close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY5289

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
BY (11) 5289
(13) C1
(19)
7
(51) C 12Q 1/14,
(12)
C 12N 1/20
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ STAPHYLOCOCCUS AUREUS
(21) Номер заявки: a 19980228
(22) 1998.03.10
(46) 2003.06.30
(71) Заявитель: Государственное высшее
учебное заведение "Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет"
(BY)
(72) Авторы: Генералов Игорь Иванович;
Генералова Анжелика Геннадьевна;
Занько Сергей Николаевич (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
высшее учебное заведение "Витебский
государственный ордена Дружбы народов медицинский университет" (BY)
(57)
Способ идентификации Staphylococcus aureus, включающий посев исследуемого материала на желточно-солевой агар с последующей микроскопией и оценкой пигментообразования, определение каталазы, плазмокоагулазы и лецитиназы, отличающийся тем, что
дополнительно проводят определение термонуклеазы при рН 8,0-9,0 и температуре 37 °C
по методу предупреждения образования риванолового сгустка, и при наличии положительного теста на плазмокоагулазу или лецитиназу и положительного теста на термонуклеазу относят выделенный стафилококк к виду Staphylococcus aureus.
BY 5289 C1
(56)
Приказ МЗ СССР № 535. Об унификации микробиологических (бактериологических)
методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебнопрофилактических учреждений. Москва, 1985, с. 45-56.
SU 1611933 A1, 1990.
SU 1258828 A1, 1986.
SU 1442542 A1, 1988.
SU 1648977 A1, 1991.
Изобретение относится к микробиологии и медицине и может быть использовано для
идентификации золотистого стафилококка.
В настоящее время в клинико-бактериологических лабораториях среднего звена идентификацию и дифференциацию стафилококков обычно проводят согласно указаниям 535
приказа МЗ СССР от 22.04.85 г. [3]. Данный способ включает следующие методы идентификации S.aureus: посев исследуемого материала на желточно-солевой агар с последующей микроскопией и оценкой пигментообразования, определение каталазы, плазмокоагулазы, лецитиназы, ДНКазы, разложение маннита в анаэробных условиях. Все это требует
значительного расхода реагентов, время выдачи окончательного ответа растягивается на
4-5 дней.
BY 5289 C1
Многие исследователи пытались упростить схему идентификации стафилококков [1].
Тем не менее очевидно, что не существует единственного фенотипического критерия, по
которому можно было бы высокодостоверно идентифицировать золотистый стафилококк.
Для близкой к полной идентификации авторами предлагаются различные сочетания факторов (не менее 2-х) - нуклеаза и плазмокоагулаза, нуклеаза и лецитиназа, плазмокоагулаза и протеин А, плазмокоагулаза и разложение маннита в анаэробных условиях и т.д. Эти
комбинации имеют приблизительно равные диагностические возможности, не достигающие, однако, 100 % [1].
В свою очередь, в бактериологических лабораториях крупных лечебно-профилактических учреждений все шире применяют системы автоматизированной идентификации
возбудителей (например АТВ-32 или API Staph). Последние тесты базируются на разложении многочисленных углеводов [4]. К сожалению, данная идентификация требует
больших материальных затрат, учитывая стоимость аппаратуры и расходуемых материалов (от 10 до 100 тыс. USD). Кроме того, и в этих методах вероятность идентификации
S.aureus колеблется в пределах 95-97 %.
Прототипом нашего способа является унифицированный метод идентификации золотистого стафилококка по способу, изложенному в 535 приказе МЗ СССР от 22.04.85 [3].
Он включает:
1) посев исследуемого материала на желточно-солевой агар с последующей микроскопией и оценкой пигментообразования,
2) определение плазмокоагулазы,
3) лецитиназы,
4) ДНКазы (как дополнительный тест),
5) разложение маннита в анаэробных условиях.
Предлагаемый нами новый способ идентификации S.aureus повышает достоверность
определения золотистого стафилококка и ускоряет идентификацию культур данного возбудителя. Это достигается при помощи новой комбинации тестов идентификации золотистого стафилококка с включением разработанного нами метода определения термонуклеазной активности стафилококков.
Сущность предложения заключается в посеве исследуемого материала на желточносолевой агар с последующей микроскопией и определением каталазы, термонуклеазы,
плазмокоагулазы и лецитиназы возбудителя в течение последующего дня исследования.
Определение термонуклеазы возбудителя достигается обнаруженной нами способностью
2-этокси-6,9-диаминоакридина лактата (риванола) образовывать сгусток с дезоксирибонуклеиновой кислотой обратно пропорционально ее деполимеризации под действием стафилококковой нуклеазы.
Примеры осуществления способа.
А. Общие положения.
Нами было изучено 168 штаммов золотистого и эпидермального стафилококка, исследованного в качестве штамма сравнения. Штаммы были получены из Витебского городского центра гигиены, эпидемиологии и санитарии и идентифицированы согласно Приказу № 535. Из 168 изученных культур 83 штамма принадлежали золотистому стафилококку
(49,4 %), 85 штаммов - эпидермальному стафилококку (50,6 %). Штаммы золотистого
стафилококка были в дальнейшем идентифицированы по предлагаемой нами методике.
Б. Этапы идентификации S.aureus.
Посев исследуемого материала на желточно-солевой агар, последущая микроскопия,
определение каталазы, плазмокоагулазы и лецитиназы возбудителя проводят согласно
приказу № 535.
Определение термонуклеазы осуществляют по разработанному нами способу. С этой
целью для приготовления суспензии микробов берут несколько колоний стафилококка и
2
BY 5289 C1
суспендируют в дистиллированной воде. К 0,2 мл приготовленной взвеси микроорганизмов добавляют 0,1 мл раствора ДНК (500-700 мкг/мл). Далее в смесь прибавляют 0,1 мл
0,02М трис-HCI буфера, рН 8,4-8,6, содержащего 0,005 раствор хлорида кальция и 0,001М
раствор хлорида магния. Смесь инкубируют в термостат при 37 °C в течение 4 ч. Затем на
поверхность проб наслаивают 20 мкл 0,5 % раствора риванола и встряхивают для получения сгустка. Контролем служит проба, содержащая вместо суспензии микробов 0,2 мл
дистиллированной воды. Полученные результаты по определению термонуклеазной активности оценивают в баллах: 0 - отсутствие активности - крупный, компактный сгусток;
1 - слабая активность - мелкий, рыхлый сгусток; 2 - высокая активность - хлопья, нити; 3 очень высокая активность - полный распад сгустка с образованием гомогенной взвеси.
С учетом роста на желточно-солевом агаре, результатов микроскопии и каталазного
теста критерием отнесения стафилококка к виду S.aureus является наличие не менее двух
положительных основных тестов из 3 (плазмокоагулаза, ТНКаза и лецитиназа), причем 1
из двух первых тестов должен быть обязательно положительным.
Эффективность способа.
Наш способ идентификации золотистого стафилококка обладает следующие преимуществами по сравнению с прототипом.
В унифицированном методе идентификации S.aureus тест на определение нуклеазы
стафилококка предлагается лишь в качестве дополнительного. Это связано с тем, что в
стандартном унифицированном способе используется метод выявления нуклеазы по
Джеффрису [2], который определяет общую (а не термостабильную) нуклеазу стафилококка. В свою очередь, многочисленными исследованиями показано, что коагулазонегативные стафилококки также продуцируют ДНКазу (частота колеблется от 0-47,3 % до 90100 %), хотя они проявляют ее в меньшей степени, приблизительно в 10 раз слабее, чем
S.aureus [1]. Продукции термостабильной ДНКазы у них не зарегистрировано. Отсюда в
приказе 535 рекомендуется в качестве основного теста при идентификации золотистого
стафилококка использовать тест на анаэробную ферментацию маннита (при противоположных или сомнительных результатах определения плазмокоагулазы и лецитиназы).
Этот тест занимает 4-5 суток и значительно удлиняет исследование.
Наш способ позволяет завершить полную идентификацию S.aureus в 2-3 дня, причем
он оценивает именно термостабильную ДНКазу золотистого стафилококка как наиболее
диагностически значимый критерий.
Кроме того, использование нашего метода позволяет увеличить достоверность определения золотистого стафилококка, в частности - при его дифференциации с эпидермальным стафилококком. При использовании многомерных статистических методов (дисперсионного и дискриминантного анализа) было выявлено, что суммарная сила влияния
используемых организованных факторов (термонуклеаза, плазмокоагулаза и лецитиназа)
на определение вида стафилококка составляет 95 %. Сила влияния межфакторного взаимодействия - 4,8 %. В результате сумма влияния организованных факторов оказалась
99,8 %. Поскольку полученный процент объясненной дисперсии стремится к 100 %, то
можно сказать, что в данной модели определение ТНКазы, плазмокоагулазы и лецитиназы
дифференцирует виды стафилококков с высшей степенью достоверности. Данные показатели превышают описанные ранее в литературе [1]. Дискриминантный анализ подтвердил
закономерности, полученные при проведении регрессионного и дисперсионного анализа.
При его осуществлении была выделена лишь одна дискриминантная функция, причем величина объясненной дисперсии составила 100 %, коэффициент канонической корреляции 0,97561 при р<0,0001.
Таким образом, использование нашего метода позволяет сократить время определения
S.aureus с 5-7 дней до 2-3 суток, а также повысить достоверность его идентификации.
3
BY 5289 C1
Источники информации:
1. Акатов А.К., Зуева А.С. Стафилококки. - М., 1983.
2. Никитин В.М. Справочник экспресс-методов биохимической индикации микробов. Кишинев, 1986. - С. 146-154.
3. Приказ № 535 от 22 апреля 1985. Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях
лечебно-профилактических учреждений. - М., 1985.
4. Biological information of identification software - ATB-32. - Lyon, 1995.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
120 Кб
Теги
патент, by5289
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа