхательных путей у овец, провоцированных антигеном.
Упоминание в данном описании все статьи и ссылки, включая патенты, вводятся здесь в качестве ссылок.
Необходимо указать, что вышеприведенное описание имеет иллюстративный, но не ограничительный характер. Для специалиста после изучения данного описания станут очевидными многочисленные варианты.
Объем изобретения, таким образом, будет определяться не вышеприведенным описанием, а прилагаемой
формулой изобретения, вместе с полным объемом эквивалентов, которые относятся к этой формуле изобретения.
21
BY 4414 C1
1.Соединение формулы I
R1
Ar
O
R5
R6
R7
N
N
R2
R3
O
,
R4
(I)
O
или его фармацевтически приемлемая соль, в котором
Ar -замещенный гидроксилом арил или замещенный гидроксилом гетероарил, где гидроксил находится в
орто-положении относительно боковой амидной цепи и где, если Ar - замещенный гидроксилом арил, тогда
ароматический цикл, содержащий боковую амидную цепь, не замещен галогеном и не содержит С1-С6алкильную группу в орто-положении к гидроксилу;
R1 - водород, С1-С6-алкил, арил-С1-С6-алкил, гетероарил-С1-С6-алкил;
R2 - водород или С1-С6-алкил;
R3 выбран из группы, содержащей
NH
(C H 2)m
X
NH
2
,
NH
(C H 2)n
A
(C H 2)w
X
,
NH
2
NH
2
,
NH
2
,
NH
2
,
NH
(C H 2)p
(C H 2)q NH
NH
(C H 2)p
(C H 2)q
NH
(C H 2)p
(C H 2)r
(C H 2)s
X
(CH 2)t
(CH 2)p
NH
N
(CH 2)t
NH
2
,
NH
(CH 2)p
(C H 2)u
X
NH
(CH 2)v
NH
2
,
2,
где m - целое число 3-6, n - целое число 0-3, p - целое число 0-2, q - целое число 0-2, r - целое число 0-5, s целое число 0-2, t - целое число 1-3, u - 1 или 2, v - целое число 3-6, w - целое число 0-3, A - –СН=СН– или –
С≡С–, Х - –NH– или –CH2–;
R4 - С1-С6-алкил,
R5 и R6 независимо водород или С1-С6-алкил,
или R4 и R5 вместе с азотом и углеродом, к которым они присоединены, образуют замещенный гидроксилом 4-членный, 5-членный или 6-членный гетероцикл и R6 - водород,
или R4 и R6, вместе с азотом и углеродом, к которым они присоединены, образуют замещенный гидроксилом 4-членный, 5-членный или 6-членный гетероцикл и R5 - водород;
22
BY 4414 C1
R7 представляет группу –OR8 или –NR8R9, где R8 и R9 независимо выбраны из группы, включающей водород, С1-С6-алкил, арил, арил-С1-С6-алкил или гетероарил-С1-С6-алкил, или R8 и R9 вместе с азотом, к которому они присоединены, образуют замещенный гидроксилом 5-членный или 6-членный гетероцикл;
при этом
арил означает фенил, бифенил, нафтил,
гетероарил означает пиридил, хиноксалинил, нафтиридинил.
2. Соединение по п. 1, где
Ar - 1-гидрокси-2-нафтил, 2-гидрокси-1-нафтил, 3-гидрокси-2-пиридил или 2-гидрокси-3-хиноксалил;
R1 - водород, С1-С6-алкил, арил-С1-С6-алкил, гетероарил-С1-С6-алкил;
R2 - водород или С1-С6-алкил;
R3 выбран из группы, содержащей:
NH
(C H 2)m
X
NH
2
,
NH
(C H 2)n
A
(C H 2)w
X
NH
2
NH
2
,
NH
(C H 2)p
(C H 2)q NH
,
NH
(C H 2)p
NH
2
,
где m - целое число 3-6; n - целое число 0-3; p - целое число 0-2; q - целое число 0-2; w - целое число 0-3; А –СН=СН– или –С≡С– и Х - –NН– или –СН2–;
R4- С1-С6-алкил;
R5 и R6 независимо водород,
или R4 и R5 вместе с азотом и углеродом, к которым они присоединены, образуют замещенный гидроксилом 4-членный, 5-членный или 6-членный гетероцикл и R6 - водород;
R7 - группа –ОН, –ОСН3, –NH2, 3'-аминокарбонил-1'-пиперидил или –N(CH3)2;
при этом арил и гетероарил имеют указанные в п. 1 значения.
3. Соединение по п. 2, где
Ar - 1-гидрокси-2-нафтил,
R1 - водород,
R2 - водород,
R3 - группа –(СН2)3NH(CNH)NH2,
R4 и R5 вместе с азотом и углеродом, к которым они присоединены, образуют замещенный 5-членный гетероцикл,
R6 - водород,
R7 - группа –NH2.
4. Соединение по п. 2, где
Ar - 2-гидрокси-1-нафтил,
R1 - водород,
R2 - водород,
R3 - группа –(СН2)3NH(CNH)NH2,
R4 и R5 вместе с азотом и углеродом, к которым они присоединены, образуют замещенный 5-членный гетероцикл,
R6 - водород,
R7 - группа –NH2.
5. Аэрозольная фармацевтическая композиция для лечения иммуноопосредованных воспалительных заболеваний дыхательных путей, содержащая активный ингредиент и фармацевтически приемлемый носитель
в виде аэрозольного раствора или сухого порошка, отличающаяся тем, что в качестве активного ингредиента содержит соединение формулы I по любому из пп. 1-4 в терапевтически эффективном количестве.
(C H 2)q
23
BY 4414 C1
6. Композиция по п. 5, отличающаяся тем, что соединение формулы I содержится в указанном раствореносителе в концентрации 0,1-30,0 мг/мл.
7. Композиция по п. 5, отличающаяся тем, что дополнительно содержит соединение, являющееся βадренергическим агонистом.
8. Композиция по п. 7, отличающаяся тем, что указанный β-адренергический агонист выбран из группы,
включающей альбутерол, тербуталин, формотерол, фенотерол и преналин.
9. Композиция по п. 5, отличающаяся тем, что дополнительно содержит противовоспалительный кортикостероид.
10. Композиция по п. 9, отличающаяся тем, что указанный противовоспалительный кортикостероид выбран из группы, включающей беклометазон, триамцинолон, флуризолид и дексаметазон.
11. Композиция по п. 5, отличающаяся тем, что дополнительно содержит бромид ипратропия.
12. Композиция по п. 5, отличающаяся тем, что указанным воспалительным заболеванием дыхательных
путей является астма.
13. Композиция по п. 5, отличающаяся тем, что указанным воспалительным заболеванием дыхательных
путей является аллергический ринит.
14. Фармацевтическая композиция, способная ингибировать триптазу, содержащая активный ингредиент
и фармацевтически приемлемый носитель, отличающаяся тем, что в качестве активного ингредиента содержит соединение формулы I по любому из пп. 1-4 в терапевтически эффективном количестве.
15. Композиция по п. 14, отличающаяся тем, что фармацевтически приемлемый носитель представляет
собой нетоксичный фармацевтически приемлемый носитель для наружного применения.
16. Способ лечения иммуноопосредованных воспалительных заболеваний дыхательных путей, заключающийся во введении млекопитающему ингаляционной композиции, отличающийся тем, что в качестве
ингаляционной композиции используют фармацевтическую композицию по любому из пп. 5-11 в терапевтически эффективном количестве.
17. Способ лечения иммуноопосредованного воспалительного состояния кожи, заключающийся в нанесении наружно млекопитающему лекарственного средства, отличающийся тем, что в качестве лекарственного средства используют фармацевтическую композицию по п. 15 в терапевтически эффективном
количестве.
18. Способ профилактики иммуноопосредованных воспалительных заболеваний дыхательных путей, заключающийся во введении млекопитающему ингаляционной композиции, отличающийся тем, что в качестве ингаляционной композиции используют фармацевтическую композицию по любому из пп. 5-11 в
профилактически эффективном количестве.
Фиг. 2
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66.
24
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
441 Кб
Теги
by4414, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа