close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY5292

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
BY (11) 5292
(13) C1
(19)
7
(51) G 01N 33/483, 33/52
(12)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ
НОВООБРАЗОВАНИЙ
(21) Номер заявки: a 19990699
(22) 1999.07.12
(46) 2003.06.30
(71) Заявитель: Институт молекулярной
и атомной физики НАН Беларуси
(BY)
(72) Авторы: Будников Ростислав Феликсович (UA); Бутра Виктор Александрович; Комар Веслав Павлович; Скорняков Иван Васильевич (BY)
(73) Патентообладатель: Институт молекулярной и атомной физики НАН Беларуси (BY)
(57)
Способ диагностики злокачественных новообразований, включающий регистрацию
спектральных характеристик образцов диагностируемой и контрольной ткани в ИК области спектра и их сравнение, отличающийся тем, что образцы для анализа получают путем
экстрагирования ткани растворителем жироподобных веществ, в частности четыреххлористым углеродом, регистрируют спектр экстракта в диапазоне длин волн 2,50-2,94 мкм,
определяют оптическую плотность в максимумах поглощения и положение максимумов в
диапазоне длин волн 2,66-2,74 мкм; 2,74-2,80 мкм; 2,80-2,86 мкм и 2,86-2,94 мкм, определяют отношения оптических плотностей в максимумах поглощения в диапазонах длин
волн 2,66-2,74 мкм, 2,74-2,80 мкм, 2,80-2,86 мкм к оптической плотности в максимуме поглощения в диапазоне 2,86-2,94 мкм и при смещении максимумов поглощения в заданных
диапазонах и увеличении отношений оптических плотностей в спектре образца диагностируемой ткани диагностируют злокачественное новообразование.
BY 5292 C1
(56)
US 5596992 A, 1997.
BY 970567 A, 1999.
Chem.Abstr., 1993, v. 118, № 13, 121972g.
RU 93046902 A, 1997.
BY 5292 C1
Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии, и может использоваться
для диагностики злокачественных новообразований, в частности рака.
С помощью существующих методов: визуального, пальпаторного, ультразвукового,
рентгенологического, а также ядерного магнитного резонанса и компьютерной томографии выявляется опухолевидное образование. Однако окончательное заключение о наличии или отсутствии злокачественного новообразования выносится на основании
гистологического и цитологического исследований материала из патологического очага.
Цитологический метод, заключающийся в микроскопическом исследовании препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином либо азур-эозиновыми красителями, в диагностике опухолей широко применяется в последние десятилетия. Этому в значительной
степени способствуют простота и доступность, дешевизна, возможности выявления злокачественных изменений на ранних, доклинических стадиях и получение ответа в течение
короткого (7-10 минут) времени. Однако успешный результат цитологического исследования возможен только при тщательном соблюдении методики получения и обработки
материала. Необходимым условием являются специальная подготовка и опыт врача, получающего материал, и высокая квалификация морфолога-цитолога, т.к. ни одна из морфологических особенностей, присущих клетке злокачественного образования, не является
специфической только для опухоли. Лишь совокупность признаков может позволить характеризовать клетки как злокачественные (Патологоанатомическая диагностика опухолей человека. Под редакцией Н.А. Краевского, А.В. Смельянникова, Д.С. Саркисова. М.,
"Медицина", 1993, с. 168).
Например, при диагностике рака щитовидной железы путем цитологического исследования визуально определяется ряд качественных параметров, включающих в себя: клеточный состав (наличие А и В-клеток, симпластов, макрофагов, лимфоидных и многоядерных
гигантских клеток), структуру цитоплазмы тироцитов (пенистая, широкая, базофильная),
характер клеточных агрегатов (размеры, скопление, фолликулярные и папиллярные расположения клеток), структуру ядер тироцитов (размеры, форма, контур, распределение хроматина, гиперхромность, расположение ядер и инвагинированных участков ядерной мембраны), что составляет совокупность качественных параметров по более чем 20 признакам
(Руководство по цитологической диагностике опухолей человека. Под редакцией А.С. Петровой, М.П. Птохова, М., "Медицина", 1976).
Известен также способ диагностики рака щитовидной железы по отличию частот
встречаемости определенных величин площадей ядер тироцитов (Авт. св. СССР 1063390,
А 61В 6/00, 1982). В этом способе определяется отношение частоты встречаемости величин площади ядер тироцитов, попадающих в интервал 85-145 мкм2, к частоте встречаемости ядер, попадающих по площади в интервал 25-85 мкм2. Если это отношение больше 1,
то судят о злокачественной опухоли щитовидной железы, а отношение, равное нулю, свидетельствует о норме.
Кроме того, известен способ диагностики аутоиммунного тиреоидита, осуществляемый путем приготовления мазков-отпечатков из щитовидной железы и определения количества фолликулярных и лимфоидных клеток (Авт. св. СССР 1364951, G 01N 1/28, 1985).
При этом в мазках дополнительно определяют количество пролиферирующих и непролиферирующих фолликулярных клеток. По уменьшению количества фолликулярных клеток
до 3-40 % и увеличению их размеров до 10-18 мкм, а также по увеличению отношения до
0,5-0,9 пролиферирующих фолликулярных клеток к непролиферирующим и увеличению
количества лимфоидных разной зрелости клеток до 5-30 % диагностируют аутоиммунный
тиреоидит.
Общими существенными недостатками перечисленных способов диагностики рака
является необходимость вторжения в область патологического очага, а также необходимость статистических выборок количественных данных по разным параметрам клеточной
структуры и ее составным частям, причем уменьшение количества анализируемых пара2
BY 5292 C1
метров приводит к сужению диагностируемых видов злокачественных опухолей. Недостатком является также необходимость построения гистограмм для определения частоты
встречаемости определенных параметров клеточных структур (например, площади ядер
тироцитов).
Известен также способ исследования и диагностики рака по инфракрасным спектрам
образцов тканей, взятых из патологического очага, при регулируемом высоком давлении
(P. Wong, Colleg. INSEPM, 1992, 224, 33-36 "High Pressure Biotechnol"; P. Wong, Recent
Trends High Pressure, Res. Proc. AIRART Int. Conf. High Pressure Sci. Technol., 13th, 1992,
893-898; P. Wong, B. Rigas, Can. Chem. News, 1991, 43, No. 10, 14-16). Способ основан на
различиях в инфракрасных спектрах злокачественных опухолей и контрольной (норма)
тканей, которые наблюдаются при различных давлениях на срез исследуемой ткани в кювете высокого давления. С помощью спектрофотометра регистрируются ИК спектры при
нормальном давлении и при повышении давления внутри кюветы вплоть до 27 килобар
(1 бар = 1,02 ат.). Наблюдаемые при повышении давления спектральные изменения в диапазоне 7,41-10,53 мкм (1350-950 см-1) позволили диагностировать рак шейки матки и печени. Данному способу присущ ряд недостатков. Для создания высокого давления в
кювете, его поддержания, управления и регулирования требуются специальные устройства, которым необходимы значительные энергетические затраты и квалифицированное обслуживание. Блок с образцами тканей, которые находятся под регулируемым высоким
давлением, необходимо поместить в кюветное отделение спектрофотометра. Для этого
такой блок должен иметь специальную конструкцию с соответствующими окнами, пропускающими инфракрасное излучение и выдерживающими высокое давление. При этом
блок должен быть достаточно герметичным и удобным для того, чтобы размещать в нем
образцы для исследования, не ухудшая герметичности. Без такого устройства диагноз рака
по известному способу не представляется возможным. Кроме того, необходимо еще приспособление, регулирующее высокое давление в блоке с образцами исследуемых тканей, а
размеры блока лимитируются кюветным отделением спектрофотометра и его оптической
системой. Поэтому блок высокого давления не может быть универсальным, а должен изготавливаться для конкретного типа спектрофотометра. Таким образом, известный способ
диагностики рака весьма сложен и требует уникальной аппаратуры. Помимо технических
трудностей данный способ позволяет диагностировать только некоторые виды онкологической патологии.
Наиболее близким к заявляемому является способ, включающий регистрацию спектральных характеристик образцов диагностируемой и контрольной ткани в ИК области
спектра и их сравнение, с последующим разделением и классификацией образцов клеток и
тканей на нормальные, гиперпластические и неопластические при обязательном использовании математических методов многомерного анализа (D.M. Haaland, H.D.T. Jones, E.V.
Thomas, United Stated Patent № 5596992, A 61B 6/00, 1997).
Спектральные, цитологические и гистологические исследования проводились на нормальных, гиперпластических и опухолевых лимфатических клетках и тканях, полученных
от собак. Препараты изготавливались из материала, взятого из патологического очага при
аспирации через тонкую иглу, или это были мазки-отпечатки удаленных лимфоузлов.
Приготавливались также препараты с нанесенными в один слой клетками (с использованием цитоспинового метода). Образцы помещались на прозрачные для ИК излучения окна
из BaF2 (для спектров пропускания) и на покрытые золотом предметные стекла (для спектров отражения). Цитологические препараты исследовались без дополнительной обработки или после окраски части из них красителями. Гистологические срезы толщиной до
1 мкм изготавливались из залитой в парафин ткани и помещались на окна и покрытие из
золота аналогичными способами. При этом одна часть образцов не подвергалась дополнительной обработке, другая фиксировалась в этаноле, третья часть из них фиксировалась и
окрашивалась гематоксилином и эозином. Патоморфолог разделял препараты на нор3
BY 5292 C1
мальные, с гиперплазией (легкой, умеренной и выраженной) и опухолевые. Получение
инфракрасных спектров осуществлялось на Фурье ИК спектрометре со встраиваемым в
него микроскопом-приставкой. Классификация клеток проведена по данным спектров, зарегистрированных в диапазонах 3,33-3,57 мкм (3000-2800 см-1) и 5,55-11,11 мкм (1800900 см-1). Ввиду незначительных, мало воспроизводимых различий между спектрами образцов, вне зависимости от способа их приготовления, для получения достоверных результатов разделения клеток на классы требовалось применение сложных математических
методов обработки спектров на основе многомерного статистического анализа. При этом
данный способ не дает прямого ответа о наличии или отсутствии онкологической патологии. Такое заключение может быть сделано лишь после исследования полученной по данному способу информации о клеточном составе проверяемой биологической ткани. Этот
подход аналогичен морфологическим исследованиям, когда по ряду качественных и количественных параметров клеток или тканей ставят диагноз онкологического заболевания.
Это существенный недостаток способа. Данный способ имеет также ряд других недостатков.
Диагностика онкологического заболевания осуществляется при обязательном вторжении в область опухоли, что может способствовать развитию ряда осложнений у пациента.
Классификация нормальных и ненормальных клеток и тканей сделана на основании
исследования только лишь ИК спектров лимфатических узлов собак, больных лимфомой.
Не сообщается о результатах классификации клеток и тканей по ИК спектрам для онкологических заболеваний других видов.
Для проведения диагностики по материалу из одного органа необходим ряд образцов,
приготовленных в виде мазков на окнах и зеркалах с золотым покрытием, в виде специально обработанных парафиновых срезов ткани, а также препаратов из материала пункции
с расположением клеток в один слой, для чего необходима специальная технология.
После регистрации спектров пропускания и отражения на сложной спектральной аппаратуре, оборудованной приставками для микроанализа, необходима обработка спектральных данных с применением математических методов частичных наименьших квадратов, регрессии основных компонентов, статистической линейной классификации и других подобных методов многомерного анализа с использованием расстояния Махаланобиса
в качестве критерия для классификации. Приготовление различных видов образцов для
анализа одного органа, регистрация спектров в широком диапазоне длин волн с последующей их математической обработкой значительно снижает скорость процесса диагностики рака.
Задачей настоящего изобретения является упрощение реализации способа, сокращение времени проведения диагностирования, расширение возможностей диагностики злокачественных опухолей различных органов и тканей на любой стадии заболевания.
Поставленная задача решена за счет того, что образцы для анализа получают путем
экстрагирования ткани растворителем жироподобных веществ, в частности четыреххлористым углеродом. Регистрируют спектр экстракта в диапазоне длин волн 2,50-2,94 мкм,
определяют оптическую плотность в максимумах поглощения и положение максимумов в
диапазоне длин волн 2,66-2,74 мкм; 2,74-2,80 мкм; 2,80-2,86 мкм и 2,86-2,94 мкм, определяют отношения оптических плотностей в максимумах поглощения в диапазоне длин волн
2,66-2,74 мкм, 2,74-2,80 мкм, 2,80-2,86 мкм к оптической плотности в максимуме поглощения в диапазоне 2,86-2,94 мкм. При смещении максимумов поглощения в заданных
диапазонах и увеличении отношений оптических плотностей образца диагностируемой
ткани диагностируют злокачественное новообразование.
Предлагаемый способ диагностики злокачественных новообразований состоит во взятии материала для диагностики как из патологического очага, так и (или) из окружающей
его ткани, в том числе и жировой, известными в медицине способами и помещении ее в
растворитель жироподобных веществ, в частности в четыреххлористый углерод. Затем
4
BY 5292 C1
полученный экстракт заправляют в спектрофотометрическую кювету с окнами, прозрачными в анализируемой области спектра, например из флюорита, и измеряют оптическую
плотность в максимумах поглощения и положения максимумов в диапазоне длин волн
2,50-2,94 мкм на любом серийном спектрофотометре или на упрощенном фильтровом
анализаторе.
На фигуре приведены спектры экстрактов тканей желудка, в четыреххлористом углероде, диагностируемых на заболевание раком и приготовленных из опухоли (кривая 1), из
жировой ткани большого сальника на расстоянии в 1 см (кривая 2) и 3 см (кривая 3) от
края опухоли, а также из контрольной (норма) жировой ткани (кривая 4). Спектр экстракта из контрольной (норма) ткани характеризуется тремя малоинтенсивными полосами поглощения с максимумами при волновых числах 3685, 3605, 3535 см-1 и интенсивной
полосой с максимумом 3460 см-1 (фигура, кривая 4). Отношения оптических плотностей в
максимумах поглощения в диапазонах длин волн 2,66-2,74 мкм (3760-3650 см-1); 2,742,80 мкм (3650-3570 см-1); 2,80-2,86 мкм (3570-3500 см-1) к оптической плотности в максимуме поглощения в диапазоне 2,86-2,94 мкм (3500-3440 см-1) характеризуются, соответственно, числовыми значениями в пределах 0,40-0,20; 0,30-0,15 и 0,25-0,03. Пределы
изменения величины отношения оптических плотностей определяются видом диагностируемой ткани органа. Для спектра экстракта из злокачественной опухоли характерна
очень сильная полоса поглощения с максимумом в спектральном интервале 2,66-2,74 мкм
(3760-3650 см-1) и три полосы слабой интенсивности с максимумами в спектральных интервалах 2,74-2,80 мкм (3650-3570 см-1); 2,80-2,86 мкм (3570-3500 см-1); 2,86-2,94 мкм
(3500-3440 см-1). При этом наблюдается сдвиг максимумов некоторых полос поглощения
от 5 до 15 см-1 в сторону возрастания волновых чисел (фигура, кривая 1). Смещение максимумов поглощения сопровождается увеличением отношений оптических плотностей в
спектре экстракта из опухолевой ткани по сравнению со спектром экстракта из непораженной ткани. Исследуя предложенным способом пробы, взятые из ткани, окружающей
патологический очаг, также определяют наличие онкологической патологии. По мере удаления от патологического очага интенсивность полосы в интервале 2,66-2,74 мкм уменьшается, а интенсивность полосы в интервале 2,86-2,94 мкм увеличивается. Полосы поглощения в интервалах 2,74-2,80 и 2,80-2,86 мкм меняются по интенсивности и могут
исчезать вовсе (фигура, кривые 2 и 3). Таким образом, спектры экстрактов тканей, взятых
вблизи от визуально определяемой границы опухоли, отличаются от спектров экстрактов
ткани в норме.
Установленная закономерность позволяет определить взаимно однозначное соответствие между наличием онкологической патологии и принятыми в спектроскопии характеристиками, такими как длина волны, волновое число, коэффициент пропускания или
поглощения, показатель поглощения, интенсивность излучения, оптическая плотность, а
также величинами отношений этих количественных характеристик.
Данный способ может быть применен для диагностики злокачественных образований
различных органов на любой стадии заболевания.
Пример 1.
Больная Ц., 67 лет. Клинический диагноз: рак молочной железы.
Спектры растворов экстрактов из опухоли и жировой ткани в четыреххлористом углероде регистрировали на ИК спектрометре "Perkin-Elmer 180". Из спектров в максимумах
поглощения образцом ИК излучения вычислены отношения оптических плотностей в
диапазонах длин волн 2,66-2,74 мкм; 2,74-2,80 мкм; 2,80-2,86 мкм к оптической плотности
в максимуме поглощения в диапазоне 2,86-2,94 мкм. Эти отношения соответственно равны 3,17; 1,73 и 1,25. Для раствора экстракта из жировой ткани, взятой на расстоянии около
10 см от опухоли, отношения оптических плотностей имеют значения 0,24; 0,15 и 0,035,
на расстоянии около 1 см - 0,95; 0,57 и 0,21. Экстракт жировой ткани молочной железы в
норме имеет величину отношений 0,24; 0,15 и 0,035. Значительное увеличение отношений
оптических плотностей, определенных из спектров экстрактов опухоли и жировой ткани,
5
BY 5292 C1
взятой в одном сантиметре от нее, характеризует раковое поражение молочной железы.
Спектр экстракта жировой ткани, взятой в 10 см от края опухоли, совпадает с контролем
(нормой).
Пример 2.
Больной Ч., 57 лет. Клинический диагноз: рак желудка.
На ИК спектрофотометре "Perkin-Elmer 180" регистрировали спектры растворов экстракта из ткани опухоли желудка и из жировой ткани около опухоли. Экстракт готовили в
четыреххлористом углероде. Измеренные значения отношения оптических плотностей
для максимумов поглощения в анализируемых спектральных диапазонах имеют значения
8,92; 2,21 и 1,11, что значительно превышает соответствующие значения для экстрактов из
контрольной (норма) ткани (0,39; 0,26 и 0,24). Диагноз по жировой ткани также свидетельствует о раке желудка, поскольку, соответственно, отношения оптических плотностей
имеют значения 1,39 и 0,60, третий максимум поглощения отсутствует. О наличии онкологического заболевания свидетельствует также сдвиг максимумов полос поглощения в
спектральных диапазонах 2,66-2,74 и 2,86-2,94 мкм.
Пример 3.
Больная Д., 30 лет. Клинический диагноз: меланома кожи.
Спектры экстрактов регистрировали на спектрофотометре "Perkin-Elmer 180". Экстракты жировой ткани под опухолью получали с помощью четыреххлористого углерода
или хлороформа. По полученным спектрам вычисляли отношения оптических плотностей
в максимумах поглощения упомянутых, спектральных диапазонах. Полученные величины
имеют значения 1,55; 0,79 и 0,29. На расстоянии около 3 см от опухоли отношения оптических плотностей имеют значения 1,28 и 0,64, полоса поглощения в интервале 2,802,86 мкм отсутствует. Спектральные характеристики указывают, что патологические изменения в диагностируемой ткани сохраняются на расстоянии в 3 см от границы опухоли
и по спектральным признакам можно диагностировать злокачественное новообразование.
Пример 4.
Больной В., 68 лет. Клинический диагноз: рак левой почки с метастазами в легкое.
На спектрофотометре "Perkin-Elmer 180" регистрировали спектр экстракта из материала метастатического узла в легком. В качестве растворителя использовали четыреххлористый углерод. Отношения оптических плотностей максимумов поглощения в
упомянутых спектральных диапазонах равны числам 5,26; 2,38 и 1,18 и превосходят аналогичные отношения, характеризующие норму в 13, 9 и 4 раза соответственно. При этом
наблюдается смещение максимумов полос поглощения в четырех диапазонах длин волн.
Следовательно, узел в легком является злокачественной опухолью.
Пример 5.
Больной Т., 72 года. Клинический диагноз: рак почки.
В качестве материала для диагностики взята жировая ткань вблизи опухоли. Экстракт
приготовляли в четыреххлористом углероде. Спектры регистрировали на спектрофотометрах "Perkin-Elmer 180" и "UR-20". Здесь также наблюдалось смещение максимумов
полос поглощения и увеличение отношений оптических плотностей по сравнению со
спектром экстракта из контрольной (норма) жировой ткани. В частности, отношение оптической плотности в максимуме поглощения в диапазоне 2,66-2,74 мкм к оптической
плотности максимума поглощения в диапазоне 2,86-2,94 мкм превысило норму более чем
в 6 раз. Таким образом, узел в почке, рядом с которым взята жировая ткань, является злокачественной опухолью.
Пример 6.
Больная К., 37 лет. Клинический диагноз: рак молочной железы.
Спектр экстракта в четыреххлористом углероде жировой ткани, взятой на границе
с опухолью, регистрировали на спектрофотометре "Perkin-Elmer 180" в области 2,502,94 мкм. Наблюдается смещение максимумов полос поглощения и увеличение отноше6
BY 5292 C1
ния оптических плотностей по сравнению со спектром здоровой ткани от 1,5 до 5,8 раза.
Следовательно, по полученным спектральным признакам можно диагностировать рак.
Все диагнозы, приведенные в примерах по предлагаемому способу, подтверждены
гистологическими исследованиями.
Предлагаемый способ по сравнению с прототипом обладает рядом преимуществ:
значительно упрощена процедура диагностики онкологического заболевания, поскольку предлагаемый способ является прямым методом диагностирования злокачественных новообразований и не требует дополнительного исследования клеточного состава
ткани и его классификации;
для проведения диагностики злокачественных новообразований не требуется сложная
математическая обработка данных с применением методов многомерного статистического
анализа;
найденные спектральные признаки диагностирования относятся к онкологическим заболеваниям человека;
диагностика злокачественных опухолей, наряду с использованием материала из патологического очага, может быть осуществлена по ткани (в том числе и жировой), взятой
вблизи опухоли;
для постановки диагноза не требуется специальных методик приготовления образцов,
достаточно небольшого количества жировой ткани, которое может быть взято любым известным в медицине способом;
исключается необходимость вторжения в область опухоли, что уменьшает вероятность связанных с этим осложнений;
открывается возможность применения для дифференциальной диагностики онкологической патологии любого серийного инфракрасного спектрофотометра или упрощенного
прибора типа инфракрасного фильтрового анализатора, причем аппаратура, предлагаемая
в прототипе, также подходит для реализации предлагаемого способа.
В результате упрощения способа диагностики злокачественных новообразований отпадает необходимость использования многих дорогостоящих реактивов для приготовления препаратов из ткани и специальных методик подготовки проб, что приводит к
снижению стоимости диагноза и значительному сокращению времени диагностирования и
расширению возможностей диагностики злокачественных новообразований.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
180 Кб
Теги
by5292, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа