close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY4903

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(19)
BY (11) 4903
(13)
C1
(51)
(12)
7
C 07K 1/14,
C 07K 14/435,
C 12P 9/00
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
(21) Номер заявки: 950908
(22) 1995.11.03
(46) 2002.12.30
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРРИТИНА
(71) Заявители: Стрельченок О.А., Дрожденюк А.П.,
Усанов С.А., Лобанов Н.А. (BY)
(72) Авторы: Стрельченок О.А., Дрожденюк А.П.,
Усанов С.А., Лобанов Н.А. (BY)
(73) Патентообладатели: Стрельченок
Олег
Анатольевич, Дрожденюк Анатолий Павлович,
Усанов Сергей Александрович, Лобанов
Николай Александрович (BY)
(57)
Способ получения ферритина, включающий получение тканевого экстракта, фракционирование его сульфатом
аммония и адсорбционную хроматографию, отличающийся тем, что экстракцию проводят в присутствии ингибитора протеаз, перед фракционированием осуществляют термообработку тканевого экстракта, а хроматографию
проводят непосредственно после фракционирования.
BY 4903 C1
(56)
SU 1588758 A1, 1990.
PAGE M. et al. Canadian Journal of Biochemistry, 1980, v.58. - Р.494-498.
DE 3927139 A1, 1991.
CRICHTON R.R. et al. Biochem. J., 1973, v.131. - Р. 51-59.
HAMISH N. et al. Physiological Reviews, 1978, v. 58. - Р. 318-387.
DRYSDALE J.W. Biochem. J., 1974, v. 141. - Р. 627-632.
US 5358722 A, 1993.
US 5491219 A, 1993.
Изобретение относится к области биологической и медицинской химии, конкретно к способу получения
ферритина из селезенки и сердца человека.
Ферритин (Ф) - крупный субъединичный белок, состоящий из двух типов субъединиц: тяжелой (Н) и легкой (L). Н-субъединицы преобладают в составе кислых Ф, характерных для сердца, плаценты, красных кровяных клеток, лимфоцитов и моноцитов, в то время как Ф селезенки и печени обогащен L-субъединицами
основного характера.
Небольшое количество ферритина присутствует в плазме крови человека и изменение его уровня позволяет рассматривать этот белок в качестве специфического маркера состояния человеческого организма.
В связи с этим разработаны и внедрены в медицинскую практику радиодиагностические тест-системы
для исследования такого рода заболеваний. Основным компонентом данных систем является высокоочищенный препарат Ф. Начальной стадией выделения Ф является, как правило, термообработка (70-80 °С, 5-10
мин) гомогената того или иного органа, так как было установлено, что данный белок является термостабильным, в то время как часть других белков денатурирует и коагулирует [1].После центрифугирования и отде-
BY 4903 C1
ления осадка супернатант, содержащий Ф и другие термостабильные белки, подвергают дальнейшему фракционированию и хроматографической очистке.
Известен способ получения Ф из селезенки или печени человека [2], заключающийся в том, что тканевый экстракт
подвергают термообработке, фракционируют сульфатом аммония, белки с низкой скоростью седиментации удаляют
ультрацентрифугированием, а конечную очистку целевого продукта проводят гель-хроматографией на Сефадексе G200 и кристаллизуют белок из раствора сульфата кадмия.
Известен способ [3] получения Ф, включающий получение тканевого экстракта печени, термообработку,
улътрафильтрацию (ХМ-300), гель-хроматографию на Сефакриле S-300, аффинную хроматографию на
DEAE Affi Gel Blue. Выход ферритина - 32 %.
Наиболее близким к заявляемому является способ [4] получения Ф, заключающийся в получении тканевого экстракта, фракционировании его сульфатом аммония, ультрацентрифугировании и гельхроматографии. Для повышения выхода целевого продукта проводят хроматографию на кальций-тартратном
геле.
Задачей настоящего изобретения является упрощение технологии получения высокоочищенного Ф (9598 % чистоты) и увеличение его выхода.
Поставленная задача достигается заявляемым способом получения высокоочищенного Ф в препаративных количествах, включающем получение тканевого экстракта, термообработку экстракта, фракционирование его сульфатом аммония и адсорбционную хроматографию.
Высокая степень чистоты препарата ферритина из сердца человека подтверждается методом SDSэлектрофореза в 15 % ПААГ (фиг. 1). На электрофореграмме отчетливо проявляются только тяжелые и легкие субъединицы ферритина.
Пример 1.
Получение Ф из селезенки человека.
Постмортальную быстрозамороженную ткань селезенки измельчают и гомогенизируют в дистиллированной воде в соотношении препарат: Н2О (1:3) в течение 5 мин с добавлением ингибитора протеаз FMSF до
конечной концентрации 0,001 М. Полученный гомогенат перемешивают в течение 2 ч для более полной экстракции Ф. Затем осадок отделяют центрифугированием (16-15 тыс. об/мин), а супернатант подвергают термообработке (70 °С, 3 мин) в термостатированном стакане. После термообработки коагулированные белки
удаляют центрифугированием (15000 об/мин, 20 мин).
Фракционирование сульфатом аммония (СА).
В супернатант добавляют СА до 35 % насыщения, осадок отбрасывают, в супернатант добавляют СА до
58 % насыщения, инкубируют 1 час при 40 °С и супернатант отбрасывают.
Хроматография на кальций-тартратном геле (КТГ).
Колонку, заполненную КТГ, уравновешивают натрий-фосфатным буфером (НФБ), содержащим мочевину и бикарбонат натрия, рН 8,0 и наносят сульфат-аммонийный осадок белков, растворенных в этом же буфере. В данных условиях большинство белков не связывается с сорбентом. После нанесения колонку промывают 0,1 М НФБ, а Ф элюируют 0,25 М НФБ, добавляют СА до 70 % насыщения и хранят при 4 °С в
течение 1 месяца или пропускают раствор через бактерицидные фильтры и хранят в растворе.
Пример 2.
Исключение стадии тепловой обработки.
После получения тканевого экстракта было проведено фракционирование белков сульфатом аммония (35 % и
58 % насыщения), а дальнейшая очистка включала хроматографию на КТГ (аналогично примеру 1) и дополнительную очистку методом гель-хроматографии на Сефадексе G-200.
Препараты Ф, полученные по примерам 1 и 2, показали идентичность иммунохимических свойств в иммунорадиометрической системе "ИРМО-ферритин" производства ХОП ИБОХ НАН Б. Кроме того прогрев препарата Ф
(70 °С, 3 мин), полученного по примеру 2, не привел к изменению его иммунных свойств. Таким образом, первоначальная термообработка экстракта не приводит к изменению нативной структуры Ф при условии добавления ингибитора протеаз в буферные системы выделения.
Пример 3.
Выделение Ф из сердца человека.
Процесс осуществляли, как описано в примере 1. Отличием является использование при десорбции белка
с КТГ 0,2 М НФБ, рН 7, 4.
Выход белка, полученного по способу [4] (прототип), составляет 10-12 мг белка из 100 г ткани печени и
15-19 мг из 100 г ткани селезенки человека. В связи с тем, в заявляемом способе отсутствуют стадии ультрацентрифугирования и гель-фильтрации, значительно усложняющие процедуру выделения и приводящие к
2
BY 4903 C1
существенной потере белка, выход ферритина по заявляемому способу составляет 18-26 мг из 100 г ткани
селезенки и 6-10 мг из 100 г ткани сердца человека. Некоторые отличия в выходе очищенных препаратов из
100 г ткани связаны с разным содержанием ферритина в исходной ткани, используемой для выделения и
очистки белка. Выделение ферритина из ткани печени не проводилось.
Важным преимуществом от способа-прототипа наряду с исключением двукратного ультрацентрифугирования является использование в процессе адсорбционной хроматографии специальной буферной системы,
которая препятствует связыванию с сорбентом балластных белков, а также предотвращает белок белковое
взаимодействие, что приводит, в конечном счете, к двухстадийному получению Ф высокой степени чистоты.
Источники информации:
l. Hamish N. Munro and Maria C. Linder, Ferritin: Structure, Biosynthesis and Role in Iron Metabolism.
Physiological Reviews, vol. 58, № 2, 318-387, 1978.
2. R. R. Crlchton, J. A. Millar, R. L. C. Gumming and C. F. A Bryce. The organ specificity of ferritin in human
and horse liver and spleen. Biochem. J..1973. vol. 131. № l. p. 51-59.
3. M. Page, J. Laguueux and C.Gauthier. A three step purification procedure for human liver ferritin. Can. J. Biochem. 1980. vol. 58. p. 494-498.
4. А. с. СССР 1588758, Al, 1990.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66.
3
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
132 Кб
Теги
by4903, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа