close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY4799

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
BY (11) 4799
(13)
C1
(51)
(12)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
(19)
7
C 12N 15/82,
C 12N 15/60,
C 12N 5/10,
A 01H 5/00
ПРОМОТОР СИНТАЗЫ АЦЕТОКСИКИСЛОТ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ
В РАСТЕНИИ
(21) Номер заявки: 971128
(22) 1997.04.08
(86) PCT/US95/11199, 1995.09.05
(31) 08/303,266
(32) 1994.09.08
(33) US
(46) 2002.12.30
(71) Заявитель: АМЕРИКАН
ЦИАНАМИД
КОМПАНИ (US)
(72) Авторы: ДИТРИХ, Габриэль (DE), СМИТ, Джейн
(US), ПЕНГ, Джианьинг (СH)
(73) Патентообладатель: АМЕРИКАН ЦИАНАМИД
КОМПАНИ (US)
BY 4799 C1
(57)
1. Промотор синтазы ацетоксикислот для экспрессии генов в растении, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы последовательностей, представленных в виде SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2
или SEQ ID NO 3.
2. Промотор по п. 1, отличающийся тем, что его нуклеотидная последовательность представляет собой
последовательность гена als 1.
3. Промотор по п. 1, отличающийся тем, что его нуклеотидная последовательность представляет собой
последовательность гена als 2.
4. Промотор по п. 1, отличающийся тем, что его нуклеотидная последовательность получена из последовательностей промоторов однодольного растения.
5. Промотор по п. 4, отличающийся тем, что его нуклеотидная последовательность получена из последовательностей промоторов кукурузы.
6. Вектор трансформации растений, включающий промотор синтазы ацетоксикислот по любому из пп. 15.
7. Способ высокоуровневой экспрессии гетерологичного гена в растении или в его различных тканях,
включающий трансформацию растения вектором, содержащим промотор синтазы ацетоксикислот по любому из пп. 1-5, и экспрессию гетерологичного гена в упомянутом растении под контролем указанного промотора.
Фиг. 1
BY 4799 C1
8. Нуклеиновая кислота, включающая нуклеотидную последовательность промотора синтазы ацетоксикислот по любому из пп. 1-5, присоединенную к гетерологичному гену.
9. Нуклеиновая кислота по п. 8, отличающаяся тем, что гетерологичный ген является мутантным геном,
способным придавать селектируемому трансгенному материалу устойчивость к гербицидам.
10. Нуклеиновая кислота по п. 9, отличающаяся тем, что включенный в нее гетерологичный ген является геном синтазы ацетоксикислот.
11. Способ селекции трансгенного материала на устойчивость к гербицидам, включающий следующие
этапы:
а) рекомбинантная трансформация растительного материала нуклеиновой кислотой, включающей нуклеотидную последовательность промотора синтазы ацетоксикислот по п. 1, присоединенную к гетерологичному гену, придающему устойчивость к гербицидам,
б) помещение трансформированного растительного материала на питательную среду, включающую соединение, являющееся гербицидом, и
в) идентификация растительного материала, способного расти в присутствии указанного соединения.
12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что в качестве гетерологичного гена выбирают ген синтазы
ацетоксикислот.
13. Способ по п. 11, отличающийся тем, что указанное соединение выбирают из имидозалинонов.
(56)
EP 0360750 A2, 1989.
WO 92/08794 A1.
Sathasivan K. еt al. Plant Physiol. 1991, v.97, p.1044-1050.
Настоящее изобретение относится к изолированным некодирующим нуклеотидным последовательностям, полезным в качестве промоторов для экспрессии гетерологичных генов у растений. Настоящее изобретение также относится к векторам, включающим эти изолированные нуклеотидные последовательности.
Царство растений подразделяется на два типа, моховидные Bryophyta и сосудистые растения Tracheophyta. Тип Tracheophyta включает свыше 266 000 видов, сгруппированных в четыре подтипа. Подтип Pteropsida включает класс покрытосеменные Angiospermae. Этот класс делится на два подкласса, двудольные и однодольные.
Поскольку однодольные включают многие важные пищевые и фуражные культуры, генетики растений
остро заинтересованы в том, чтобы иметь возможность создавать трансгенные однодольные. Известно около
50 000 видов однодольных. Они включают лилии, пальмы, орхидеи, ирисы, тюльпаны, осоки и злаки. Злаки
включают кукурузу, пшеницу, рис и все прочие злаковые зерновые. К сожалению, однодольные чрезвычайно
тяжело поддаются генноинженерным манипуляциям, так что большинство работ с растениями проводится с
двудольными.
Двудольные больше по числу видов из этих двух групп, приблизительно известно 200 000 их видов. Лютик,
львиный зев, гвоздика, магнолия, мак, капуста, роза, горох, пуансетия (Молочай красивейший, Euphorbia pulcherrima - декоративный кустарник, произрастающий в тропических лесах Мексики, очень популярен в озеленении на юге США), хлопчатник, кактус, морковь, черника, мята, томат, подсолнечник, вяз, дуб и клен представляют 19 из 250 семейств двудольных.
Генетическая информация, заключенная в молекуле ДНК, обычно служит шаблоном для синтеза огромного количества более коротких молекул РНК, многие из них в свою очередь выступают шаблонами для
синтеза специфических цепей полипептидов. Особые сегменты нуклеотидов, называемые часто промоторами, распознаются молекулами РНК полимеразы как сигнал к синтезу РНК. По окончании транскрипции
функциональной цепи РНК второй класс сигналов приводит к прекращению синтеза РНК и к отсоединению
молекул РНК полимеразы от соответствующих им шаблонов ДНК.
В настоящее время имеется ряд общих промоторов, которые используются для управления экспрессией
гетерологичных генов у однодольных растений.
David McEIRoy и др. (1990) отмечали, что испытания кратковременной экспрессии в конструкции, где
промотор гена актина 1 риса (Act1) был присоединен к бактериальному гену β-глюкуронидазы (GUS) в
трансформированных протопластах риса, показали, что промотор актина управляет высокими уровнями генной экспрессии. Эта экспрессия 6-кратно превосходила таковую с геном-промотором алкогольдегидрогеназы 1 кукурузы (Adh1) и зависела от присутствия интактного интрона Act1.
2
BY 4799 C1
David McEIRoy и др. (1991) отмечали, что оптимизированные векторы для трансформации однодольных
были сконструированы при использовании либо промотора 35S вируса мозаичности цветной капусты
/Cauliflower Mosaic Virus/ (CaMV), либо промотора Act1. Испытания кратковременной экспрессии были выполнены на трансформированных протопластах как риса, так и кукурузы. Добавление интрона Act1 и оптимизированного сайта инициализации трансляции GUS к любой промоторной последовательности значительно увеличивало генную экспрессию. Так же, как неопубликованный результат, отмечалось, что промотор
актина обнаруживает способность к управлению экспрессией GUS в кратковременных испытаниях на протопластах пшеницы, овса, ячменя и сорго.
Waggen Zhang и др. (1991) отмечали, что исследования по гибридизации in situ растений трансгенного
риса, выполненные с Act1-GUS связыванием, показали, что промотор Act1 имеет составной шаблон экспрессии как в вегетативной, так и репродуктивной ткани.
Jun Cao и др. (1992) отмечали, что растения трансгенного риса были отобраны на устойчивость к биалофосу после трансформации кусочного гена, экспрессирумого под контролем либо CaMV 35S промотора, либо промотора Act1 риса.
Alan H. Christensen и др. (1992) отмечали, что протопласты кукурузы, трансформированные присоединением гена Ubi-1-CAT кукурузы, в испытаниях кратковременной экспрессии обнаружили приблизительно 10кратно повышенные уровни CAT активности по сравнению с клетками кукурузы, трансформированными
присоединением гена CaMV-35S-GUS. Нозерн-блот анализ уровней Ubi-1 и Ubi-1 транскриптов, проводимый вслед за тепловым шоком сеянцев кукурузы, продемонстрировал, что оба гена достаточно хорошо экспрессируются при 25 °С, но индуцируются вслед за тепловым шоком.
Seiichi Toki и др. (1992) отмечали, что стабильно трансформированные растения трансгенного риса были
получены после электропоратически опосредованной трансформации кусочного гена, экспрессируемого под
контролем промотора Ubi-1 кукурузы и селекции на биалофос. Этот результат демонстрирует, что промотор
Ubi-1 может быть использован для достаточно эффективного управления высокими уровнями генной экспрессии у риса, позволяя проводить селекцию и регенерацию фертильных трансгенных растений риса.
J. Troy и др. (1993) отмечали, что стабильно трансформированные растения пшеницы были получены после бомбардировки каллусов, выращенных из незрелых эмбрионов как с кусочным геном, так и с GUS, каждый при этом экспрессировался под контролем промотора Ubi-1 кукурузы, за этим следовала селекция на
биалофос. Этот результат демонстрирует, что промотор Ubi-1 может быть использован для достаточно эффективного управления высокими уровнями генной экспрессии у пшеницы, позволяя проводить селекцию и
регенерацию фертильных трансгенных растений.
Yuechun Wan и Peggy G. Lemaux (1994) отмечали, что стабильно трансформированные фертильные растения ячменя были получены после микропроекционной бомбардировки тканей эмбрионов ячменя под контролем промотора Ubi-1 кукурузы, за которой следовала селекция на биалофос. Этот результат демонстрирует, что промотор Ubi-1 может быть использован для достаточно эффективного управления высокими
уровнями генной экспрессии у ячменя, позволяя проводить селекцию и регенерацию фертильных трансгенных растений. Эксперимент, включающий бомбардировку небольшого количества растений либо с Ubiполосой, либо с CaMV 35S-полосой показали, что нет существенного различия в полученном количестве
трансформантов.
Junkon Kyozuka и др. (1991) отмечали, что слияние промотор Adh1 кукурузы - GUS было введено в протопласты риса с целью получения трансгенных растений риса. Активность GUS у трансгенных растений определяли для выяснения структуры экспрессии GUS. Было обнаружено, что промотор Adh1 кукурузы способен
промотировать базовую экспрессию во всех частях исследованных растений. Как было предварительно продемонстрировано для экспрессии Adh1 у кукурузы, управляемая Adh1 экспрессия GUS индуцировалась в корнях в анаэробных условиях.
D.I.Last и др. (1991) отмечали, что промотор Adh1 кукурузы был модифицирован добавлением мультиплетных копий анаэробного элемента гена ADH1 кукурузы и элементов ocs гена октопин синтазы Agrobacterium tumefacience (pEmu). В тестах по кратковременной экспрессии в протопластах различных видов однодольных, трансформированных pEmu-GUS, он был лучшим составляющим, дающими 10-15 кратное
увеличение уровней экспрессии по сравнению с промотором CaMV 35S у пшеницы, кукурузы, риса, пшеницы-однозернянки Triticum monococcum и плевела многоцветкового Lolium multiflorum.
Robert Bower и Robert G. Birch (1992) отмечали, что стабильные трансформанты были получены при изменении эмбриогенного каллуса сахарного тростника геном неомицин фосфотрансферазы под контролем
Emu промотора.
3
BY 4799 C1
D.A.Chamberlain и др. (1994) отмечали, что промотор Emu использовался для управления экспрессией четырех различных выбираемых маркерных генов (неомицин фосфотрансферазы, гидромицин фосфотрансферазы, фофинотриицин N-ацетилтрансферазы и мутантной ацетолактат синтазы, дающей сопротивляемость
гербицидам), которые были трансформированы как в пшеницу, так и в рис. Каллус пшеницы и трансформированные растения риса были получены после селекции трансформантов, демонстрируя, что этот промотор может быть
использован для управления экспрессией выбираемых маркерных генов при получении трансформированных злаков.
Обзор промоторных элементов, используемых для контроля экспрессии чужеродного гена у трансгенных
злаков был недавно опубликован и здесь мы на него ссылаемся (McElroy and Brettel, 1994).
Ряд промоторов в настоящее время используется для трансформации двудольных растений. Эти промоторы происходят из различных источников. Одна группа широко используемых промоторов была выделена
из Agrobacterium tumefaciens, где их функция состоит в управлении экспрессией генов опин синтазы, переносящих сегмент Т-ДНК, который интегрируется в геном растения во время инфекции. Эти промоторы включают промотор октопин синтазы (ocs)(L.Comai et al., 1985; C.Waldron et al., 1985), промотор маннопин синтазы (mas)(L.Comai et al., 1985; K.E.McBride and K.R.Summerfelt, 1990) и промотор нопалин синтазы (nos)
(M.W.Bevan et al., 1983; Herrera-Estrella et al., 1983; R.T.Fraley et al., 1983; M.De Block et al., 1984; R.Hain et
al., 1985). Эти промоторы активны в разнообразных растительных тканях.
Для управления экспрессией гетерологичных генов двудольных используется также несколько вирусных
промоторов (J.C.Kridl and R.M.Goodman, 1986). Промотор 35S вируса мозаичности цветной капусты - один
из промоторов, которые чаще других используются для трансформации двудольных, потому что он дает высокие уровни генной экспрессии почти во всех тканях (J.Odell et al., 1985; D.W.Ow et al., 1985; D.W.Ow et al.,
1986; D.M.Shah et al., 1986). Используются также и модификации этого промотора, включая конфигурацию с
двумя тандемными 35S промоторами (R.Kay et al., 1987) и mas-35S промотор (L.Comai et al., 1990), который
состоит из промотора маннопин синтазы в тандеме с 35S промотором. Оба эти промотора управляют даже
более высокими уровнями генной экспрессии по сравнению с единичной копией 35S промотора. Другие вирусные промоторы, которые использовались, включают промотор 19S вируса мозаичности цветной капусты
(J.Paszkowski et al., 1984; E.Balazs et al.) и 34S промотор из вируса мозаичности норичника Scrophularia
(M.Sanger et al., 1990).
Изучение экспрессии AHAS у ряда растений показывает, что AHAS экспрессируется во всех растительных тканях. Gail Schmitt и Bijay K.Singh (1990) отмечали, что энзиматические тесты, выполненные на различных тканях лимской фасоли Phaseolus limensis, продемонстрировали, что активность AHAS проявлялась
во всех тестируемых тканях, включая листья, стебли, корни, цветки, стручки и меристемы. Активность
AHAS обнаруживалась фактически постоянной в стеблях, но уменьшалась в листьях, корнях и меристемах с
увеличением возраста тканей.
Sharon J. Kheeler и др. (1993) отмечали, что табак содержит два гена, кодирующие синтазу ацетоксикислот, SurA и SurB. По-видимому, оба гена экспрессируются во всех типах тканей с приблизительно 4-кратным
варьированием уровня экспрессии в различных тканях. Развивающиеся органы, по-видимому, имеют наивысшие уровни экспрессии. Исследования гибридизации in situ продемонстрировали, что наивысшие уровни
экспрессии наблюдались в метаболитически активных или интенсивно делящихся клетках. Уровни экспрессии SurB были выше, чем у SurA для всех исследованных тканей.
Therese Ouellet и др. (1992) отмечали, что виды Brassica содержат мультигенные семейства, кодирующую
синтазу ацетоксикислот. В Brassica napus были идентифицированы четыре из пяти генов AHAS. Тесты с
РНКазной защитой с использованием геноспецифических зондов проводились для определения путей экспрессии различных членов семейства генов у различных видов Brassica. Обнаружено, что два из этих генов,
AHAS1 и AHAS3 хорошо экспрессируются во всех исследованных тканях. Транскрипты AHAS2 обнаруживались только в репродуктивных органах и экстра-эмбриональной ткани семян. Транскрипты, кодируемые
четвертым геном, AHAS4, не обнаруживали, и поэтому предположили, что он представляет собой псевдоген.
Dale L.Shaner и N.Moorthy Mallipudi (1991) отмечали, что сравнение активности AHAS в молодых листьях и клетках кукурузы 'Black Mexican Sweet' /черная мексиканская сладкая/ (BMS), выращиваемых в суспензионной культуре, показало, что активность клеток BMS на грамм сырого веса была приблизительно в 5,8
раз выше по сравнению с образцами листьев. Поскольку клетки BMS являются активно делящимися, этот
результат согласуется с результатами предыдущих исследований табака и лимской фасоли Phaseolus limensis,
которые продемонстрировали, что более молодые активно делящиеся ткани обладают большей активностью
AHAS по сравнению со старыми.
Ученые исследуют способы применения генетической модификации для придания растениям желательных свойств. Методики генетической инженерии, используемые для улучшения характеристик, таких как
4
BY 4799 C1
вкус, структура, размер, устойчивость к вредителям и сопротивление воздействию гербицидов, кислотность
или сахаристость растений, употребляемых в пищу, развиваются как более скорая стратегия, чем традиционные методы скрещивания-селекции.
Настоящим патентом защищен промотор синтазы ацетоксикислот для экспрессии генов в растении,
имеющий нуклеотидную последовательность, выбираемую из группы последовательностей, представленных
в виде SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 или SEQ ID NO 3, причем его нуклеотидная последовательность представляет собой последовательность гена als1 или гена als2.
Указанная нуклеотидная последовательность может быть получена из последовательностей промоторов
однодольного растения, в частности кукурузы.
Защищен также вектор трансформации растений, включающий заявленный промотор синтазы ацетоксикислот.
Кроме того, заявлена нуклеиновая кислота, включающая нуклеотидную последовательность заявленного
промотора синтазы ацетоксикислот, присоединенную к гетерологичному гену, который может являться мутантным геном, способным придавать устойчивость селектируемому трансгенному материалу к гербицидам.
Разработаны также способ высокоуровнего экспрессирования гетерологичного гена в растении и в различных тканях этого растения и способ селекции трансгенного материала на устойчивость к гербицидам.
Упомянутый способ высокоуровнего экспрессирования гетерологичного гена в растении и в различных
тканях этого растения включает трансформацию растения заявленным вектором, содержащим заявленный
промотор синтазы ацетоксикислот, и экспрессирование гетерологичного гена в упомянутом растении под
контролем указанного промотора.
Упомянутый способ селекции трансгенного материала на устойчивость к гербицидам, включает следующие этапы:
а) рекомбинантное трансформирование растительного материала нуклеиновой кислотой, включающей
нуклеотидную последовательность заявленного промотора синтазы ацетоксикислот, присоединенную к мутантному гену, придающему устойчивость к гербицидам;
б) помещение трасформированного растительного материала на питательную среду, включающую соединение, являющееся гербицидом; и
в) идентификация растительного материала, способного расти в присутствии указанного соединения.
В качестве мутантного гена выбирают ген синтазы ацетоксикислот, а указанное соединение выбирают из
имидазолинонов.
Изобретение представлено на следующих фигурах.
Фиг. 1 раскрывает последовательность als 1 промотора AHAS кукурузы ХА17.
Фиг. 2 раскрывает последовательность als 2 промотора AHAS кукурузы ХА17.
Фиг. 3 раскрывает последовательность als 2 промотора AHAS кукурузы ХА17.
Фиг. 4 а-с является столбчатыми диаграммами, представляющими β-глюкуронидазную активность в
кратковременных тестах на протопластах клеток кукурузы 'Black Mexican Sweet' или клетках риса в суспензионной культуре после трансформации pCD221B (аls2-промотор-GUS-осs терминаторная плазмида) или
рАС400 (СаМV 35S-GUS-осs терминаторная плазмида). Активность GUS рассчитывали как пмоль/мин/мг
протеина. Представлены результаты трех независимых экспериментов.
Фиг. 5 является столбчатой диаграммой, представляющей β-глюкуронидазную активность в стабильно
трансформированных клеточных линиях кукурузы 'Black Mexican Sweet' после трансформации pCD221B
(als2-промотор-GUS-ocs терминатор) или рАС400 (CaMV 35S-GUS-ocs терминатор). Активность GUS рассчитывалась в пмоль/мин/мг протеина.
Фиг. 6 - исследования по гибридизации in situ в листовой мутовке двухнедельных сеянцев кукурузы с использованием радиоактивно помеченных РНК-зондов. Срезы тканей были препарированы и гибридизированы с РНК-зондами, кодирующими либо AHAS смысловую полосу (AHAS-), либо AHAS антисмысловую полосу (AHAS+). Для сравнения в качестве зондов использовались SSU (малая субъединица RUBISCO)
смысловая полоса (SSU-) или SSU антисмысловая полоса (SSU+). В каждом случае ожидалось, что только
антисмысловая полоса(+) будет вступать в гибридизацию с мРНК, присутствующей в ткани.
a) SSU + зонд; b) SSU-зонд; с) AHAS + зонд; d) AHAS-зонд.
Фиг. 7 - исследования по гибридизации in situ в сердцевине зародыша кукурузы спустя 12 суток после
опыления. Образцы подготовлены так же, как и на фиг. 6. а) эмбрион и суспензорий, AHAS + зонд; b) эмбрион и суспензорий, AHAS-зонд; SSU-зонд; с) перикарп, алейроновый слой и эндосперм, AHAS-зонд; d)
перикарп, алейроновый слой и эндосперм, AHAS + зонд.
5
BY 4799 C1
Фиг. 8 - исследования по гибридизации in situ в апикальной меристеме молодых растений кукурузы. Образцы
подготовлены так же, как и на фиг. 6. а) и b) AHAS + зонд; с) и d) AHAS-зонд.
Характеристики изолированных нуклеотидных последовательностей, включающих промотор синтазы
ацетоксикислот для экспрессии генов у растений, представлены на страницах: - 18-19 SEQ. ID No. 1,
-19-20 SEQ. ID No. 2,
-20-21 SEQ. ID No. 3.
Промоторы AHAS из кукурузы используются для экспрессии интродуцированных генов на высоком
уровне и в различных тканях растений. Промоторы из генов als1 и als2 клонируются и секвенируются
(фиг. 1, фиг. 2, фиг. 3), и промоторные регионы из этих генов затем интродуцируются в плазмиду 5' к генурепортеру β-глюкуронидазы (GUS). Оба промоторных фрагмента происходят от линии кукурузы ХА17.
Промоторный фрагмент als1 длиной 413 пар оснований, в то время как промоторный фрагмент als2 содержит 509 пар оснований. Чтобы определить активность промоторов AHAS, для анализа уровней кратковременной экспрессии химерные плазмиды были затем перенесены в протопласты кукурузы 'Black Mexican
Sweet' /черная мексиканская сладкая/ и протопласты риса. Для сравнения протопласты были также трансформированы плазмидой с промотором CaMV 35S, управляющим геном-репортером GUS. Экспрессия химерных плазмид в клетках кукурузы определялась путем анализа ферментативной активности GUS. Активность промотора als2 была равной или превосходила активность промотора CaMV 35S в обоих типах клеток
(фиг. 4). Фиг. 5 показывает результаты β-глюкуронидазных тестов, выполненных на клеточных линиях BMS
кукурузы, стабильно трансформированных либо pCD221B (als2-GUS-осs терминаторная плазмида), либо
рАС400 (CaMV 35S-GUS-ocs терминаторная плазмида). Анализ распределения AHAS мРНК путем гибридизации in situ радиоактивно помеченных РНК-зондов в растительную ткань показывает, что промоторы AHAS
кукурузы активны в большинстве частей растения (фиг. 6, фиг. 7, фиг. 8).
Активность промотора AHAS анализировалась у растений арабидопсиса, которые были стабильно трансформированы с использованием Agrobacterium tumefaciens. Входной промоторный регион гена AHAS арабидопсиса присоединялся к гену-репортеру GUS, вставлен в бинарный вектор pBIN19 и далее использовался
для трансформации арабидопсиса. Анализы трансформированных растений показывают, что при этом происходит экспрессия GUS (судя по активности промотора) в большинстве частей растения.
Настоящее изобретение относится, таким образом, к промоторам AHAS кукурузы и арабидопсиса и к
векторам, включающим эти промоторы. Применительно к данной заявке, промотор определяется как нуклекотидная последовательность, находящаяся в начале гена, которая действует как сигнал для связывания с
РНК-полимеразой. Гены als1 и als2 кукурузы клонируются и секвенируются, и промоторные регионы из этих
генов затем интродуцируются в плазмиду 5' к гену-репортеру GUS. Применительно к данной заявке, генрепортер определяется как нуклеотидная последовательность, которая присоединена в конец интересующего
промотора, так что транскрипты, инициализирующиеся с этим промотором, затрагивают ген-репортер. Генрепортер обычно кодирует ряд легко определяемых по своей активности ферментов, например в настоящем
изобретении экспрессия химерных плазмид в клетках кукурузы определяется анализом активности фермента
β-глюкуронидазы (GUS).
Работающий в данной области должен осознавать, что промоторы AHAS обладают высокой активностью
во многих растительных тканях различного происхождения, и их можно использовать для экспрессии новых
генов у разнообразных растений. Новые гены включают, но не сводятся к ним, гены устойчивости к гербицидам, детоксикации и сопротивляемости растительным патогенам.
Заявляемые промоторы могут использоваться для экспрессии гетерологичных генов у однодольных,
включая, но, не ограничиваясь такими видами, кукурузу, рис, пшеницу, ячмень, сорго, овес, рожь и просо.
Работающий в данной области также должен осознавать, что заявляемые промоторы будут также управлять
экспрессией у двудольных, хотя экспрессия промоторов однодольных у двудольных, по-видимому, характеризуется более низкими уровнями по сравнению с ее протеканием у однодольных.
Работающий в данной области должен осознавать, что промотор als2 кукурузы можно использовать для
управления генной экспрессией у других видов однодольных. Например, промотор Act1 риса управляет генной экспрессией в протопластах кукурузы, промотор Emu кукурузы использовался для селекции трансгенных пшеницы, ячменя и риса, а промотор AHAS арабидопсиса, промотор двудольного, использовали для
управления экспрессией гена AHAS у трансгенных табака и картофеля. Упомянутый als2 кукурузы лучше
всего функционирует в кукурузе, но также управляет экспрессией генов у другого однодольного. На основе
исследований, выполненных на кукурузе и других видах, следует заключить, что этот промотор будет управлять базовой экспрессией гена у растения везде. Наиболее высокие уровни экспрессии наблюдаются либо в
активно делящихся, либо в метаболитически активных тканях.
6
BY 4799 C1
Для трансформации однодольных культур использовались разнообразные методики, хорошо известные
работающим в данной области, которые однако не ограничиваются микропроективной бомбардировкой,
ПЭГ-опосредованной трансформацией, электропорацией и силиконовыми волокнами. Все эти методики
включают использование векторов ДНК для доставки нуклеотидных последовательностей, подлежащих изменению. Векторы, пригодные для использования в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются ими, векторы, переносящие маркерные гены, используемые для селекции трансгенного материала,
включая гены, придающие устойчивость к гигромицину, канамицину, биалофосу и гербицидам, производным имидазолинона и сульфонил-мочевины.
Следующий пример служит только для иллюстрации данного изобретения и не может быть истолкован
как любым образом ограничивающим это изобретение.
Пример.
Эффективность промоторов als1 и als2 оценивается путем измерения активности GUS в протопластах кукурузы и риса или клеточных линиях кукурузы с конструкциями, в которых эти последовательности промотора присоединены к гену GUS. Приготовление векторов и протокол трансформации описаны ниже.
Конструкции, содержащие химерные гены CaMV 35S-GUS, als1-GUS и als2-GUS
Плазмида рАС400 является рUС19-базируемой плазмидой, содержащей присоединение 418 пар оснований фрагмента EcoRI-Xbal промотора CaMV 35S, клонированного у головы 1,7-kb фрагмента Xbal-Pstl, содержащего ген GUS и 700 пар оснований фрагмента Pstl-BamHI, содержащего терминатор октопин синтазы.
Гены als1 и als2 получены путем скрининга библиотеки генома, приготовленной из кукурузы линии ХА17.
Фрагмент EcoRI-Ncol, содержащий 413 пар оснований последовательности у головы кодона АТG инициализации гена als1 субклонирован в рАС400 на место CaMV 35S промотора, и так была образована pCD223B.
Фрагмент Pstl-Ncol, содержащий 509 пар оснований у головы АТG гена als2, был субклонирован спереди того же самого GUS-ocs терминатора связывания в pBluescript® KS- (Stratagene), и так была образована pCD221B.
Последовательность промотора als2 кукурузы ХА17 представлена на фиг. 3.
Трансформация и оценка протопластов риса и кукурузы
Протопласты были выделены из клеток в суспензионной культуре риса (Nortai) или кукурузы (Black
Mexican Sweet, BMS) в суспензионной культуре и трансформированы плазмидами рАС221В или рАС400 в
соответствии с протоколами ПЭГ-опосредованной трансформации по L.A.Lyznik et al. (1989) и J.Y.Peng et al.
(1990). В кратковременных оценках трансформированные протопласты риса распределялись по поверхности
милипоровских фильтров, помещенных поверх среды, содержащей питающие (донорные) клетки, и трансформированные протопласты BMS культивировались в 3 мл жидкой среды. Спустя двое суток после трансформации культура протопластов были собраны и экстрагированы буфером для извлечения GUS. Активность GUS измерялась флюориметрически в соответствии с протоколом R.A.Jefferson (1987).
Для обнаружения стабильных трансформантов в культуре кукурузы BMS, протопласты были котрансформированы pFF19K (содержащей выбираемый маркерный ген, кодирующий неомицин фосфотрансферазу) и pCD221B или рАС400. После трансформации протопласты культивировались на милипоровских
фильтрах, помещенных поверх среды, содержащей питающие (донорные) клетки. Спустя неделю протопласты переносили на среду, содержащую питающие (донорные) клетки и 100 мг/л канамицина. Культуры протопластов переносили на свежую среду Мурасиге-Скуга с 100 мг/л канамицина до тех пор, пока резистентные каллусы не стали видимыми. Индивидуальный каллус, резистентный к канамицину, собрали и
выращивали в течение двух-трех недель в присутствии канамицина. Каллус, резистентный к канамицину, окрашивали X-Gluc или тестировали MUG по протоколу R.A.Jefferson (1987) с целью скрининга GUSпозитивного каллуса. Каллус, идентифицированный как экспрессирующий GUS, измельчали в экстракционном буфере и тестировали, активность GUS измеряли флюориметрически.
Данные этих экспериментов представлены на фиг. 4 и фиг. 5.
Мутантный ген AHAS кукурузы, ответственный за резистентность к гербицидам группы имидазолинона,
и управляемый промотором als2 кукурузы, использовался в качестве выбираемого маркера для получения
трансгенного каллуса после трансформации как BMS, так и А188×В73 клеток и клеток риса. Этот результат
подтверждает идею, что промотор als2 эффективно управляет высокими уровнями экспрессии, что дает ему
возможность управлять экспрессией маркерного гена.
Гибридизация in situ
Препараты на предметных стеклах готовились в основном по J.A.Langdale et al. (1988). Ткань фиксировали в 4 % формалине, обезвоживали в этиловом спирте, очищали в ксилоле и заключали в парафиновую
пленку. Из ткани готовили срезы 8-10 µм и помещали на предметные стекла, покрытые поли-L-лизином. Парафин удаляли ксилолом, и ткань повторно гидратировали (обратная проводка) промыванием этанолом и
7
BY 4799 C1
споласкиванием в воде. РНК-зонды готовили из обеих лент ( + и -) 172-х нуклеотидного фрагмента региона,
кодирующего als2, и 392-х нуклеотидного фрагмента региона, кодирующего SSU, используя набор Ambion
Maxiscript®. Препараты на предметных стеклах подвергали гибридизации согласно протоколу Meyerowitz et
al. (1988) при 50 °С на ночь в разбавлении 1:4 SPB [100 µл 10 кратных солей (3 М NaCl, 10 мМ Tris рН 6.8,
50 мМ DTA); 400 µл формамида; 200 µл 50 % сульфата декстрана; 40 µл 10 мг/мл тРНК; 10 µл 1 MDTT; 50
µл 10 мг/мл poly А/полиаденилат/] с зондом, денатурированном в 50 % формалине и 10 мМ DTT при 80 °С в
течение 30 секунд. Препараты на предметных стеклах промывали дважды по 15 мин в промывном буфере
(однократные соли, 50 % формамид, 10 мМ Tris рН 8, 1 мМ EDTA, 10 мМ DTT) при 50 °С, обрабатывали
РНКазой А (20 µг/мл в NTE_) в течение 30 мин при 37 °С, промывали пятикратно в NTE буфере при 37 °С за
1 ч, дважды промывали по 30 мин в промывном буфере при 50 °С, обезвоживали в этаноле и высушивали на
воздухе. Препараты на предметных стеклах автора-диографировали путем погружения в эмульсию, предварительно нагретую до 37 °С в темноте, высушивания в течение 30 мин-1 часа и хранения в темноте при 4 °С
до проявления. Препараты проявляли в течение 2 мин, ополаскивали в воде, фиксировали в течение по крайней мере 5 мин и снова ополаскивали в воде. Ткань окрашивали с помощью Alcien Blue (синий краситель) и
обесцвечивали в этаноле и ксилоле. После установки в предметный столик Permount ткань просматривали с
использованием микроскопа темного поля.
Данные экспериментов по гибридизации in situ на фиг. 6-8 показывают, что ген в эмбрионе кукурузы экспрессируется везде.
Оказывается возможным оценить экспрессию промотора AHAS путем:
1) конструирования гена связывания als2-GUS и определения структуры активности GUS у трансгенных
растений кукурузы или риса. Предыдущие исследования с использованием промотора кукурузы продемонстрировали пригодность оценки экспрессии промотора кукурузы у риса (Junko Kyozuka et al., 1991). После
селекции трансгенных растений с целью определения как специфичности по ткани, так и по типу клеток были выполнены гистохимические анализы растительных тканей на различных стадиях развития. Этот способ
обычно используется для оценки активности промотора как у однодольных, так и у двудольных;
2) оценки кратковременной экспрессии проделаны на протопластах, полученных от различных видов
растений после трансформации конструкций als2-GUS. Этот подход используется для оценки способности
различных промоторов функционировать у гетерологичных видов. Протопласты трансформировали с помощью интересующей конструкции и выдерживали для того, чтобы интродуцированный ген экспрессировался
и накопился соответствующий протеин. После такой выдержки клетки тестировались на присутствие протеина, кодируемого трансгеном для определения эффективности управляемой промотором трансгенной экспрессии.
Источники информации:
1. David McElroy et al., (1990). Изоляция эффективного актин промотора для использования в трансформации риса. The Plant Cell 2; 163-171.
2. David McElroy et al., (1991). Конструкция векторов экспрессии, основанных на региональном актин 1
(Act1) риса для использования в трансформации однодольных растений. Mol.Gen Genet. 231: 150-160.
3. Wanggen Zhang et al., (1991). Анализ активности Acti 5' региона в трансгенезе растений риса. The plant
Cell 3: 1155-1165.
4. Jun Cao et al., (1992). Регенерация гербицидной резистентности трансгенеза растений риса в связи с
промежуточной трансформацией суспензионной культуры клетов. Plant Cell Reports II: 586-591.
5. Alan H. Christensen et al., (1992). Полиубиквитин гены кукурузы: структура, термальная пертурбация
экспрессии и транскрипция сплайсинга, и активность промотора, следующая за передачей к протопластам
путем электропорации. Plant Molecular Biology 18: 675-689.
6. Seiichi Toki et al., (1992). Экспрессия убиквитин генетического промотора кукурузы - бар химерного
гена в трансгенезе растений риса. Plant Physiol. 100: 1503-1507.
7. Troy et al., (1993). Ускоренное продуцирование со сложной структурой независимых линий фертильной
трансгенной пшеницы. (Triticum aestivum). Plant Physiol. 102: 1077-1084.
8. Yucchun Wan and Peggy G. Lemaux, (1994). Генерация большого числа независимо трансформированных растений ячменя. Plant Physiol. 104: 37-48.
9. Junko Kyozuka et al., (1991). Анаэробная индукция и тканеспецифичная эксперессия Adhi промотора
кукурузы в трансгенные растения риса и их потомство. Mol. Gen. Genet. 228; 40-48.
8
BY 4799 C1
10. D.I. Last et al., (1991). pEmu: улучшенный промотор для экспрессии гена в клетках злаковых. Theor.
Appl. Genet. 81: 581-588.
11. Robert Bower and Robert G. Birch (1992). Трансгенные растения сахарного тростника, полученные путем микропроекционной бомбардировки. The Plant Journal 2 (3): 409-416.
12. D. A. Chamberlain et al., (1994). Использование Emu промотора с антибиотической и гербицидной резистентностью генов для селекции каллуса растений трансгенной пшеницы и риса. Aust. J. Plat. Physiol., 21:
95-112.
13. L. Cornai et al. (1985). Экспрессия в растениях мутанта аroА гена из Salmonella typhimurium сравнивается с толерантностью к глифосфату. Nature 317: 741-744.
14. С. Waldron et al. (1985). Резистентность к гидромицину В: новый маркер для изучения трансформации
растений. Plant Mol. Biol. 5: 103-108.
15. Kevin E. McBride, Kristin R. Summerfelt (1990). Улучшенные бинарные векторы для трансформации
Agrobacterium-mediated растений. Plant Mol. Biol. 14: 269-276.
16. Michael Bevan et al. (1983). Химерный ген с антибиотической резистентностью в качестве пригодного
для селекции маркера для трансформации растительной клетки. Nature 304: 184-187.
17. Luis Herrera-Estrella et al. (1983). Экспрессия химерных генов, трансформированных в клетки растений
путем использования Ti-плазмид- разветвленного вектора. Nature 304: 209-213.
18. Robert Т. Fraley et al. (1983). Экспрессия бактериальных генов в клетках растений. P.N.A.S. 80: 48034807.
19. Marc De Block et al. (1984) Экспрессия инородных генов в регенерированных растениях и их потомстве. EMBO J.3: 1681-1689.
20. R. Hain et al. (1985). Ввод, интеграция, экспрессия и генетическая трансмиссия пригодных для отбора
химерных генов протопластов растений. Mol. Gen. Genet. 199: 161-168.
21. J.C. Kridi and Robert M. Goodman (1986). Транскрипциональные регуляторные последовательности,
полученные из вирусов растений. Bio Essays 4: 4-8.
22. Joan Т. Odell et al. (1985). Идентификация ДНК последовательностей, необходимых для активации
35S промотора вируса мозаики цветной капусты. Nature 313: 810-812.
23. David W. Ow et al (1986). Временная и устойчивая экспрессия гена люциферазы светляков в клетках
растений и трансгенных растений. Science 234: 856-959.
24. D.M. Shah et al. (1896). Инженерия гербицидной толерантности в трансгенных растениях. Science 233:
478-481.
25. Robert Kay et al. (1987). Дупликация CaMV последовательностей 35S промотора создает сильный энхансер для растительных генов. Science 236: 1299-1302.
26. L. Cornai et al. (1990). Новые и полезные свойства химерного растительного промотора в комбинации
CaMV 35S и MAS элементов. Plant Mol. biol. 15: 373-381.
27. J. Pazskowski et al. (1984). Прямая передача гена в растения. Plants. EMBOJ. 3: 2717-2722.
28. Ervin Balazs et al., (1985). Конструкция химерного вектора для трансформации высших растений. Gene
40: 343-348.
29. Margaret Sanger et al., (1990). Характеристики сильного промотора для вируса мозаичности норичника
шишковатого. Сравнение с аналогами 35S промотора для вируса мозаичности цветной капусты и промотора
маннопин синтазы. Plant Mol. Biol. 14: 433-443.
30. Gail Schmidt and Bijay K. Singh (1990). Активность тканевого распределения синтазы ацетооксикислот на различных стадиях развития фасоли лима. Pesticide Sci. 30 (4): 418-419.
31. SI.Sharon J. Kheeler et al., (1993). Экспрессия регуляции гена актиолактат синтазы табака. Plant
Physiol. 102: 1009-1018.
32. Therese Ouellet et al., (1992). Органы синтазы ацето-оксикислот мультигенного семейства Brassica
napus имеют различные паттерны экспрессии. The Plant Journal 2: 321-330.
33. Dale L. Shaner and N. Moorthy Mallipudi (1991). Взаимодействия синтазы имадозолинон-ацетооксикислот. Irnidazolinone Herbicides ed. Dale L. Shaner and Susan L. 0' Connor CRC Press (Boca Raton, FL.).
34. R.A. Jefferson (1987). Анализ химерных генов в растениях: система слияния GUS генов. Plant Mol.
Biol. Rept 5: 387-405.
35. L.A. Lyznik et al. (1989). Стабильная трансформация протопластов кукурузы с gusA и neo генами. Plant
Mol biol 13: 151-161.
36. J.Y. Peng et al., (1990). Ко-трансформация протопластов риса indica с neo и gusA генами. Plant Cell
Kept 9: 168-172.
9
BY 4799 C1
37. J.A. Langdale et al., (1988). Экспрессия клеточных паттернов фотосинтетического гена в развивающихся листьях кукурузы. Gene Dev. 2: 106-115.
38. Е. Meyerowitz et al., (1988). Гибридизация "на месте" в растительных клетках РНК. Plant Mol. Bio.
Kept., 5: 242-250.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
(1)ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ
(i) APPLICANT: ДИТРИХ, Габриэл
(ii) НАЗВАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ: Heкодирующая DNA 5' к структуральному гену (промотору) для синтазы ацето-оксикислот (AHAS) используемая для экспрессии в интродуцированных генах растений.
(iii) ЧИСЛО СИКВЕНСОВ (ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ): 3
(iv) АДРЕС ДЛЯ ПЕРЕПИСКИ:
(A) АДРЕСАНТ: Америкен Цианамид Компани
(B) УЛИЦА: Уан Цианамид Плаза
(C) ГОРОД: Вейн
(D) ШТАТ: Нью Джерси
(E) СТРАНА: Соединенные Штаты
(F) ИНДЕКС: 07470-8426
(v) ДАННЫЕ О КОМПЬЮТЕРЕ:
(A) МЕДИУМ ТИП: Флоппи диск
(B) КОМПЬЮТЕР: IBM PC совместимый
(C) ОПЕРАЦИОННАЯ СИСТЕМА: PC-DOS/MS-DOS
(D) СОФТВЕЙР: Патентные документы <1.0, Версия <1.25
(vi) СВЕДЕНИЯ О ЗАЯВКЕ:
(A) ЗАЯВКА №: США
(B) ДАТА ПОДАЧИ:
(C) КЛАССИФИКАЦИЯ:
(viii) ИНФОРМАЦИЯ О ПОВЕРЕННОМ/АГЕНТЕ:
(A) Ф.И.О.: ГАРИНГТОН, Джеймс Дж.
(B) РЕГИСТРАЦИОННЫЙ НОМЕР: Р38, 711
(C) № ДЕЛА: 32, 348
(ix) ИНФОРМАЦИЯ О ТЕЛЕКОММУНИКАЦИИ:
(A) ТЕЛЕФОН; 201-831-3246
(B) ТЕЛЕФАХ- 201-831-3305
(2)ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ SEQ ID № 1:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ СИКВЕНСА:
(A) ДЛИНА: 413 спаренных оснований
(B) ТИП: нуклеиновая кислота
10
BY 4799 C1
(C) СКРУЧЕННОСТЬ НИТИ: одиночная
(D) ТОПОЛОГИЯ: линейная
(ii) ТИП МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная)
(iii) ГИПОТЕТИЧЕСКИЙ: НЕТ
(iv) АНТИ-ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ: НЕТ
(xi) ОПИСАНИЕ СИКВЕНСА: SEQ ID №: 1
(2) ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ SEQ ID № 2:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ СИКВЕНСА:
(A) ДЛИНА: 509 спаренных оснований
(B) ТИП: нуклеиновая кислота
(C) СКРУЧЕННОСТЬ НИТИ: одиночная
(D) ТОПОЛОГИЯ: линейная
(ii) ТИП МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная)
(xi) ОПИСАНИЕ СИКВЕНСА: SEQ ID №:2
(2) ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ SEQ ID № 3:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ СИКВЕНСА:
11
BY 4799 C1
(A) ДЛИНА: 829 спаренных оснований
(B) ТИП: нуклеиновая кислота
(C) СКРУЧЕННОСТЬ НИТИ: одиночная
(D) ТОПОЛОГИЯ: линейная
(ii) ТИП МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная)
(xi) ОПИСАНИЕ СИКВЕНСА: SEQ ID №: 3
Фиг. 2
12
BY 4799 C1
Фиг. 3
Фиг. 4а
Фиг. 4b
Фиг. 4c
13
BY 4799 C1
Фиг. 5
Фиг. 6a
Фиг. 6b
Фиг. 6c
Фиг. 6d
14
BY 4799 C1
Фиг. 7a
Фиг. 7b
Фиг. 7c
Фиг. 7d
Фиг. 8a
Фиг. 8b
Фиг. 8c
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66.
15
Фиг. 8d
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
1 055 Кб
Теги
by4799, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа