close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY5490

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
BY (11) 5490
(13) C1
(19)
7
(51) G 01N 33/48
(12)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕТАБОЛИЗМА ЭТАНОЛА
В ГОЛОВНОМ МОЗГЕ ЖИВОТНЫХ
(21) Номер заявки: a 19990772
(22) 1999.08.05
(46) 2003.09.30
(71) Заявители: Государственное высшее
учебное учреждение "Гродненский
государственный медицинский университет"; Институт биохимии НАН
Беларуси (BY)
(72) Авторы: Лиопо Антон Валерьевич; Зиматкин Сергей Михайлович; Захаров
Олег Юрьевич (BY)
(73) Патентообладатели: Государственное
высшее учебное учреждение "Гродненский государственный медицинский университет"; Институт биохимии
НАН Беларуси (BY)
(57)
Способ определения метаболизма этанола в головном мозге животных, включающий
перфузию мозга, гомогенизацию его образца, преинкубацию, добавление этанола и газохроматографическое исследование, отличающийся тем, что после добавления этанола
пробу разделяют на две равные части, в одну из которых добавляют депротеинизирующий
раствор сразу, а в другую - после окончания инкубации, после чего определяют разницу
между уровнем этанола в этих частях, по которой судят о количестве метаболизированного этанола.
BY 5490 C1
(56)
Zimatkin S.M., Liopo A.V. et all, Alcoholism: Clinical and Experimental Research, 1998.
Vol. 22. - N8. - Р.1623-1627.
RU 2063035 C1, 1996.
Изобретение относится к области биохимии, а именно к аналитической биохимии, и
может использоваться для оценки интенсивности метаболизма этанола в головном мозге.
Наиболее близким к заявляемому является способ исследования метаболизма этанола
в гомогенатах головного мозга крыс по накоплению в них продукта метаболизма этанола
ацетальдегида (Zimatkin S.M., Liopo A.V., Deitrich R.A. Distribution and kinetics of ethanol
methabolism in rat brain. Alcoholism: Clinical and Experimental Research, 1998. Vol.22. - No.8. P. 1623-1627). Способ включает перфузию мозга, гомогенизацию его образцов, преинкубацию в течение 10 мин, инкубацию в присутствии этанола и газохроматографическое определение накапливающегося в ткани ацетальдегида.
Недостатками этого способа являются: 1) метаболизм этанола оценивается косвенно,
по накоплению в ткани его первого метаболита - ацетальдегида; 2) метаболизм этанола
оценивается приблизительно, поскольку большая часть образующегося в процессе метаболизма этанола ацетальдегида быстро окисляется в ткани мозга до ацетата, а также свя-
BY 5490 C1
зывается белками, фосфолипидами, биогенными аминами и другими химическими компонентами мозга.
Задача изобретения - повышение точности определения этанолметаболизирующей
способности ткани головного мозга.
Поставленная задача решается путем определения разницы между уровнем этанола в
гомогенате мозга, где метаболизм этанола подавлен химическим путем, и уровнем этанола
в другой половине того же гомогената, которая инкубируется без подавления метаболизма
этанола.
Способ осуществляют следующим образом. Животных (беспородных белых крыссамцов гетерогенной популяции, массой 180-220 г) под эфирным наркозом перфузируют
через сердце 300-400 мл охлажденного изотонического раствора NaCl с гепарином (1000
ед/л). Затем мозг быстро извлекают, промывают в этом же растворе и замораживают в
жидком азоте. Образцы мозга взвешивают и 10 % гомогенаты готовят на холоду в стеклянном стакане с тефлоновым пестиком, используя охлажденный 0,1 М калий фосфатный
буфер (рН = 7,4), содержащий).! % Тритон Х-100. Гомогенаты хранят при 4 °С и исследуют в тот же день. 1 мл гомогената помещают в герметичные стеклянные флаконы объемом 15 мл и преинкубируют 20 мин в присутствии 10 мМ глюкозы. После преинкубации,
не нарушая герметичности, в пробу добавляют 1-50 мМ этанол и разделяют пробу на две
равные части - в одну часть добавляют депротеинизирующий раствор (контрольная проба), а другую часть продолжают инкубировать как опытную пробу в течение 30 мин при
37 °C, после чего реакцию останавливают. Реакцию останавливают добавлением депротеинизирующего раствора, содержащего 1,6 М НСlО4, 0,4 % ЭДТА, 13 мМ тиомочевины и
3 мМ семикарбазида с 1 мМ 1-пропанолом, используемым в качестве внутреннего стандарта. Затем пробы выдерживают на холоду (4 °C) в течение 60 мин, после чего инкубируют при температуре 65 °C в течение 20 мин. Затем 2 мл парогазовой фазы вводят в
газовый хроматограф. Для определения количества метаболизированного тканью мозга
этанола высчитывают разницу между уровнем этанола в опытной и контрольной пробах.
Содержание белка в гомогенатах определяют по общепринятому методу Lowry et. al.
(1951), используя сывороточный альбумин быка как стандарт. Единица измерения количества метаболизируемого этанола: наномоль этанола/мг белка/ч.
Для иллюстрации полученных результатов приведены данные по метаболизму этанола
в мозге крысы при различных исходных концентрациях этанола в пробе (таблица).
Преимущества предлагаемого способа по сравнению с прототипом:
способ позволяет прямо, по убыли этанола в образце, оценивать интенсивность его
метаболизма в ткани мозга;
разделение каждой пробы после добавления этанола на две равные части позволяет
повысить точность способа и учесть возможное неферментативное исчезновение этанола
из образца.
Способ прост в осуществлении, достаточно надежен и хорошо воспроизводим. Может
быть использован в любой биохимической лаборатории, оснащенной газовым хроматографом.
2
BY 5490 C1
Показатели метаболизма этанола в гомогенатах мозга при инкубации проб в течение
30 мин при различных исходных концентрациях этанола в пробе
Исходная концентрация
этанола в пробе, мМ
1
2
3
5
10
50
Метаболизм этанола,
микромоль/образец
70
43
33
53
59
111
52
97
123
118
143
65
155
164
164
197
211
193
226
227
205
232
319
242
241
496
744
672
373
567
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
3
Метаболизм этанола,
наномоль/мг белка/30 мин
17
10
8
13
14
27
12
23
30
28
35
15
37
40
39
48
49
46
55
54
50
54
76
59
55
121
173
160
91
135
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
127 Кб
Теги
by5490, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа