close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY5336

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
BY (11) 5336
(13) C1
(19)
7
(51) A 61K 31/70, 33/14,
(12)
33/24, A 61P 7/06
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
ПРОТИВОАНЕМИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО, КОРРЕКТИРУЮЩЕЕ
ЖЕЛЕЗОДЕФИЦИТНЫЕ СОСТОЯНИЯ - СПЕЙСФЕРРОН
(21) Номер заявки: a 19980424
(22) 1998.04.29
(46) 2003.09.30
(71) Заявитель: Открытое акционерное
общество "Белмедпрепараты" (BY)
(72) Авторы: Гапанович Владимир Николаевич; Петров Петр Тимофеевич;
Иванов Евгений Петрович; Мельнова
Наталья Ивановна; Климович Ольга
Михайловна; Царенков Валерий Минович; Лапковский Михаил Павлович;
Забелло Татьяна Николаевна; Фридлянд Михаил Семенович (BY)
(73) Патентообладатель: Открытое акционерное общество "Белмедпрепараты"
(BY)
(57)
Противоанемическое средство, корректирующее железодефицитные состояния, включающее железо, кобальт и воду для инъекций, отличающееся тем, что дополнительно содержит декстран с молекулярной массой 17500 ± 2500 и натрия хлорид при следующем
соотношении компонентов, г/дл:
железо
кобальт
декстран
натрия хлорид
вода для инъекций
1,8-2,2
0,004-0,006
3,0-5,0
0,85-1,0
до 1 дл,
BY 5336 C1
при этом железо, кобальт и декстран содержит в виде металлодекстранового комплекса.
(56)
Машковский М.Д. Лекарственные средства, 1997. - Т. 2. - С. 160.
EP 0634174 A1, 1995.
US 4189474 A, 1980.
SU 1797196 A1, 1996.
RU 2098101 C1, 1997.
RU 2098102 C1, 1997.
RU 2079307 C1, 1997.
RU 2012334 C1, 1994.
BY 5336 C1
Изобретение относится к области медицины, а именно к лечебным препаратам, оказывающим стимулирующее влияние на эритропоэтическую функцию костного мозга, и может
быть использовано для коррекции железодефицитных анемий (ЖДА) различного генеза.
Известны железосодержащие препараты, используемые для лечения железодефицитных состояний, которые, в зависимости от способа введения в организм, подразделяются
на энтеральные и парентеральные [1, 2, 3].
К энтеральным относятся гемостимулин, ферроцирон, феррамид, феррокаль, ферроплекс, конферон и многие другие, представляющие собой сульфатные, хлористые и органические соединения железа. Их использование для коррекции ЖДА позволяет добиться
нормализации уровня гемоглобина в крови путем усиления эритропоэза. Однако для достижения лечебного эффекта энтеральные препараты железа требуется применять в течение нескольких месяцев при параллельном назначении фармакологических соединений,
улучшающих их всасывание. К недостаткам, связанным с применением этой группы лекарственных средств, относят также невозможность четкого учета абсорбированного в
кишечнике железа, в силу чего увеличивается вероятность его передозировки, возникновения диспепсических и других расстройств. Кроме того, их применение вообще становится невозможным при развитии ЖДА на фоне нарушения всасывания в 12-перстной
кишке и тонком кишечнике, ослаблении секреторной функции желудка [2].
К парентеральным железосодержащим препаратам относятся ферковен, феррум лек,
ферраль, фербитол, имферрон и другие, а также кровезамещающие растворы полифер и
рондферрин. Все они оказывают нормализующее влияние на восстановление нарушенных
при ЖДА показателей - гематокрита, уровня гемоглобина, количества эритроцитов, концентрации сывороточного железа и общей железосвязывающей способности сыворотки
крови примерно с равной степенью эффективности, превышающей таковую для энтеральных препаратов. Однако низкая устойчивость в организме, недостаточно сбалансированный состав и влияние на железозависимые биохимические процессы и в целом на организм при применении парентеральных железосодержащих средств могут приводить к
появлению негативных побочных эффектов - диспепсических расстройств, пирогенных и
токсических реакций, снижению числа лейкоцитов после окончания лечения [4-6].
Среди известных парентеральных железосодержащих препаратов наиболее близким к
заявляемому объекту является ферковен (прототип), предназначенный для внутривенных
инъекций и представляющий собой раствор углеводов, содержащий 2 % железа сахарата
и 0,009 % кобальта глюконата. Препарат обладает способностью оказывать гемо(эритро)стимулирующее действие в условиях ЖДА [1]. В настоящее время препарат снят с
производства из-за возможности оказания побочного токсического действия.
Задачей настоящего изобретения является создание противоанемического металлодекстранового средства на основе находящихся в ионизированной форме микроэлементов железа и кобальта, комплексносвязанных с низкомолекулярным радиационно-химически
модифицированным декстраном, обладающего сочетанной способностью оказывать выраженное эритропоэтическое гемостимулируюшее действие, улучшать белок-синтетические процессы, стимулировать образование интерферона.
Поставленная задача достигается тем, что противоанемическое средство включает железо, кобальт и воду для инъекций и отличается от прототипа тем, что дополнительно содержит декстран с молекуляроной массой 17500 ± 2500 и натрия хлорид при следующем
соотношении компонентов, г/дл:
железо
1,8-2,2
кобальт
0,004-0,006
декстран
3,0-5,0
натрия хлорид
0,85-1,0
вода для инъекций
до 1 дл,
при этом железо, кобальт и декстран содержит в виде металлодекстранового комплекса.
2
BY 5336 C1
Состав готовят следующим образом.
Пример 1.
100 мл модифицированного низкомолекулярного (ММ 15000-20000) декстрана, полученного радиационным, химическим или радиационно-химическим способом в присутствии расчетного количества раствора железа хлорида и водорода перекиси, нагревают до
температуры 50-70 °С, после чего доводят рН раствора до 7,5-9,0 задачей натрия гидроксида. Раствор подвергают осветляющей фильтрации, ультрафильтрации, добавляют
0,016-0,024 г кобальта хлорида, 0,9 г натрия хлорида, автоклавируют, фильтруют через
стерилизующий фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. Противоанемический металлодекстрановый препарат готов к применению.
Сопоставительный анализ с прототипом показывает, что заявляемый объект отличается химическим составом, т.е. заявляемое решение соответствует критерию "новизна". Оно
также соответствует критерию "изобретательский уровень", т.к. среди известных парентеральных препаратов отсутствуют вещества, обладающие сочетанной способностью оказывать выраженное эритропоэтическое гемостимулирующее действие, улучшать белоксинтетические процессы, стимулировать образование интерферона.
Биологическая активность заявляемого объекта иллюстрируется следующими примерами.
Пример 2.
В опытах на 10 кроликах породы Шиншилла обоего пола весом 2-3 кг изучали лечебный эффект противоанемического препарата спейсферрон на фоне хронической постгеморрагической анемии, которую моделировали многократными гемоэксфузиями по следующей схеме: ежедневно в течение трех суток у животных из системной циркуляции выключалось около 17 % от общего объема циркулирующей крови (ОЦК) с тем расчетом,
чтобы суммарный объем гемоэксфузии составил 50 % ОЦК. После воспроизведения у
кроликов хронической железодефицитной анемии животные были разделены на 2 серии.
В первой серии (контрольная) никакой коррекции постгеморрагического состояния не
проводилось. Кроликам второй серии (опытная) через 1 ч после окончания последнего,
третьего кровопускания начинали внутривенные инъекции спейсферрона. При этом заявляемое противоанемическое средство вводили в течение первых 4-х суток ежедневно, а
затем на 8-е и 11-е сутки от начала эксперимента в дозе, соответствующей среднесуточной
терапевтической (0,145 мл/кг).
О развитии хронической анемии и влиянии курсовой терапии препаратом спейсферрон судили по таким показателям периферической крови, как содержание гемоглобина,
количество эритроцитов, уровень гематокрита и количества ретикулоцитов, свидетельствующее о напряженности процессов гемопоэза в организме экспериментальных животных. Кроме этого отслеживались два параметра, непосредственно характеризующие
влияние экзогенного железа, содержащегося в заявляемом средстве, на устранение дефицита данного микроэлемента и, опосредованно, на интенсивность его включения в костномозговое кроветворение - концентрация сывороточного железа (СЖ) и общая железосвязывающая способность сыворотки (ОЖСС) [7]. Влияние спейсферрона на процессы
белкового обмена оценивалось по содержанию в плазме крови общего белка, альбумина и
продуктов лимитированного распада белков - средних молекул (СМ) [8-10].
Пробы крови у животных брали до начала эксперимента, на следующие сутки после
каждого кровопускания, а затем на 1, 4, 7, 11, 15 и 20-е сутки после окончания моделирования хронической постгеморрагической анемии.
Изменение регистрируемых показателей носило следующий характер (табл. 1, 2). В
норме, до начала кровопусканий, у исследуемых животных наблюдаемых серий содержание
гемоглобина варьировало от 121,2 + 4,93 г/л до 126,6 + 1,42 г/л, количество эритроцитов - от
3
BY 5336 C1
4,12 + 0,1271012/л до 4,19 + 0,085 1012/л, показатель гематокрита - от 37,9 + 1,37 л/л до
38,4 + 1,11 л/л, количество ретикулоцитов находилось в пределах от 4,30 + 0,213 % до
6,50 + 0,423 %, концентрация сывороточного железа составила 38,2 + 2,85 мкмоль/л и общая железосвязывающая способность - 74,5 + 5,48 мкмоль/л (по последним двум показателям данные между сериями обобщены).
Общая кровопотеря, проведенная дробными кровопусканиями, у животных обеих серий составила 50 % от ОЦК, вследствие чего происходило снижение исследуемых гематометрических показателей, что соответствовало возникновению состояния хронической
железодефицитной анемии, со свойственной для нее картиной красной крови. Так, содержание гемоглобина снизилось после 2-х кровопусканий на 21,8 % (Р<0,01) и 22,8 %
(Р<0,001) в контрольной серии, а также у животных, предназначенных для последующего
введения заявляемого противоанемического средства, соответственно. Через сутки после
завершения моделирования хронической постгеморрагической анемии уровень гемоглобина в крови кроликов 1-й серии еще больше понижался до 69,6 + 3,19 г/л (57,4 % к начальным значениям; Р<0,05), тогда как у кроликов опытной серии тенденция к уменьшению темпов данного показателя резко замедлялась (76,3 %, соответственно), являясь
следствием влияния первого введения препарата спейсферрон.
Приведенная выше динамика изменений содержания в крови гемоглобина была свойственна и другим параметрам, характеризующим функционирование эритрона, причем и
количество эритроцитов, и уровень гематокрита в контрольной серии (а также во второй
серии до начала введения заявляемого объекта) претерпевали схожие не только по своей
направленности, но и по интенсивности проявления сдвиги (табл. 1, 2). Характерно, что
изъятие в процессе гемоэксфузии половины ОЦК вызвало снижение концентрации сывороточного железа, уровень которого на высоте моделирования хронической анемии (через
сутки после третьего кровопускания) составил 59,7 % (Р<0,05) от первоначального, при
параллельно отмечаемой элевации ОЖСС (на 16,5 %; Р<0,05).
Внутривенное введение противоанемического препарата спейсферрон оказывало четко выраженное лечебное действие. Так, если через 1 сутки после окончания кровопускания количество эритроцитов в периферической крови у кроликов контрольной серии
составило 1,82 ± 0,094·1012/л или 44,2 % от исходного, то в аналогичный временной интервал в серии животных с инъекциями заявляемого противоанемического средства 2,59 ± 0,070·1012/л (61,8 %), соответственно.
Хроническая анемизация организма кроликов оказала угнетающее влияние на функционирование костномозгового кроветворения, вследствие чего через сутки после третьей
гемоэксфузии в периферической крови животных обеих серий количество незрелых форм
эритроцитов было в 2,7-3 раза меньше их изначального уровня.
Спустя 4 суток после моделирования состояния с общей постгеморрагической анемизацией организма, развившейся на фоне сочетанного дефицита как переносчиков кислорода, так и уровня эндогенного железа (при угнетении эритропоэза), в контрольной серии
кроликов намечалась тенденция к постепенному восстановлению регистрируемых показателей. К этому временному интервалу исследований содержание гемоглобина составило
уже 80,2 % от первоначального, а эритроцитов и гематокритного числа - 69,9 % и 69,4 %,
соответственно. Стимуляция естественных защитных сил проявилась в активации гемопоэза, о чем свидетельствовало увеличение на 67,4 % количества ретикулоцитов. В то же
время уровень сывороточного железа продолжал оставаться ниже (на 22,0 %) исходного.
4
BY 5336 C1
Таблица 1
Динамика изменений некоторых гематометрических показателей при коррекции
хронической постгеморрагической анемии у кроликов препаратом спейсферрон
Исследуемый показатель
Условия эксперимента
Гемоглобин,
Эритроциты,
РетикулоциГематокрит,
г/л
1012/л
ты, %
л/л
Хроническая постгеморрагическая анемия без лечения
Исходные данные
121,2 ± 4,93
4,12 ± 0,127
4,30 ± 0,213
37,9 ± 1,37
Через 1 сутки после
первого кровопускания
111,2 ± 5,16
3,94 ± 0,172
1,40 ± 0,245*
29,9 ± 1,51*
Через 1 сутки после
второго кровопускания
96,0 ± 2,76*
3,70 ± 0,130
0,00 ± 0,00*
23,3 ± 1,0*
Через 1 сутки после
третьего кровопускания
69,6 ± 3,19*
1,82 ± 0,094*
1,40 ± 0,245*
20,7 ± 0,97*
4-е сутки
97,2 ± 2,80*
2,88 ± 0,222*
7,20 ± 1,020*
26,3 ± 0,89*
7-е сутки
101,2 ± 3,01*
2,86 ± 0,112* 20,80 ± 1,855* 34,3 ± 1,17*
11-е сутки
124,0 ± 5,02
3,64 ± 0,136* 15,20 ± 1,497*
38,7 ± 1,35
15-е сутки
122,8 ± 5,08
4,00 ± 0,130
7,60 ± 0,748*
37,3 ± 0,97
Хроническая постгеморрагическая анемия, введение препарата спейсферрон
Исходные данные
126,6 + 1,42
4,19 + 0,085
6,50 + 0,423"
38,4 + 1,11
Через 1 сутки после
первого кровопускания
121,9 + 1,14*
3,91 + 0,109 4,38 + 0,324*'" 30,0 + 1,31*"
Через 1 сутки после
второго кровопускания
97,7 + 3,96*
3,69±0,094* 0,57 + 0,202*'" 23,1 + 1,10*
Через 1 сутки после
третьего кровопускания 96,6 + 2,32*7 2,59 + 0,070*' 2,43 + 0,297*'*' 20,4 + 0,73*
4-е сутки
124,0 + 1,05" 3,84 + 0,078*'" 17,29 + 0,360*'" 30,2 + 0,95*
7-е сутки
127,1 + 0,40**" 4,19 + 0,083 39,57 + 0,571*'" 35,1 + 1,34*
11-е сутки
125,3 + 0,18
4,34 + 0,081*' 24,29 + 1,169*'" 38,1 + 1,54
15-е сутки
128,7 + 3,09
4,24 + 0,020*"
6,86 + 0,400
36,6 + 1,57"
Примечание: * - достоверность различий по отношению к исходным данным при
уровне значимости Р<0,05;
** - достоверность различий по отношению к аналогичному сроку у животных контрольной серии (без лечения) при уровне значимости Р<0,05.
Во второй (опытная) серии животных к отслеживаемому периоду уже было произведено по 4 внутривенных введения спейсферрона. Следует особо подчеркнуть, что длительные
курсовые инъекции заявляемого противоанемического средства существенным образом ускорили процесс выхода кроликов из состояния постгеморрагической анемии. При этом отчетливо выявлялось благоприятное влияние на общий ход восстановления нарушенных
гематометрических показателей препарата на основе металлодекстранового комплекса.
Так, уже после 4 внутривенных инъекций спейсферрона уровень гемоглобина, количество эритроцитов и показатель гематокрита у кроликов составили 124,0 ± 1,05 г/л,
3,84 ± 0,078·1012/л и 30,2 ± 0,95 л/л, превышая аналогичные параметры у животных контрольной серии (в сопоставимый временной интервал) на 27,6 % (Р<0,05), 33,3 % (Р<0,05)
и 14,8 % (Р<0,05) соответственно. Особенно показательным в плане демонстрации преимуществ целевых гемостимулирующих свойств спейсферрона оказалось его воздействие
на выброс в периферическую кровь клеток - эритроидных предшественников. Их количество в 2,4 раза превышало цифровые значения соответствующего показателя в серии
сравнения.
5
BY 5336 C1
Таблица 2
Динамика изменений концентрации сывороточного железа и общей
железосвязывающей способности сыворотки крови при коррекции хронической
постгеморрагической анемии у кроликов препаратом спейсферрон
Исследуемый показатель
Условия эксперимента
Сывороточное железо,
Железосвязывающая способмкмоль/л
ность, мкмоль/л
Хроническая постгеморрагическая анемия без лечения
Исходные данные
38,2 ± 2,85
74,5 ± 5,48
Через 1 сутки после
первого кровопускания
34,8 ± 3,93
76,7 ± 5,09
Через 1 сутки после
второго кровопускания
28,8 ± 2,76*
84,4 ± 4,36
Через 1 сутки после
третьего кровопускания
22,8 ± 2,85*
86,8 ± 7,76
4-е сутки -"29,8 ± 3,44
93,5 ± 6,48*
7-е сутки -"34,8 ± 3,00
83,4 ± 14,74
11-е сутки -"38,4 ± 3,19
79,1 ± 6,80
15-е сутки -"43,5 ± 6,47
75,6 ± 6,33
Хроническая постгеморрагическая анемия, введение препарата спейсферрон
Исходные данные
38,2 ± 2,85
74,5 ± 5,48
Через 1 сутки после
первого кровопускания
34,8 ± 4,93
76,7 ± 5,09
Через 1 сутки после
второго кровопускания
28,8 ± 3,78
84,4 ± 4,36
Через 1 сутки после
третьего кровопускания
55,1 ± 8,10*,**
80,5 ± 7,61
4-е сутки -"41,3 ± 4,51
109,1 ± 15,19*
7-е сутки -"36,4 ± 7,18
129,4 ± 12,65*,**
11-е сутки -"42,9 ± 6,22
89,5 ± 6,90
15-е сутки -"44,3 ± 5,01
85,6 ± 7,86
Примечание: * - достоверность различий по отношению к исходным данным при
уровне значимости Р<0,05,
** - достоверность различий по отношению к аналогичному сроку у животных контрольной серии (без лечения) при уровне значимости Р<0,05.
К 4 суткам после моделирования хронической кровопотери уровень сывороточного
железа в крови животных с введением заявляемого противоанемического средства практически нормализовался при достаточно высокой резервной возможности сыворотки к
связыванию данного микроэлемента.
Пятикратное введение спейсферрона (временная точка эксперимента "7 сутки…")
приводило к полному восстановлению практически всех регистрируемых параметров периферической крови, в то время как у животных основной контрольной серии, не получавших никакого лечения, количество эритроцитов, уровень гемоглобина и показатель
гематокрита продолжали оставаться статистически достоверно ниже своих изначальных
значений. В этот временной интервал прослеживалось максимальное за весь период наблюдений содержание в периферической крови незрелых форм эритроцитов, причем во
всех сериях. Однако если у животных с самопроизвольным процессом восстановления
уровень ретикулоцитов превышал исходный на 383,7 % (Р<0,05), то ретикулоцитарный
криз после соответствующего количества инъекций спейсферрона характеризовался максимальной интенсивностью на 508,8 % (Р<0,05), демонстрируя выраженное эритростимулирующее действие заявляемого противоанемического лекарственного средства.
6
BY 5336 C1
Изменения концентрации сывороточного железа и общей железосвязывающей способности сыворотки (табл. 2) полностью соответствовали приведенным выше сдвигам
клеточного состава.
Начиная с 11 суток после моделирования постгеморрагической анемии уровень гемоглобина и показатель гематокрита в основной контрольной серии нормализовывались, а с
15 суток отмечалось восстановление и количества эритроцитов. Между тем, весь этот
промежуток времени (11-15 сутки) оставалось повышенным содержание незрелых клеток
эритроидного ряда, свидетельствуя тем самым о сохранности достаточной напряженности
процессов костномозгового кроветворения.
Таким образом, проведенное изучение гемопоэтической эффективности курсового
внутривенного введения на фоне постгеморрагической ЖДА металлодекстранового средства спейсферрон свидетельствует о его способности оказывать выраженное эритропоэтическое гемостимулирующее действие, значительно ускорять процесс восстановления
нарушенных показателей "красной" крови, что обеспечивается сбалансированным кумулятивным противоанемическим эффектом микроэлементной основы заявляемого объекта.
Анализ влияния заявляемого средства на процессы белкового обмена выявил следующее (табл. 3).
В контрольной серии динамика изменений показателей белкового обмена в ходе моделирования постгеморрагической анемии характеризовалась линейным снижением концентрации общего белка, альбумина и СМ в плазме крови, соответственно, до 92,4 %,
89,9 % и 78,2 % от исходного уровня на 3 сутки эксперимента. Нормализация регистрируемых показателей наступала лишь к 11 суткам.
Иная картина прослеживалась при анализе результатов, полученных в опытной серии,
в которой для коррекции постгеморрагической анемии применялось заявляемое средство спейсферрон. Судя по динамике восстановления содержания альбумина и общего белка в
плазме крови, спейсферрон не оказывал негативного действия на процессы белкового метаболизма. Более того, сроки нормализации отслеживаемых показателей протеинового
обмена имели тенденцию к опережению таковых по сравнению с результатами экспериментов в 1 серии, где анемия не подвергалась коррекции лекарственными средствами.
Так, уровень альбумина и общего белка достигал исходного уже на 4 сутки от начала терапии, составив, соответственно, 98,0 % и 98,6 %, и до окончания эксперимента сохранялся на уровне условной нормы.
Таблица 3
Изменение некоторых показателей белкового обмена при постгеморрагической
анемии и ее коррекции препаратом спейсферрон
Исследуемый показатель
Условия эксперимента
Общий белок, г/л
Альбумин, г/л
Средние молекулы, г/л
Хроническая постгеморрагическая анемия без лечения
Исходные данные
66,1 ± 1,31
44,5 ± 0,93
0,905 ± 0,048
Через 1 сутки после
третьего кровопускания
61,1 ± 3,39
40,0 ± 1,22*
0,708 ± 0,184
4-е сутки -"63,4 ± 3,88
41,6 ± 0,99
0,962 ± 0,041
11-е сутки -"65,5 ± 2,62
43,6 ± 1,03
1,063 ± 0,038
20-е сутки -"65,3 ± 2,91
44,9 ± 0,95
1,051 ± 0,076
Хроническая постгеморрагическая анемия, введение препарата спейсферрон
Исходные данные
66,1 ± 1,31
44,5 ± 0,93
0,905 ± 0,048
Через 1 сутки после
третьего кровопускания
59,8 ± 2,89*
41,5 ± 1,31
0,541 ± 0,048*
4-е сутки -"65,2 ± 3,22
43,6 ± 1,20
0,572 ± 0,054*,**
11-е сутки -"67,2 ± 3,29
44,1 ± 1,78
0,758 ± 0,043**
20-е сутки -"64,6 ± 2,88
43,4 ± 2,44
0,838 ± 0,109
7
BY 5336 C1
Примечание: * - достоверность различий по отношению к обобщенным исходным данным при уровне значимости Р<0,05;
** - достоверность различий по отношению к аналогичному сроку у животных контрольной серии (без лечения) при уровне значимости Р<0,05.
Особенно характерной и значимой в плане обсуждения влияния спейсферрона на белковый обмен представляется динамика изменений содержания в плазме крови экспериментальных животных СМ. Уже после однократного введения препарата (через 1 сутки после
окончания кровопусканий) уровень СМ снижался до 59,8 % от изначального, не превышая
его и в последующем.
Таким образом, совокупность представленных данных, характеризующих белковый
обмен при коррекции постгеморрагической анемии заявляемым препаратом, позволяет
сделать заключение о способности спейсферрона улучшать белок-синтетические процессы.
Пример 3.
Для более всестороннего исследования влияния заявляемого объекта на эритропоэтическую функцию костномозгового кроветворения, а также выяснения токсических свойств
препарата при его длительном введении в организм ставились дополнительные опыты на 11
интактных кроликах породы Шиншилла, которым в течение тридцати суток внутривенно
в среднесуточной терапевтической дозе вводили противоанемическое металлодекстрановое средство спейсферрон. Пробы крови для анализа брали до начала внутривенных инъекций, в период введений (после каждой 4, 10, 15, 25 и 30-й инъекции), затем на 15-е и 30-е
сутки после окончания курса.
О биологическом действии спейсферрона судили по показателям "красной" крови (гемоглобин, эритроциты, ретикулоциты, гематокрит), количеству лейкоцитов; оценивалось
общее состояние и поведенческие реакции животных.
Результаты выполненной работы сводятся к следующему (табл. 4).
В ходе эксперимента не было обнаружено каких-либо изменений в общем состоянии и
поведении в ответ на поступление в организм животных спейсферрона, причем как по ходу
курсового введения заявляемого объекта, так и на протяжении всего последующего периода.
Спустя две недели ежедневного поступления в организм спейсферрона соотношение
клеточных элементов и плазмы крови увеличивалось на 5,6 %, количество эритроцитов
возрастало на 3,0 %, а содержание гемоглобина - на 6,5 %, по сравнению с исходными
значениями соответствующих показателей. К моменту окончания курса инъекций в этой
исследуемой группе животных количество гемоглобина и гематокритное число еще более
возрастали. Характерно, что длительные инъекции заявляемого объекта оказались инертными в отношении влияния на содержание в периферической крови лейкоцитов.
Изменение содержания ретикулоцитов в течение всего периода внутривенных введений выявило наличие стимулирующего эффекта спейсферрона. Причем наибольший выброс в общую циркуляцию молодых форм эритроцитов наблюдался на 11-е сутки от
начала эксперимента, составив 498,0 % по отношению к изначальному уровню.
Таким образом, входящие в состав заявляемого противоанемического средства спейсферрон железо и кобальт не вызывают какого-либо токсического воздействия на клеточный состав крови, способствуя стимуляции костномозгового кроветворения.
Пример 4.
Для исключения возможного опосредованного влияния (при парентеральном введении
животным) заявляемого средства на гемопоэз проведено изучение воздействия спейсферрона на пролиферацию костномозговых кроветворных предшественников человека в метилцеллюлозных культурах in vitro.
Костный мозг человека получали при процессинге трансплантата, забранного у здоровых аллогенных доноров. Образцы костного мозга подвергали седиментации на плотности
фиколл-пак ("Фармация", Швеция) для выделения мононуклеаров по общепринятой мето8
BY 5336 C1
дике [11]. Затем мононуклеары (ККМ) отмывали в среде ГМДМ ("ГИБКО", Англия) и ресуспензировали в 1МДМ с 20 % эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС) и смесью пенициллина/стрептомицина.
Таблица 4
Динамика изменений некоторых гематометрических показателей при длительном
внутривенном введении кроликам препарата спейсферрон
Условия
эксперимента
Исследуемый показатель
Гемоглобин, Эритроциты, Ретикулоциты, Гематокрит,
г/л
1012/л
%
л/л
103,3 ± 3,47 4,64 ± 0,205
4,60 ± 0,221
35,7 ± 1,34
112,8 ± 2,29* 4,82 ± 0,090 8,09 ± 0,251*
37,1 ± 0,73
106,6 ± 1,53 4,52 ± 0,058 22,91 ± 0,653* 34,9 ± 0,45
110,0 ± 4,66 4,78 ± 0,176 18,81 ± 0,352* 37,7 ± 1,76
8,82 ± 0,286* 31,9 ± 0,40*
102,6 ± 10,31 5,48 ± 0,155* 5,46 ± 0,312* 42,3 ± 1,11*
Исходные данные
После 4 введений
После 10 введений
После 15 введений
После 25 введений
После 30 введений
Через 15 суток после
окончания курса
введений
112,9 ± 5,83 5,16 ± 0,259
Через 30 суток после
окончания курса
введений
123,3 ± 4,77* 5,49 ± 0,203*
Лейкоциты,
109/л
10,88 ± 0,557
9,70 ± 0,442
10,40 ± 0,516
10,42 ± 0,669
10,10 ± 1,037
3,64 ± 0,152*
39,9 ± 1,764* 11,84 ± 0,672
4,44 ± 0,176
41,1±1,920*
9,66 ± 0,806
Примечание: * - достоверность различий по отношению к исходным данным при уровне значимости Р<0,05.
Для постановки метилцеллюлозных культур кроветворных предшественников использовали стандартную метилцеллюлозную среду фирмы "ГИБКО" (Англия), содержащую
ЭТС. Мононуклеары костного мозга добавляли из расчета 50 тыс./мл (конечная концентрация), метилцеллюлозную среду с клетками тщательно перемешивали и раскапывали в лунки
24-луночных плат ("НУНК", Дания) по 0,5 мл на лунку. В соответствующие лунки вносили
рекомбинантные ростовые кроветворные факторы человека: интерлейкин-3 (ИЛ-3, 10 ед./мл),
гранулоцито-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ, 10 нг/мл) - оба
фирмы "Беринген Мангейм" (Австрия) и эритропоэтин (Эпо, 1 ед./мл) фирмы "Эмджен"
(США). Культуры инкубировали при 37 °С в атмосфере CO2 - 5 % в воздухе. Колониеобразующие единицы эритроцитов (КОЕэ) учитывали через 3 суток, а колониеобразующие единицы гранулоцито-макрофагального ряда (КОЕ-ГМ), всех предшественников (КО-Есм) и
бурстообразующие единицы эритропоэза (БОЕэ) - через 14 суток инкубации.
Полученные результаты (табл. 5) свидетельствовали о выраженном стимулирующем
воздействии заявляемого средства на пролиферацию поздних предшественников эритропоэза - КОЕэ и БОЕэ и об отсутствии его токсического или костимулирутощего влияния
на предшественники миелопоэза (КОЕ-ГМ) и общие предшественники (КОЕсм) 3 ростков
кроветворения - миелопоэза, эритропоэза, мегакариоцитопоэза.
Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что
спейсферрон обладает направленным стимулирующим эффектом на пролиферацию поздних предшественников эритропоэза и не оказывает токсического влияния на предшественников миелопоэза.
Пример 5.
Исследование интерферонстимулирующих свойств заявляемого объекта - спейсферрона проводили на перевиваемых культурах клеток мышиных фибробластов линии L929 и
лейкемии человека линии L41 после их предварительной инкубации с различными концентрациями препарата.
9
BY 5336 C1
Таблица 5
Исследование влияния различных разведений заявляемого противоанемического
средства спейсферрон на пролиферацию и дифференцировку интактных и
стимулированных кроветворных предшественников человека in vitro
№
Условие постановки
п/п эксперимента (состав культуры)
1 Интактные клетки костного
мозга (ККМ)
2 ККМ + ИЛ-3 + ГМ-КСФ + Эпо
3 ККМ + Эпо
4 ККМ + спейсферрон (1:8)
5 ККМ + спейсферрон (1:16)
6 ККМ + спейсферрон (1:32)
7 ККМ + спейсферрон (1:8) + Эпо
8 ККМ + спейсферрон (1:16) + Эпо
9 ККМ + спейсферрон (1:32) + Эпо
10 ККМ + спейсферрон (1:8) +
ИЛ-3 + ГМ-КСФ + Эпо
11 ККМ + спейсферрон (1:16) +
ИЛ-3 + ГМ-КСФ + Эпо
12 ККМ + спейсферрон (1:32) +
ИЛ-3 + ГМ-КСФ + Эпо
Количество кроветворных предшественников
КОЕЭ
БОЕЭ
КОЕ-ГМ
КОЕСМ
0
9,75 ± 0,922
9,00 ± 0,921
0
0
0
19,00 ± 0,739*
17,08 ± 0,866*
14,58 ± 0,609*
0
13,17 ± 0,928
0
0
0
0
0
0
0
0
0
30,33 ± 1,967 6,75 ± 0,789
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
20,33 ± 1,160* 24,50 ± 0,733* 27,92 ± 1,738 4,50 ± 0,793
18,00 ± 1,022* 22,92 ± 0,793* 30,17 ± 1,866 5,58 ± 0,793
16,67 ± 1,214* 21,50 ± 0,965* 30,75 ± 1,702 6,58 ± 1,041
Примечание: * - достоверность различий по отношению к ККМ, стимулированных соответствующим колониестимулирующим фактором или группой факторов при уровне
значимости Р<0,05.
Титрование интерферона осуществляли по степени подавления цитопатического действия вируса везикулярного стоматита (Институт вирусологии, Россия). В качестве контроля (эталонного индуктора образования интерферона) использовали комплекс полиинозиновой-полицитидиновой кислот (полиИ·полиУ; "Calbiochem", США) [12].
Полученные результаты представлены в табл. 6.
Как следует из полученных результатов, заявляемый объект обладал способностью
проявлять интерфероногенную активность в обеих используемых культурах клеток, причем степень ее выраженности позволяет отнести спейсферрон к высокоактивным индукторам интерферона.
Итак, в результате проведенных исследований биологической эффективности противоанемического металлодекстранового средства спейферрон сделаны следующие выводы:
препарат обладает выраженной способностью оказывать эритропоэтическое гемостимулирующее действие и улучшать белоксинтетические процессы в условиях постгеморрагической железодефицитной анемии;
заявляемое средство оказывает эритропоэтическое действие и в условиях введения на
фоне отсутствия дефицита железа, что связано со способностью препарата проявлять стимулирующее влияние по отношению к поздним кроветворным предшественникам эритропоэза;
спейсферрон является высокоактивным индуктором интерферона, что является преимуществом по сравнению с другими парентеральным противоанемическими препаратами, для которых данные свойства не показаны.
10
BY 5336 C1
Таблица 6
Изучение интерфероногенных свойств препарата спейсферрон
Линия клеток
КонценL929
L41
трация
Препарат
Титр
Титр
препарата,
мкг/мл индивидуаль- средний средний* индивидуаль- средний средний*
ный дозовый дозовый
ный дозовый дозовый
1000
320, 320
320
160, 160
160
500
320, 320
320
320, 320
320
250
20, 20
20
40, 40
40
Спейсферрон
220
140
100
10, 10
10
40, 40
40
50
10, 10
10
10, 10
10
25
10, 10
10
10, 10
10
25
10, 10
10
10, 10
10
ПолиИ·полиУ
10
10, 10
10
10
10, 10
10
10
5
10, 10
10
10, 10
10
Примечание: * - средний показатель для результатов в зоне положительного отклика.
Источники информации:
1. Машковский М.Д. Лекарственные средства, 1997. - Т. 2. - С. 160 (прототип).
2. Методические указания по организации клинических испытаний антианемических
железосодержащих препаратов. - М., 1982. - С. 18.
3. Лыс Т.И., Кеменова В.А., Алексеев К.В., Еременко Л.Л., Седов К.В. Противоанемические железосодержащие лекарственные препараты / Химико-фармацевтическое производство: Обзор, ин- форм. - М.: ВНИИСЭНТИ, 1991. Вып. 7. - С. 32.
4. ЕР 0634174 А1, 1995.
5. US 4189474 А, 1980.
6. SU 1797196 А1, 1996.
7. RU 2098101 С1, 1997.
8. RU 2098102 С1, 1997.
9. RU 2079307 С1, 1997.
10. RU 2012334C1, 1994.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
184 Кб
Теги
by5336, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа