close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY4775

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(19)
BY (11) 4775
(13)
C1
(51)
(12)
7
C 07K 7/62,
A 61K 31/70
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
(21) Номер заявки: 960460
(22) 1996.09.05
(46) 2002.12.30
СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ПОЛИМИКСИНА
(71) Заявитель: Институт физико-органической химии
НАН Беларуси (BY)
(72) Авторы: Солдатов В.С.; Куваева З.И.; Букатина
Т.В.; Водопьянова Л.А.; Царенков В.М.;
Петров П.Т.; Скрипко Г.Д. (BY)
(73) Патентообладатель:
Институт
физикоорганической химии НАН Беларуси (BY)
(57)
Способ выделения полимиксина, включающий сорбцию полимиксина из нативного раствора на катионите с последующим элюированием водным раствором щелочи, отличающийся тем, что в качестве катионита
используют жидкий катионит, представляющий собой полинонилнафталинсульфокислоту или ее солевую
форму в несмешивающемся с водой органическом неполярном растворителе или в смеси, содержащей несмешивающийся с водой органический неполярный растворитель и до 20 объемных % высшего спирта (С6С9), и сорбцию ведут при рН 1,5-5.
BY 4775 C1
(56)
Мамиофе С.М. и др. Метод выделения и химической очистки антибиотика полимиксина // Антибиотики.
- 1959 - 4. - № 1. - C. 10-16, SU 111195, 1958, SU 141992, 1964.
Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности и касается способа выделения полимиксина-антибиотика полипептида. Известны способы получения полимиксина [1, 2]. В основе
этих способов лежат следующие принципиальные стадии: биосинтез, коагуляция и фильтрация культуральной жидкости, выделение антибиотика из нативного раствора, деминерализация раствора антибиотика, стерилизация, концентрирование и сушка. Выделение антибиотика из нативного раствора традиционно ведется
путем ионообменной сорбции на ионообменных смолах. Так, в способе, описанном в [1], нативный раствор,
полученный после обработки щавелевой кислотой и фильтрации культуральной жидкости B. Polymyxa, пропускают через колонку, наполненную катионитом КБ 4-П2 в натриевой форме, со скоростью 1 л/ч/г, затем
ионит промывают последовательно дистиллированной водой и метанолом, после чего проводят вытеснение
антибиотика 0,35 н раствором соляной кислоты в метаноле со скоростью 10 мл/ч/г. Полученный раствор солянокислого полимиксина в метаноле нейтрализуют на анионите ЭДЭ-10 в ОН-форме. Недостатками процесса выделения антибиотика с помощью твердых ионитов являются: длительность процесса, 17-18 ч для
96 л нативного раствора, наличие большого количества промывных вод, низкий выход целевого продукта (4050 %).
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту к предлагаемому способу является
способ выделения полимиксина из нативного раствора на катионообменных смолах [3]. Согласно способу
прототипу, нативный раствор, содержащий полимиксин, пропускают через колонку, наполненную катионитом с карбоксильными группами КБ-2 или КБ-1. Элюирование антибиотика с катионита ведется водными
или метанольными растворами кислот или водными растворами аммиака. Использование карбоксильных катионитов позволяет повысить выход целевого продукта на стадии выделения из нативного раствора до 75 %,
однако неизбежными остаются недостатки самого процесса сорбции на твердых ионитах: многостадийность
процесса, включение помимо стадии сорбции и десорбции полимиксина стадии промывки и регенерации ионита, длительность процесса, 5-6 ч для 10 л нативного раствора, присутствие промывных вод в процессе выделения, что не допустимо в современной экологической ситуации.
Задачей изобретения является упрощение способа выделения полимиксина из нативного раствора и исключение промывных вод.
Поставленная задача достигается тем, что в способе выделения полимиксина, включающем сорбцию полимиксина из нативного раствора на катионите с последующим элюированием водным раствором щелочи, в
BY 4775 C1
качестве катионита используют жидкий катионит, представляющий собой полинонилнафталинсульфокислоту или ее солевую форму в несмешивающемся с водой неполярном органическом растворителе или смеси,
содержащей помимо неполярного, несмешивающегося с водой органического растворителя до 20 об. %
высшего спирта (С6-С9).
Преимущества предлагаемого способа следующие. Скорость протекания ионного обмена в предлагаемом
способе на порядок выше, чем при использовании традиционного метода сорбции на твердых ионитах и не
зависит от объемов вступающих в реакцию веществ. На стадии элюирования одновременно с концентрированием полимиксина происходит и регенерация жидкого ионита, что позволяет снова использовать его для
сорбции полимиксина, минуя стадии промывки и регенерации, то есть вести процесс в непрерывном замкнутом режиме и при отсутствии промывных вод. Это является существенным преимуществом использования
жидких ионитов по сравнению с твердыми, для которых необходимы стадии дополнительной обработки.
Предлагаемый способ иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1.
В делительную воронку емкостью 500 мл, снабженную пропеллерной мешалкой, помещают 120 мл нативного раствора отфильтрованной культуральной жидкости полимиксина, полученной при использовании на
стадии биосинтеза штамма продуцента Вас. Polymyxa, с содержанием полимиксина С = 1,0 г/л, добавляют 30
мл 0,22 М раствора калиевой соли полинонилнафталинсульфокислоты (KD) в гептане. Таким образом,
мольное отношение веществ, участвующих в реакции α = к-во молей полимиксина / к-во молей KD = 0,015.
Сорбцию ведут при рН = 2 и перемешивании 5-10 мин. После разделения фаз органическую фазу обрабатывают раствором 0,2 н КОН в течение 5-10 минут при перемешивании. Объемное отношение веществ участвующих в реакции VKD/VKOH = 2. Содержание полимиксина в элюате Сэ = 6,1 г/л. Степень извлечения
полимиксина относительно его исходного количества в нативном растворе Е = 76 %. Концентрация полимиксина в элюате 6,1 г/л соответствует активности полимиксина 61000 ед/мл. Активность полимиксина в нативном растворе и в элюате определялась микробиологическим методом. Параллельно содержание
полимиксина в нативном растворе и в элюате определялось методом количественной сорбции полимиксина
ионообменником КБ-2 с последующим количественным элюированием полимиксина 0,2 н NaOH. В от примесей таким образом нативном растворе и в элюате содержание полимиксина определялось фотоколориметрическим методом. Полученные данные совпадают с данными микробиологического анализа, то есть в
процессе выделения полимиксина по предлагаемому способу не происходит инактивация антибиотика, а определение содержания полимиксина в элюате можно проводить наиболее удобным методом.
Далее процесс получения препарата полимиксина можно вести по известной схеме, так же как и в случае
использования твердых ионитов [1].
Пример 2.
В делительную воронку емкостью 55 мл, снабженную пропеллерной мешалкой, помещают 120 мл нативного раствора, полученного аналогично примеру 1, с концентрацией полимиксина 1,2 г/л, туда же вносят 30
мл 0,22 М раствора полинонилнафталинсульфокислоты (HD) в гексане. Мольное отношение веществ, участвующих в процессе сорбции, α = 0,018. Сорбцию ведут при рН = 4,2 и перемешивании в течение 5-10 мин.
После разделения фаз и отделения водной фазы к органической фазе добавляют раствор 0,2 н NaOH и перемешивают 5-10 мин. Объемное отношение VHD/VNaOH = 2. Концентрация полимиксина в элюате определялась фотоколориметрическим методом, Сэ = 7,4 г/л. Степень извлечения полимиксина относительно его
исходного количества в нативном растворе Е = 77 %.
Пример 3.
В делительную воронку, снабженную пропеллерной мешалкой, помещают 120 мл нативного раствора,
полученного аналогично примеру 1, с концентрацией полимиксина 1,2 г/л, туда же вносят 30 мл 0,22 М
раствора натриевой соли полинонилнафталинсульфокислоты (NaD). Мольное отношение веществ, участвующих в реакции, α = 0,018. Сорбцию ведут при рН = 4,65 и перемешивании в течение 5-10 мин. После
разделения фаз и отделения водной фазы к органической фазе добавляют раствор 0,2 н NaOH и перемешивают 5-10 мин. Объемное отношение при элюировании VNaD/VNaOH = 2. Концентрация полимиксина в элюате
определялась фотоколориметрическим методом, Сэ = 7,5 г/л. Степень извлечения полимиксина Е = 78 %.
Пример 4.
100 мл нативного раствора, полученного аналогично примеру 1, с концентрацией полимиксина 1,3 г/л
помещают в делительную воронку с пропеллерной мешалкой. Туда же добавляют 40 мл 0,077 М раствора
аммонийной соли полинонилнафталинсульфокислоты (NH4D) в гептане, содержащем 10 % изооктилового
спирта. Мольное отношение α = 0,036. Сорбцию проводят при рН = 5 и перемешивании в течение 5-10 мин.
После разделения фаз и отделения водной фазы к органической фазе добавляют водный раствор аммиака,
СNH4OH = 10 %. Объемное отношение VNH4D/VNH4OH = 2. Элюирование проводят при перемешивании в течение 5-10 мин. Концентрация полимиксина в элюате определялась фотоколориметрическим методом, Сэ = 5,1
г/л. Степень извлечения полимиксина Е = 78 %.
2
BY 4775 C1
Пример 5.
120 мл раствора полимиксина с концентрацией 2,1 г/л помещают в делительную воронку с пропеллерной
мешалкой. Для моделирования нативного раствора водный раствор полимиксина содержит 1 % NaCl. Туда же
добавляют 35 мл 0,16 М раствора калиевой соли полинонилнафталинсульфокислоты (KD) в гептане, содержащем 16 % гексилового спирта. Мольное отношение α = 0,03. Сорбцию проводят при рН = 1,5 и перемешивании в течение 5-10 мин. Отделяют органическую фазу, добавляют к ней 0,2н раствор КОН и перемешивают 5-10
мин. Объемное отношение при элюировании VKD/VKOH = 2,9. Концентрация полимиксина в элюате определялась фотоколориметрическим методом, Сэ = 16,1 г/л. Степень извлечения Е = 78 %.
Пример 6.
120 мл модельного раствора полимиксина с концентрацией 1,16 г/л на фоне 1 % раствора NaCl помещают
в делительную воронку. Туда же добавляют в качестве жидкого ионита 24 мл 0,15 М раствора полинонилнафталинсульфокислоты (HD) в октане, содержащем 20 % нонилового спирта. Мольное отношение
α = 0,034. С помощью НСl доводят рН до 4,5. Сорбцию полимиксина проводят при перемешивании в течение 5-10 мин. Отделяют органическую фазу, добавляют к ней 0,2 н раствор NaOH и перемешивают в течение
5-10 мин. Объемное отношение при элюировании VHD/VNaOH = 2. Концентрация полимиксина в элюате определялась фотоколориметрическим методом, Сэ = 10 г/л, степень извлечения полимиксина Е = 86 %.
Пример 7.
120 мл нативного раствора полимиксина, полученного аналогично примеру 1, с концентрацией 1,92 г/л
помещают в делительную воронку. Туда же добавляют 24 мл 0,13 М раствора натриевой соли полинонилнафталинсульфокислоты (NaD) в гексане, содержащем 19 % нонилового спирта. Мольное отношение
α = 0,06. Сорбцию ведут при рН = 3,8 и перемешивании в течение 5-10 мин. Отделяют органическую фазу,
добавляют 0,2 н раствор NaOH и перемешивают в течение 5-10 мин. Объемное отношение веществ при
элюировании VNaD/VNaOH = 2. Содержание полимиксина в элюате определялось фотоколориметрическим методом, Сэ = 17,5 г/л. Степень извлечения Е = 91 %.
Пример 8.
120 мл нативного раствора полимиксина, полученного аналогично примеру 1, с концентрацией 1,92 г/л
помещают в делительную воронку. Туда же добавляют 24 мл 0,13 М раствора натриевой соли полинонилнафталинсульфокислоты (HD) в гексане, содержащем 19 % нонилового спирта. Сорбцию проводят при
рН = 1 и перемешивании в течение 5-10 мин. После разделения фаз и отделения водной фазы к органической
фазе добавляют 0,2 н раствор NaOH при объемном отношении VNaD/VNaOH = 2. Содержание полимиксина в
элюате определялось фотоколориметрическим методом, Сэ = 16,8 г/л, степень извлечения полимиксина
Е = 87 %. Хотя при данных условиях достигается высокая степень извлечения, но вместе с полимиксином из
нативного раствора просорбировались сопутствующие примеси. Элюат имеет желтованый цвет и требует
дополнительной очистки.
Пример 9.
100 мл нативного раствора полимиксина, полученного аналогично примеру 1, с концентрацией 0,55 г/л
помещают в делительную воронку. Туда же добавляют 20 мл 0,12 М раствора натриевой соли полинонилнафталинсульфокислоты (NaD) в гексане, содержащем 22 % нонилового спирта. Мольное отношение
α = 0,098. Сорбцию проводят при перемешивании и рН = 6 в течение 5-10 мин. После разделения фаз и отделения водной фазы к органической фазе добавляют 0,2 н раствор NaOH и перемешивают 5-10 мин. Объемное отношение VNaD/VNaOH = 2. Содержание полимиксина в элюате определялось фотоколориметрическим
методом, Сэ = 3,8 г/л, степень извлечения Е = 70 %. При значении рН сорбции больше 5 падает степень извлечения и уменьшается содержание полимиксина в элюате.
Пример 10.
120 мл модельного раствора полимиксина с концентрацией 0,84 г/л на фоне 1 % раствора NaCl помещают
в делительную воронку. Туда же добавляют в качестве жидкого ионита 30 мл 0,15 М раствора калиевой соли
полинонилнафталинсульфокислоты (KD) в гексане, содержащем 22 % нонилового спирта. Мольное отношение α = 0,02. Сорбцию полимиксина проводят при рН = 2 и перемешивании 5-10 мин. Отделяют органическую фазу, добавляют к ней 0,2 н раствор КОН и перемешивают 5-10 мин. Объемное отношение при
элюировании VKD/VKOH = 2. Концентрация полимиксина в элюате определялась фотоколориметрическим методом, Сэ = 4,9 г/л. Степень извлечения полимиксина Е = 73 %. Снижение степени извлечения и содержания
полимиксина в элюате связано с увеличением содержания спирта в растворителе до 22 %.
Данные примеров 1-10 приведены в табл. 1.
3
BY 4775 C1
Таблица 1
КонцентСодержание
рация
рН
Степень
полимиксиспирта в
сорбЭлюент
извлечена в элюате
раствоции
ния Е, %
Сэ, г/л
рителе,
об. %
6
7
8
9
10
0
2
КОН 0,2н
76
6,1
0
4,2
NaOH 0,2н
77
7,4
0
4,65
NaOH 0,2н
78
7,5
изоокта5,0
NH4OH 10 %
78
5,1
нол 10 %
5
2,1
KD
0,16
гептан гексанол
1,5
КОН 0,2н
78
16,1
16 %
6
1,16
HD
0,15
октан
нонанол
4,5
NaOH 0,2н
86
10,0
20 %
7
1,92
NaD
0,13
гексан нонанол
3,8
NaOH 0,2н
91
17,5
19 %
8
1,92
NaD
0,13
гексан нонанол
1,0
NaOH 0,2н
87
16,8
19 %
9
0,55
NaD
0,12
гексан нонанол
6,0
NaOH 0,2н
70
3,8
20 %
10
0,84
KD
0,84
гексан нонанол
2,0
КОН 0,2н
73
4,9
22 %
Выбор интервала рН в предлагаемом способе объясняется тем, что при значениях рН < 1,5 из нативного
раствора одновременно с целевым продуктом могут выделяться и сопутствующие вещества, например пигменты, а при значениях рН > 5 процесс протекает менее эффективно и наблюдается снижение степени извлечения полимиксина (70 %). Кроме того, известно, что в сильнокислой и сильнощелочной среде
полимиксин может инактивироваться (4).Фактором, снижающим эффективность выделения полимиксина из
нативного раствора, является и увеличение содержания высшего спирта в растворителе выше предлагаемого
(20 %).
Пример 11.
В экстрактор емкостью 20 л, снабженный мешалкой, помещают 10 л нативного раствора, полученного
аналогично примеру 1, с содержанием полимиксина 1,92 г/л, добавляют 2 л 0,13 М раствора натриевой соли
полинонилнафталинсульфокислоты в гексане, содержащем 19 % нонилового спирта. Мольное отношение
α = 0,06. Сорбция и элюирование проводятся аналогично примеру 7. Сорбция длится 5-10 мин при рН = 3,8.
После отделения водной фазы к органи-ческой фазе в экстрактор добавляют 1 л 0,2 н NaOH и перемешивают
5-10 минут. Активность полимиксина в элюате определяли микробиологическим путем, она составляет
175000 ед/мл, что соответствует концентрации полимиксина Сэ = 17,5 г/л. Степень извлечения полимиксина
Е = 91 %.
На основании данных способа прототипа [3] и аналога [1] был воспроизведен опыт по извлечению полимиксина из нативного раствора с помощью твердых ионитов для разных объемов нативного раствора.
Пример 12.
1000 мл нативного раствора, полученного аналогично примеру 1, с содержанием полимиксина 1,1 г/л
пропускают через колонку, заполненную 7 г катионита КБ-2 в натриевой форме, со скоростью 1 л/ч/г. Емкость катионита 18×105 γ/г. Время сорбции 9-10 мин.
После сорбции ионит промывают 250 мл дистиллированной воды. Элюирование антибиотика проводят
1,5 н раствором аммиака. 30 мл NH4OH пропускают со скоростью 10 мл/час/г в течение 25 мин. Время процесса 30-40 мин. Объем промывных вод 250 мл. Активность полимиксина в элюате определяли микробиологическим методом, она составила 270000 ед/мл, что соответствует концентрации Сэ = 27 г/л. Степень
извлечения Е = 74 %.
Пример 13.
10 л нативного раствора, полученного аналогично примеру 1, с содержанием полимиксина 1,1 г/л пропускают через колонку заполненную, катионитом КБ-2 в натриевой форме. Все условия сорбции и элюирования полимиксина такие же как, и в примере 11. Время процесса 5,5-6 ч, не считая времени, необходимого
для регенерации ионита. Объем промывных вод 2 л. Концентрация полимиксина в элюате Сэ = 26,4 г/л. Степень извлечения Е = 72 %.
Сравнительные данные примеров 7, 11-13 приведены в табл. 2.
КонКонцентцентрация поли№
миксина в Жидкий рация Раствоприисходном катионит катио- ритель
мера
нита, С,
растворе С,
М
г/л
1
2
3
4
5
1
1,0
KD
0,22
гептан
2
1,2
HD
0,22
гексан
3
1,2
NaD
0,22
гексан
4
1,3
NH4D
0,077
гептан
4
BY 4775 C1
№
примера
7
11
12
13
Катионит
NaD
NaD
КБ-2
Na-форма
КБ-2
Na-форма
Объем нативного
раствора, л
0,12
10
1,0
Степень извле- Объем промывных
чения Е, %
вод, л
91
91
74
0,25
10
72
2,0
Таблица 2
Время
процесса
20 мин
20 мин
30-40 мин
5,5-6 ч
Как видно из табл. 2, в предлагаемом способе выделения полимиксина время протекания процесса не зависит от объема нативного раствора и остается постоянным при любом масштабировании процесса в отличие от процесса сорбции полимиксина на твердых ионитах, где время протекания процесса прямо
пропорционально объему нативного раствора, поступающего в ионообменную колонну.
Из данных таблицы и примеров видно, что преимуществом выделения полимиксина сорбцией с участием
жидких ионитов по сравнению с сорбцией на твердых ионитах является высокая скорость протекания обмена, возможность проведения процесса в непрерывном режиме, исключение из технологического процесса
стадии регенерации ионита, так как регенерация происходит одновременно с элюированием целевого продукта, стадии промывки ионита и промывных вод.
Источники информации:
1. А.с. СССР 111195, кл 30h, 1958.
2. А.с. СССР 141992, кл 30h, 1964.
3. Мамиофе С.М., Синицина З.Т., Хохлов А.С. Метод выделения и химической очистки антибиотика полимиксина // Антибиотики. - 1959. - 4. - № 1 (прототип).
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66.
5
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
157 Кб
Теги
by4775, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа