close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY4685

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(19)
BY (11) 4685
(13)
C1
7
(51) A 61K 35/39,
(12)
A 61K 38/28,
C 07K 14/625
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСУЛИНА
(21) Номер заявки: a 19980634
(22) 1998.07.09
(46) 2002.09.30
(71) Заявитель: Акционерное
"БЕЛМЕДПРЕПАРАТЫ" (BY)
общество
(72) Авторы: Царенков В.М., Старовойтова Т.Е., Ревко
Л.П.,
Дидоренко
А.И.,
Стельмах
А.И.,
Турчанинова И.В., Крутько Т.С., Романчиков
А.Б. (BY)
(73) Патентообладатель: Акционерное
общество
"БЕЛМЕДПРЕПАРАТЫ" (BY)
(57)
Способ получения инсулина путем экстракции измельченной поджелудочной железы водным этанолом,
подкисленным ортофосфорной кислотой, отделения примесных белков в присутствии CaCl2, вакуумдистилляции экстрактов, отделения липидов от экстрактов, сорбции инсулина из экстрактов на катионите КУ-23И,
градиентной десорбции инсулина, кристаллизации из элюата натриевой соли инсулина, цинковой кристаллизации инсулина в цитратном буферном растворе, отделения и сушки кристаллов инсулина, отличающийся
тем, что экстракцию измельченной поджелудочной железы проводят 83-90 %, затем 66-70 % водноэтанольным раствором, примесные белки отделяют сепарированием при рН 4,1-4,6 с добавлением 20 % водного раствора CaCl2 в количестве 6 мл на 1 л экстракта, сорбцию на катионите проводят в неподвижном
слое, градиентную десорбцию инсулина проводят буферными растворами в следующей последовательности: 0,2-0,3М СН3СООNН4 (pH 5,0-5,5), 0,05-0,1M СН3СООNН4 (pH 5,8-6,3), 0,1-0,2М NН4НСО3 (рН 8,2-8,6).
BY 4685 C1
(56)
Донецкий И.А. Исследование процесса выделения биопрепаратов из поджелудочной железы животных и
разработка промышленной технологи: Дис. ... док. хим. наук. - М., 1991. - С. 8-14.
SU 332832, 1972.
SU 552972, 1977.
Изобретение относится к фармацевтической промышленности и может быть использовано для получения
инсулина.
Известен способ получения инсулина путем водно-спиртовой экстракции измельченной поджелудочной
железы 82 %, затем 65 % подкисленным спиртом, двухстадийного осаждения балластных веществ СаСl2
(15 мл 20 % раствора СаСl2 на 1 л экстракта) при pH 3,3-3,5 и pH 4,3-5,3 и последующими сорбцией инсулина из экстракта на катионите СДВ-ЗТ, десорбцией и получением кристаллов инсулина известными методами. Выход 3100 ЕД/кг, активность 25,5 ЕД/мг [2].
Недостатками способа являются - неполная экстракция инсулина из-за малого содержания спирта, потери
инсулина на стадиях: экстракции при указанной температуре, двухстадийного осаждения балластных веществ при pH 3,3-3,5 и pH 4,3-5,3, а также из-за высокого содержания СаСl2, и в результате проведения указанным образом процесса десорбции - низкое качество получаемой субстанции, т.е. большое количество
примесей, обладающих антигенными свойствами, в частности, проинсулина. Полученный таким образом инсулин не соответствует требованиям Британской фармакопеи 1988 г.
Известен способ получения инсулина путем водно-спиртовой экстракции поджелудочной железы, трехстадийной депротеинизации инсулинсодержащих экстрактов при pH 3,5-3,8, pH 4,7-5,1 и pH 3,7-3,9 с охлаждением, сорбции обезбелоченного экстракта на сульфокатионите КУ-23 30/100М с последующими про-
BY 4685 C1
мывками 70 % спиртом и 0,2 М уксусно-аммонийным буферным раствором с pH 5,1, десорбции 0,2 М
NH4Сl-аммонийным буферным раствором с pH 9,5-9,7 и получения кристаллов инсулина известными методами. Выход 3500-4500 ЕД/кг, активность 24,0-26,5 ЕД/мг [3].
Недостатками способа являются: потери инсулина в процессе трехстадийного осаждения балластных
примесей при pH 3,5-3,8, pH 4,7-5,1 и pH 3,7-3,9, а также потери инсулина из-за высокого содержания СаСl2,
и в результате проведения заявленным способом процесса десорбции - низкое качество получаемой субстанции, т.е. большое количество примесей, обладающих антигенными свойствами, в частности, проинсулина.
Полученный таким образом инсулин не соответствует требованиям Британской фармакопеи 1988 г.
Прототипом является способ получения инсулина, включающий следующие стадии: экстракцию инсулина из измельченной поджелудочной железы, проводимую при объемном содержании этанола в экстракте
65 %, отделение примесных белков путем добавления СаС12 при pH 3,8-4,0 и pH 4,7-5,1, вакуумдистилляцию
экстрактов до содержания этанола 18-20 %, отделение липидов от экстракта, сорбцию инсулина на ионите
КУ-23И в режиме псевдоожижения смолы, градиентную десорбцию инсулина из ионита КУ-23И, кристаллизацию из элюата натриевой соли инсулина 2,5 М NaCI при pH 8,0-8,5, отделение натриевой соли инсулина,
перекристаллизацию натриевой соли инсулина 0,5 М NaCI при pH 8,5, отделение натриевой соли инсулина и
растворение ее в аммонийно-ацетатном буфере, хроматографию натриевой соли инсулина на ионите КУ-23И
в NH4+- форме в градиенте pH: 6,9 → 8,5 → 9,9, осаждение аморфного цинк-инсулина при pH 6,0-6,2, кристаллизацию цинковой соли инсулина в цитратном буферном растворе, отделение и сушку кристаллов инсулина. Выход 2650-2700 ЕД/кг, активность 25,5-27,0 ЕД/мг. Полученный инсулин соответствует требованиям Британской фармакопеи 1988 г. [1].
Недостатками способа являются - неполная экстракция инсулина при объемном содержании этанола в
экстракте 65 %, потери инсулина при отделении примесных белков СаС12 в две стадии при pH 3,8-4,0 и pH
4,7-5,1, потери инсулина при сорбции из экстрактов в режиме псевдоожижения смолы, наличие стадий: перекристаллизации натриевой соли инсулина 0,5 М NaCl при рН 8,5, отделения натриевой соли инсулина и
растворения ее в аммонийно-ацетатном буфере, хроматографии натриевой соли инсулина на ионите КУ-23И
в NH4+-форме в градиенте рН: 6,9 → 8,5 → 9,9, осаждения аморфного цинк-инсулина при рН 6,0-6,2.
Задачей изобретения является повышение выхода инсулина, соответствующего требованиям Британской
фармакопеи 1988 г., предназначенного для получения хроматографическими методами высокоочищенного
инсулина МК.
Это достигается тем, что экстракцию измельченной поджелудочной железы проводят 83-90 %, затем 6670 % водно-этанольным раствором, подкисленным ортофосфорной кислотой, примесные белки отделяют
сепарированием при рН 4,1-4,6 с добавлением 20 % водного раствора СаСl2 в количестве 6 мл на 1 л экстракта, сорбцию проводят на катионите в неподвижном слое, градиентную десорбцию инсулина проводят
буферными растворами в следующей последовательности: 0,2-0,3 М СН3СООNH4 (рН 5,0-5,5), 0,05-0,1 М
СН3СООNH4 (рН 5,8-6,3), 0,1-0,2 М NH4HCO3 (рН 8,2-8,6).
Изобретение отличается от прототипа тем, что экстракцию измельченной поджелудочной железы проводят 83-90 %, затем 66-70 % водно-этанольным раствором, подкисленным ортофосфорной кислотой, примесные белки отделяют при рН 4,1-4,6 с добавлением 20 % водного раствора CaCl2 в количестве 6 мл на 1л экстракта, сорбцию на катионите проводят в неподвижном слое, градиентную десорбцию инсулина проводят
буферными растворами в следующей последовательности: 0,2-0,3 М СН3СООNH4 (рН 5,0-5,5), 0,05-0,1 М
СН3СООNH4 (рН 5,8-6,3), 0,1-0,2 М NH4HCO3 (рН 8,2-8,6) и благодаря этим отличительным признакам при
получении инсулина заявленного в прототипе качества отпадает необходимость в следующих стадиях: перекристаллизации натриевой соли инсулина 0,5 М NaCl при pH 8,5, отделения натриевой соли инсулина и растворения ее в аммонийно-ацетатном буфере, хроматографии натриевой соли инсулина на ионите КУ-23И в
NH4+-форме в градиенте pH: 6,9 → 8,5 → 9,9, осаждения аморфного цинк-инсулина при pH 6,0-6,2.
Способ поясняется примером.
Пример.
450 кг измельченной поджелудочной железы заливают 1750 л 83 %-ного водно-этанольного раствора,
подкисленного ортофосфорной кислотой (уд. вес 1,67) до pH 3,0 и экстрагируют при перемешивании и температуре 15 °С в течение 3 ч. Экстракт отделяют центрифугированием, а осадок повторно заливают 750 л
70 % водно-этанольного раствора, подкисленного ортофосфорной кислотой до pH 3,0, и экстрагируют при
перемешивании и температуре 15 °С в течение 1,5 ч. В экстракт добавляют 20 % водный раствор СаСl2 в количестве 6 мл на 1 л и доводят pH до 4,4. Примесные белки отделяют сепарированием. Прозрачный экстракт
подкисляют 20 % раствором серной кислоты до pH 3,8 и отстаивают в течении 2 ч. Прозрачный раствор отделяют сифонированием и осадок отфильтровывают. Полученный раствор подвергают вакуумвыпарке до
содержания спирта в концентрате 15 %. Водно-спиртовой концентрат обезжиривают и фильтруют. Инсулин
из полученного раствора сорбируют на колонку L = 120 см, d = 30 см, упакованную макропористым сульфо2
BY 4685 C1
катионитом КУ-23И, со скоростью 70 л/ч. На колонну сорбируют экстракты от 4500 кг поджелудочной железы. Градиентную десорбцию инсулина проводят со скоростью подачи элюента 70 л/ч в следующей последовательности: 550 л 65 % водно-этанольного раствора, 250 л 0,3 М СН3СООNH4 (pH 5,3), 500 л 0,1 М
СН3СООNH4 (pH 6,0), 250 л 0,1 М NH4НСО3 (pH 8,5). Фракцию инсулина собирают, начиная с концентрации
белка в элюате 0,5 мг/мл, до 4 мг/мл после прохождения максимума пика элюции. Из полученного элюата
2,5M NaCI при pH 8,5 получают натриевую соль инсулина, а затем проводят цинковую кристаллизацию инсулина в цитратном буферном растворе. В итоге получают 547 г кристаллического инсулина с активностью
25,5 ЕД/мг и выходом 3100 ЕД/кг сырья, соответствующего требованиям Британской фармакопеи 1988 г.
Таким образом, заявленный способ позволяет достигнуть поставленной задачи - повысить выход инсулина, соответствующего требованиям Британской фармакопеи 1988 г., до 2800-3200 ЕД/кг сырья с активностью 25,5-27,0 ЕД/мг против 2650-2700 ЕД/кг сырья, как указано в прототипе.
Источники информации:
1. Донецкий И.А. Исследование процесса выделения биопрепаратов из поджелудочной железы животных
и разработка промышленной технологии: Дис. ... док. хим. наук. - М., 1991. - С. 8-14 (прототип).
2. SU 332832, 1972.
3. SU 552972, 1977.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66.
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
111 Кб
Теги
by4685, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа