close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY5081

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
BY (11) 5081
(13) C1
(19)
7
(51) A 61K 39/00,
(12)
C 12N 7/00,
A 61P 1/00
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
АССОЦИИРОВАННАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ ТРАНСМИССИВНОГО
ГАСТРОЭНТЕРИТА И РОТАВИРУСНОЙ БОЛЕЗНИ ПОРОСЯТ И
СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ
BY 5081 C1
(21) Номер заявки: 970242
(22) 1997.05.08
(46) 2003.03.30
(71) Заявитель: Республиканское научноисследовательское унитарное предприятие "Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского" (BY)
(72) Авторы: Ястребов Аскалон Сергеевич;
Ковалев Николай Андреевич; Савельева Тамара Александровна (BY)
(73) Патентообладатель: Республиканское
научно-исследовательское унитарное
предприятие "Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского" (BY)
(57)
1. Ассоциированная вакцина против трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной
болезни поросят, включающая культуральную вируссодержащую суспензию корона- и
ротавируса свиней и наполнитель, отличающаяся тем, что в качестве культуральной вируссодержащей суспензии она содержит суспензию штамма вируса Transmissible gastroenteritis of swine "КМИЭВ-10" с титром в культуре клеток СПЭВ 6,5 lg ТЦД50/мл и суспензию
штамма Porcine rotavirus of swine "КМИЭВ-11" с титром 7,5 lg ТЦД50/мл в соотношении
2:1, а в качестве наполнителя - адъювант эмульсиген при следующем соотношении компонентов, об. %:
культуральная вируссодержащая
суспензия
80,0-90,0
наполнитель
10,0-20,0
2. Способ получения ассоциированной вакцины против трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной болезни поросят, включающий заражение культуры клеток вирусами, культивирование и сбор вируссодержащего материала, введение наполнителя, отличающийся тем, что заражение культуры клеток проводят вирусом трансмиссивного
гастроэнтерита "КМИЭВ-10" с титром 6,5 lg ТЦД50/мл и ротавирусом свиней "КМИЭВ-11" с
титром 7,5 lg ТЦД50/мл, в качестве культуры клеток используют перевиваемую культуру клеток СПЭВ с множественностью заражения 0,3-0,4 тканевых цитопатогенных доз (ТЦД50) на
клетку, культивирование проводят на 5 %-ном гемогидролизате, полученные суспензии вируса трансмиссивного гастроэнтерита "КМИЭВ-10" и ротавируса свиней "КМИЭВ-11" смешивают в соотношении 2:1, а в качестве наполнителя используют адъювант эмульсиген, причем
его вводят в количестве 15 об. % от общего объема получаемой ассоциированной вакцины.
(56)
АЛИПЕР Т.И. Экспериментальная вакцина против трансмиссивного гастроэнтерита и
ротавирусной болезни свиней (ТР-I): оценка антигенности и оптимизация условий
применения. - М., 1989. - С. 1-24.
RU 2028804 C1, 1995.
RU 2055889 C1, 1992.
BY 5081 C1
Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и может быть использовано для
профилактики вирусных гастроэнтеритов поросят.
Известна инактивированная эмульгированная культуральная вакцина против трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТГС), изготовленная во Всероссийском НИИ защиты
животных (г. Владимир), взятая нами за прототип [1]. В качестве антигена используют
инактивированный вирус трансмиссивного гастроэнтерита свиней, полученный на культуре клеток, к которому добавляют масляный адъювант. Недостатком вакцины является
то, что перед применением ее необходимо предварительно прогревать до 37 °С. Кроме того, трансмиссивный гастроэнтерит в свиноводческих хозяйствах часто протекает в ассоциации с ротавирусным гастроэнтеритом. В этой связи возникает необходимость проведения специфической профилактики не только против трансмиссивного гастроэнтерита,
но и против ротавирусной болезни свиней. Вакцина по прототипу [1] создает иммунитет у
привитых животных только к возбудителю трансмиссивного гастроэнтерита и не создает
его к ротавирусной болезни свиней.
Известен способ изготовления вакцины против трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной болезни свиней, взятой нами за прототип [2]. Вирусы трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной болезни свиней выращивают на перевиваемой культуре клеток
почки поросенка или щитовидной железы. В качестве ростовой среды используют солевой раствор Хенкса с 0,2-0,3 % ФГМ-с и 7-10 % коммерческой сыворотки крупного рогатого скота. Готовят 2 вида набора вакцин: 1) живую вакцину, содержащую смесь в равных
объемах аттенуированных штаммов вируса трансмиссивного гастроэнтерита и ротавируса
свиней; 2) инактивированную формалином вакцину, содержащую смесь равных объемов
вирусов трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной болезни с адъювантом, состоящим из минерального масла и ланолина в соотношении 4:1.
Способ применения вакцины комбинированной: живую вакцину в дозе 3.106,5 ТЦД50
вводят свиноматкам интранозально, инактивированную -внутримышечно в дозе 3,0 см3.
Недостатком способа получения вакцины по прототипу [2] является необходимость
приготовления набора из двух видов вакцин (живой и инактивированной), одна из которых вводится свиноматкам интранозально. Введение вакцины таким способом связано с
определенными трудностями, возникающими при фиксации глубоко супоросных свиноматок, использование дорогостоящих и дефицитных компонентов для получения вакцины
и определенная потенциальная опасность реверсии аттенуированных вирусов и их рассеивания в окружающей среде.
Предлагаемый способ приготовления ассоциированной вакцины против трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной болезни поросят, включающий заражение культуры
клеток вирусами, культивирование и сбор вируссодержащего материала, введение наполнителя, отличающийся тем, что заражение культуры клеток проводят вирусом трансмиссивного гастроэнтерита "КМИЭВ-10" с титром 6,5 lg ТЦД50/мл и ротавирусом свиней
"КМИЭВ-11" с титром 7,5 lg ТЦД50/мл, в качестве культуры клеток используют перевиваемую культуру клеток СПЭВ.
С целью определения оптимальной дозы вирусов для заражения культуры клеток
(множественности заражения) провели опыт. В матрасы с культурой клеток вносили вирус трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирус свиней с множественностью заражения
0,2; 0,3; 0,4; 0,5 тканевых цитопатогенных доз вируса (ТЦД50) на клетку.
Использовали по 3 матраса на каждую дозу заражения вируса трансмиссивного гастроэнтерита и ротавируса свиней (множественность заражения), выраженную в ТЦД50/мл.
Всего использовали 28 матрасов с культурой клеток, в т.ч. 4 контрольных (не зараженных
вирусами). Через 24, 48, 72, 96 часов по 1 матрасу снимали с инкубирования, трехкратно
замораживали и оттаивали, отбирали пробы культуральной вируссодержащей жидкости и
титровали их на культуре клеток СПЭВ. Результаты титрования вирусов приведены в
табл. 1.
2
BY 5081 C1
Таблица 1
Влияние множественности заражения вируса трансмиссивного гастроэнтерита и
ротавируса свиней на их накопление в культуре клеток
Множественность
Инфекционный титр вируса (lg ТЦД50/см3 через, часы)
заражения, ТЦД50
24
48
72
96
на клетку
Вирус трансмиссивного гастроэнтерита свиней
0,2
3,0 ± 0,05
4,85 ± 0,13
5,75 ± 0,13
6,25 ± 0,04
0,3
3,72 ± 0,90
5,91 ± 0,11
6,35 ± 0,08
6,1 ± 0,21
0,4
3,75 ± 0,02
6,0 ± 0,07
6,5 ± 0,05
6,12 ± 0,29
0,5
3,25 ± 0,04
5,25 ± 0,16
5,94 ± 0,03
5,75 ± 0,09
Ротавирус свиней
0,2
2,98 ± 0,04
5,67 ± 0,15
6,5 ± 0,19
0,3
3,1 5 ± 0,06
7, 12 ± 0,25
7,1 ± 0,13
0,4
3,2 ± 0,03
7,2 ± 0,29
7,01 ± 0,21
0,5
3,5 ± 0,12
7,1 ± 0,19
7,05 ± 0,17
Из табл. 1 видно, что при множественности заражения 0,3-0,4 ТЦД50 вируса трансмиссивного гастроэнтерита и ротавируса на клетку инфекционная активность вируса трансмиссивного гастроэнтерита достигала максимального значения через 72 часа после заражения и составляла 6,35 ± 0,08 - 6,5 ± 0,05 lg ТЦД50/см3, ротавируса - через 48 часов после
заражения и составляла 7,12 ± 0,25 - 7,2 ± 0,29 lg ТЦД50/см3. При множественности заражения вирусов 0,2 и 0,5 ТЦД50 титр вируса трансмиссивного гастроэнтерита в эти сроки составлял соответственно 5,75 ± 0,13 и 5,94 ± 0,03, ротавируса 5,67 ± 0,15 и 7,1 ± 0,19 lg
ТЦД50/СМ3.
Таким образом, оптимальной дозой заражения культуры клеток СПЭВ вирусом
трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусом свиней является множественность заражения 0,3-0,4 ТЦД50 вирусов на клетку. Уменьшение множественности заражения вирусов
на клетку приводит к снижению их накопления в культуре клеток. Повышение дозы вирусов до 0,5 ТЦД50 на клетку существенно не влияло на их накопление.
Матрасы с культурой клеток СПЭВ, инфицированной ротавирусом, снимают в заморозку на 2-ой день после заражения, вирусом трансмиссивного гастроэнтерита - через 3-ое
суток после заражения при наличии выраженного цитопатогенного действия вирусов.
Матрасы с инфицированной культурой клеток трехкратно замораживают и оттаивают, полученную культуральную вируссодержащую жидкость сливают в 1,5-литровые матрасы.
Для определения инфекционной активности вирусов отбирают пробы культуральной
жидкости для титрования на культуре клеток СПЭВ. В культуральную жидкость, содержащую вирус трансмиссивного гастроэнтерита, вносят 0,1 % формалина по объему, содержащую ротавирус - 0,3 % формалина. Культуральную вируссодержащую жидкость
выдерживают при 37 °С в течение 24 часов. По окончании этого срока отбирают образцы
(по 5 мл) инактивированных вирусов на стерильность и полноту инактивации. Для определения стерильности образцы культуральной вируссодержащей жидкости высевают в
пробирки с питательными средами: МПА, МПБ, среда Китт-Тароцци и среда Сабуро (по 4
пробирки). В течение 10 дней просматривают среды на присутствие микроорганизмов и
грибов.
Контроль полноты инактивации вирусов формалином проводят путем внесения в пробирки с культуры клеток СПЭВ инактивированных вирусов (по 0,2 мл на пробирку). Материалы каждой культуральной вируссодержащей суспензии заражают не менее 4-х пробирок с культурой клеток. Зараженную культуру клеток инкубируют в термостате при
37 °С и ежедневно в течение 4-х суток учитывают результаты. При полной инактивации
вирусов отсутствует их цитопатогенное действие в первом и последующих 1-2-х пассажей
материала.
3
BY 5081 C1
В случае обнаружения цитапатического действия вируса трансмиссивного гастроэнтерита или ротавирусной болезни во втором или третьем пассажах материала, матрас, из которого была взята проба, отправляют на повторную инактивацию. Для этого в вируссодержащую суспензию вносят формалин, как описано выше, и инкубируют при 37 °С в
течение 12-24 часов при периодическом помешивании.
В следующем опыте определяли оптимальное соотношение вирусных компонентов
вакцины и наполнителя. Опыт проводили на 5 свиноматках крупной белой породы в возрасте 2-3 лет. Схема опыта изложена в табл. 2.
Результаты опыта учитывали по титрам антител к вирусу ТГС и ротавирусу при их
различных соотношениях в вакцине.
Таблица 2
Компоненты вакцины
№
Инактивированный вирус Инактивированный ротавирус Адъювант эмульсип/п
ТГС, %
свиней, %
ген, %
Опыт
1.
45
45
10
2.
60
30
10
3.
56,7
28,3
15
4.
53,4
26,6
20
Контроль
40 % (минеральное
5.
40
20
масло)
Готовили 5 образцов вакцины: № 1 (соотношение вирусных компонентов в вакцине
1:1, 10 % адъюванта эмульсигена), № № 2, 3, 4, 5 (соотношение вируса ТГС и ротавируса
2:1, 10, 15 и 20 % эмульсигена). В 5-ом варианте вакцины соотношение вирусных компонентов составляло 2:1, в качестве адъюванта использовали 40 % минерального масла. Все
5 образцов вакцины вводили животным внутримышечно двукратно: 1-ый раз за 6 недель
до опороса в объеме 6,0 мл, через 3 недели после 1-ой инъекции - 7,0 мл, через 21 день после второго введения вакцины у свиноматок брали пробы крови, сыворотки крови исследовали в РНГА на антитела к вирусу ТГС и в РТГА - на антитела к ротавирусу свиней.
Оптимальным считали тот вариант вакцины, после введения которой у животных отмечали накопление максимальных титров антител к вирусам. По величине титров судим об антигенной активности вакцины.
Результаты исследования приведены в табл. 3.
Таблица 3
Определение оптимального соотношения компонентов вакцины
Компоненты вакцины, %
Титры антител (лог2) к
№
ИнактивированИнактивированАдъювант
п/п
ный ротавирус
вирусу ТГС
ротавирусу
ный вирус ТГС
эмульсиген
свиней
Опыт
1.
45
45
10
4,3 ± 0,3
7,1 ± 0,42
2.
60
30
10
7,5 ± 0,14
8,6 ± 0,19
3.
56,7
28,3
15
9,8 ± 0,14
10,6 ± 0,15
53,4
26,6
20
Р < 0,001
Р< 0,001
4.
10,0 ± 0,48
10,8 ± 0,17
Контроль
40 %
5.
40
20
(минеральное
6,5 ± 0,17
7,3 ± 0,60
масло)
4
BY 5081 C1
Из табл. 3 видно, что соотношение вирусных в вакцине вируса ТГС и ротавируса 2:1
является оптимальным. Титр антител к вирусу ТГС составил 9,8 ± 0,14, ротавирусу 10,6 ± 0,15 при концентрации адъюванта эмульсигена 15 %. Повышение в вакцине концентрации адъюванта до 20 % приводит к некоторому повышению титра антител, однако
практически он не отличался от уровня антител в варианте вакцины, где его концентрация
составляла 15 %. При соотношении вируса ТГС и ротавируса 1:1 отмечен невысокий уровень антител к вирусу ТГС (4,3 ± 0,30) по сравнению с вариантами вакцины, где соотношение вирусов составляло 2:1.
После введения свиноматкам известной вакцины, где в качестве адъюванта использовали минеральное масло, титр антител к вирусу ТГС на 21-ый день после 2-ой вакцинации
составлял 6,5 ± 0,17, к ротавирусу - 7,3 ± 0,60.
Полученные данные дают основание утверждать, что оптимальным соотношением вируса ТГС и ротавируса в заявленной вакцине является соотношение вируса ТГС и ротавируса 2:1, соотношение вирусных компонентов и наполнителя - 85 и 15 % соответственно.
Проведенные исследования свидетельствуют о том, что ассоциированная вакцина против
трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной болезни поросят обладает выраженной
антигенной активностью. Компоненты вакцины не дефицитны и сравнительно не дорогие.
Культуру клеток СПЭВ выращивают на питательной среде - 5 %-ном гемогидролизате,
который в 4 раза дешевле питательной среды для культуры клеток № 199.
Полученные культуральные, содержащие вирус трансмиссивного гастроэнтерита и
ротавирус свиней, суспензии объединяют в соотношении 2:1 соответственно. Полученную
вирусную суспензию сливают в стерильную бутыль емкостью 5-10 л, вносят адъювант
эмульсиген в концентрации 15 % к объему вирусной суспензии, тщательно перемешивают. Определяют рН и при необходимости доводят его до цифры 7,2-7,4 с помощью 1Н
NaOH. После проверки на стерильность вакцину фасуют в стерильные флаконы объемом
200,0 или 400,0 см3, укупоривают стерильными резиновыми пробками, закатывают алюминиевыми колпачками. На каждый флакон наклеивают этикетку.
Колостральные антитела к вирусу ТГС и ротавирусу свиней, получаемые поросятами
с молозивом привитых вакциной свиноматок, защищают их от трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной болезни.
В 1996 г. вакцина прошла производственное испытание в 5 свиноводческих хозяйствах, неблагополучных по вирусным гастроэнтеритам поросят. В производственном опыте
вакцина защищала 92,3 % поросят от заболевания трансмиссивным гастроэнтеритом и ротавирусной болезнью.
Источники информации:
1. Инактивированная эмульгированная культуральная вакцина против трансмиссивного гастроэнтерита свиней. ТУ 08064-19-42-95. - Владимир, 1995. - С. 19.
2. Алипер Т.И. Экспериментальная вакцина против трансмиссивного гастроэнтерита и
ротавирусной болезни свиней (ТР-1): оценка эффективности и оптимизация условий применения / Автореф. дисс. на соискание ученой степени кандидат ветнаук. - М., 1989. С. 1-24.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
138 Кб
Теги
патент, by5081
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа