close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY5602

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
BY (11) 5602
(13) C1
(19)
7
(51) C 12P 19/40//
(12)
(C 12P 19/40,
C 12R 1:19)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 2-ХЛОР-2'-ДЕЗОКСИАДЕНОЗИНА
(21) Номер заявки: a 19980838
(22) 1998.09.08
(46) 2003.12.30
(71) Заявители: Государственное научное
учреждение "Институт биоорганической химии Национальной академии
наук Беларуси"; Государственное научное учреждение "Институт микробиологии Национальной академии
наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Михайлопуло Игорь Александрович; Калиниченко Елена Николаевна; Зинченко Анатолий Иванович;
Барай Владимир Николаевич; Ерошевская Людмила Анатольевна (BY)
(73) Патентообладатели: Государственное
научное учреждение "Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси"; Государственное
научное учреждение "Институт микробиологии Национальной академии
наук Беларуси" (BY)
BY 5602 C1
(57)
1. Способ получения 2-хлор-2'-дезоксиаденозина путем ферментативного воздействия
на смесь 2-хлораденина и 2'-дезоксигуанозина в фосфатном буфере биокатализатора,
представляющего собой стабилизированные глутаровым альдегидом клетки бактерий, отличающийся тем, что процесс ведут при 63-67 °C, концентрации 2-хлораденина и 2'дезоксигуанозина в исходной реакционной смеси соответственно 40-80 мМ и 120-240 мМ
и концентрации биокатализатора 0,05-0,2 мас. %, и после окончания основного цикла
процесса проводят повторный цикл, используя отделенные от целевого продукта биокатализатор и не прореагировавшие субстраты.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве клеток бактерий используют,
предпочтительно, клетки Escherichia coli БМ-21 или Escherichia coli БМТ-1Д/1А.
3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что процесс ведут при рН 7,3-7,8.
(56)
MIKHAILOPULO I.A. at al. Nucleosides & Nucleotides, 1993. - V. 12. - P. 417-422.
WALTER A. BLANK at al. Biotechnology Letters. - 1992. - V. 14. - № 8. - P. 669.
SU 1705347 A1, 1992.
SU 1500675 A1, 1989.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к ферментативным способам
получения 2-хлор-2'-дезоксиаденозина (ХДА) - одного из самых эффективных препаратов,
применяющихся для терапии разнообразных лимфопролеферативных патологий [1, 2].
Кроме того, ХДА в настоящее время рассматривается в качестве перспективного средства
для лечения хронического рассеянного склероза [3].
BY 5602 C1
Таким образом, изобретение может быть использовано для получения активной субстанции при производстве соответствующих лекарственных препаратов.
Известен химический способ получения ХДА [4], который заключается в конденсации
2,6-дихлорпурина с 1-хлор-2-дезокси-3,5-ди-О-п-толуил-α-D-эритро-пентофуранозой с
последующим деблокированием полупродукта путем аммонолиза. Хроматография на силикагеле с последующей кристаллизацией из этанола позволяет получать целевой продукт
с выходом 41,9 мол. % в расчете на исходный 2,6-дихлорпурин.
Недостатками химического способа получения ХДА являются:
1. Применение в качестве донора 2'-дезоксирибозного фрагмента труднодоступного
модифицированного производного 2-дезоксирибозы.
2. Не технологичность стадии аммонолиза полупродукта, заключающейся в обработке
его при 100 °С жидким аммиаком в безводном метаноле в течение 5 час.
3. Сложность выделения ХДА из реакционной смеси из-за образующегося в результате реакции побочного неактивного стереоизомера.
4. Сравнительно низкий выход целевого продукта, что обусловлено недостаточной
специфичностью химического процесса гликозилирования исходного гетероцикла.
Известен способ получения ХДА [5], заключающийся в замене тимина в молекуле
2'-дезокситимидина на 2-хлораденин под действием фермента трансдезоксирибозилазы,
выделенной из клеток Lactobacillus leichmanii. Процесс ведут при 37 °С в течение 2-4 суток. Выход ХДА, изолированного из реакционной смеси путем ионообменной хроматографии, составляет 40 мол. % в расчете на исходный 2-хлораденин и 25 мол. % в расчете
на 2'-дезокситимидин. Данные по производительности реактора авторами не приведены.
Недостатками указанного способа являются:
1. Малая доступность и высокая стоимость очищенного фермента.
2. Длительность (2-4 суток) процесса трансгликозилирования 2-хлораденина.
3. Невысокий (40 мол. %) выход ХДА, что обусловлено низкой конверсией исходного
2-хлораденина используемым ферментом.
Известен также способ получения ХДА [6], предусматривающий инкубирование
2-хлораденозина (5 мМ) с 2'-дезоксиаденозином (30 мМ) в присутствии клеток Escherichia
coli ATCC-5275 в течение 5 час при 37 °С. Выход изолированного ХДА, согласно
указанному способу, составляет 56 мол. % в расчете на исходный донор 2-хлораденина и
9,3 мол. % в расчете на 2'-дезоксиаденозин.
Недостатками рассматриваемого способа являются:
1. Сравнительно невысокий выход целевого продукта, составляющий 56 мол. % в расчете на введенный в реакцию 2-хлораденозин и 9,3 мол. % в расчете на исходный 2' дезоксинуклеозид, что обусловлено низкой активностью используемого биокатализатора.
2. Малая доступность используемого 2-хлораденозина, получение которого требует
проведения сложного многоступенчатого синтеза.
3. Необходимость в обработке конечной реакционной смеси аденозиндезаминазой (из
селезенки крупного рогатого скота) для дезаминирования не прореагировавших аденозина
и 2'-дезоксиаденозина, затрудняющих выделение целевого продукта из смеси.
Известен способ получения ХДА [7], заключающийся в том, что 2-хлораденин химически трансформируют в 2-хлор-N6-диметиламинометилен-аденин, который затем ферментативно 2'-дезоксирибозилируют, используя 2'-дезоксиуридин в качестве донора
пентозы и клетки Е. coli SPT-, иммобилизованные в альгинатном геле, в качестве биокатализатора. После снятия диметиламинометиленовой защиты у полученного полупродукта
аммонолизом получают целевой продукт с выходом 50,3 мол. % в расчете на 2-хлораденин и 33,5 мол. % в расчете на исходный 2'-дезоксиуридин.
Недостатками указанного способа являются:
2
BY 5602 C1
1. Необходимость модификации 2-хлораденина для устранения его дезаминирования
биокатализатором в условиях реакции 2'-дезоксирибозилирования.
2. Низкий выход целевого продукта - 50,3 мол. % в расчете на исходный 2-хлораденин
и 33,5 мол. % в расчете на исходный 2'-дезоксиуридин.
3. Использование в качестве донора пентозы малодоступного 2'-дезоксиуридина, получение которого требует проведения процесса дезаминирования природного нуклеозида2'-дезоксицитидина.
4. Высокий расход биокатализатора, составляющий 2,2 мг сырых клеток/мг продукта.
5. Низкая производительность единицы объема реактора - 5,7 мг продукта/мл.
Из известных способов получения ХДА наиболее близким к предлагаемому способу
(прототипом) является способ получения ХДА [8], заключающийся в том, что 2-хлораденин в присутствии 2'-дезоксигуанозина и катализатора - клеток Е. coli БМТ-1Д/1А, стабилизированных глутаровым альдегидом, трансформируется в ХДА. Выход целевого продукта после выделения из реакционной смеси составляет 59 мол. % в расчете на исходный
2-хлораденин и 19,7 мол. % в расчете на исходный 2'-дезоксигуанозин.
Недостатками способа-прототипа являются:
1. Сравнительно низкий выход целевого продукта, составляющий 59 мол. % в расчете
на взятый в реакцию 2-хлораденин и 19,7 мол. % в расчете на исходный 2'-дезоксигуанозин. Это обусловлено низкой эффективностью стадии ферментативной трансформации
2-хлораденина в его 2'-дезоксирибозид, что, в свою очередь, объясняется сравнительно
низкой активностью клеток в случае данного варианта трансгликозилирования.
2. Высокий расход биокатализатора, составляющий 0,23 мг клеток/мг продукта, и низкая
производительность единицы объема реактора (0,85 мг продукта/мл), что ограничивает возможность применения рассматриваемого способа в условиях промышленного производства.
Главным недостатком всех известных ферментативных способов получения ХДА является сравнительно невысокий выход целевого продукта, что обусловлено обратимостью,
лежащей в основе процесса реакции трансгликозилирования, катализируемой пуриннуклеозидфосфорилазами.
В известных способах для повышения выхода ХДА (в расчете на наиболее дорогостоящий субстрат - 2-хлораденин) в реакционную смесь вносят избыточное (обычно
3-кратное) количество второго субстрата (нуклеозида - донора дезоксирибозного остатка),
что способствует сдвигу равновесия процесса в сторону образования целевого продукта.
(Использование более высоких соотношений концентраций донора и акцептора дезоксирибозы приводит к нерациональному расходованию 2'-дезоксинуклеозида).
Задачей предполагаемого изобретения является способ получения ХДА, обеспечивающий повышение выхода ХДА, повышение производительности реактора и сокращение
расхода биокатализатора.
Поставленная задача решается заявляемым способом получения ХДА IV, заключающимся в воздействии биокатализатора на основе стабилизированных глутаровым альдегидом
клеток бактерий, предпочтительно Escherichia coli на смесь 2-хлораденина II и 2'-дезоксигуанозина I в фосфатном буфере при 63-67 °С, причем концентрация 2-хлораденина II в
исходной смеси составляет 40-80 мМ, а 2'-дезоксигуанозина I-120-240 мМ. После окончания основного процесса синтеза ХДА IV, характеризующегося прекращением прироста
целевого продукта в реакционной смеси, биокатализатор и большую часть не прореагировавших субстратов отделяют от целевого продукта и используют для проведения повторного цикла процесса.
Целевой продукт выделяют из растворов, полученных после основного и повторного
циклов, известными приемами.
Заявляемый способ описывается следующим уравнением реакции:
3
BY 5602 C1
II
N
H 2N
N
HO
O
Cl
III
2
N
HN
O
HN
NH
N
N
H
O
N
HN
H 2N
N
NH
N
H
N
HN
N
N
Cl
Escherichia coli
HO
HO
2
N
O
HO
I
IV
В качестве биокатализатора используют стабилизированные глутаровым альдегидом
клетки бактерий, предпочтительно клетки Escherichia coli, в частности Escherichia coli
БМ-21 или Escherichia coli БМТ-1Д/1А.
Штамм Escherichia coli БМ-21 депонирован в Коллекции непатогенных микроорганизмов
Института микробиологии НАН Беларуси под коллекционным номером БИМ В-200 Д.
Предпочтительной является 0,05-0,2 %-ная концентрация биокатализатора.
Процесс ведут в фосфатном буфере (рН 7,3-7,8) в связи с тем, что фермент пуриннуклеозидфосфорилаза, под действием которой происходит замещение гуанина в молекуле
2'-дезоксигуанозина на 2-хлораденин с образованием ХДА, проявляет активность только в
присутствии фосфат-ионов.
В заявляемом способе поставленная задача решается путем проведения повторного
цикла (рециклинга) синтеза ХДА, используя отделенные от целевого продукта биокатализатор и не вступившие в реакцию субстраты, при обязательном соблюдении двух условий:
а) проведение процесса при 63-67 °С, т.е. при температуре, превышающей ранее считавшуюся оптимальной;
б) использование субстратов в реакционной смеси в концентрациях в несколько раз
(от 4 до 12) превышающих использовавшиеся ранее при сохранении обычного (3:1 в пользу донора дезоксирибозы) их молярного соотношения.
При этом подъем температуры выше оптимальной для проявления ферментом своей
активности, в принципе, должен был бы снизить выход продукта или увеличить продолжительность процесса, однако в реальных условиях синтеза ХДА, благодаря ощутимому
увеличению растворимости 2-хлораденина (или, другими словами, увеличению действующей концентрации его в растворе), значительно повышает эффективность работы
фермента и способствует сдвигу равновесия реакции в сторону синтеза целевого продукта.
Без внесения в реакционную смесь избыточных (по сравнению с использованными в
способах-аналогах) количеств субстратов не удается путем охлаждения эффективно осадить 2'-дезоксигуанозин и, таким образом, отделить его вместе с 2-хлораденином и биокатализатором от целевого продукта перед дополнительным циклом синтеза ХДА.
Таким образом, только сочетание указанных выше признаков способа приводит к решению поставленной задачи.
Нижеприведенные примеры конкретного осуществления иллюстрируют заявленный
способ, не ограничивая объема изобретения.
Пример 1.
Получения ХДА в оптимальных условиях проведения процесса.
Реакционную смесь (80 мл), содержащую 813,9 мг 2-хлораденина (4,8 ммоль), 3848 мг
2'-дезоксигуанозина (14,4 ммоль), 10 мМ К-фосфатный буфер (рН 7,5) и 80 мг (в расчете
на сухую массу) биокатализатора, инкубируют 5 час при 65 °С с перемешиванием. За приростом количества целевого продукта в смеси следят с помощью тонкослойной хроматографии.
После прекращения прироста ХДА в реакционной смеси ее выдерживают 16-18 час на
холоду. Выпавший осадок, содержащий не прореагировавшие субстраты и биокатализатор, собирают на стеклянном фильтре и промывают водой. Промывку объединяют с
фильтратом.
4
BY 5602 C1
Осадок с фильтра суспендируют в 30 мл 10 мМ К-фосфатного буфера (рН 7,5) и процесс синтеза ХДА повторяют снова, инкубируя полученную реакционную смесь при
65 °С. После остановки реакции кипячением (3 мин) реакционную смесь осветляют центрифугированием (5 мин, 10000 g). Осадок суспендируют в 10 мл воды и повторно центрифугируют в том же режиме. Обе надосадочные жидкости объединяют с фильтратом,
полученным при проведении основного процесса синтеза ХДА, и наносят на колонку
(2,6 × 10 см) со смолой Dowex 1 × 8 в ОН--форме. Смолу промывают 100 мл воды и ХДА
элюируют 70 %-ным этанолом. Фракции, содержащие ХДА, объединяют и упаривают на
роторном испарителе при 40-50 °С до сиропообразной массы. К остатку дважды прибавляют
по 20 мл этанола с последующим упариванием досуха. После перекристаллизации из
50 %-ного этанола и высушивания кристаллов в темноте при комнатной температуре получают 1234 мг хроматографически чистого ХДА, что составляет 90 мол. % в расчете на взятый
в реакцию 2-хлораденин и 30 мол. % в расчете на взятый в реакцию 2'-дезоксигуанозин.
При хроматографировании на тонкослойных пластинках "Silufol-UV254" фирмы "Serva"
(Германия) в системе растворителей бутанол: 25 %-ный водный аммиак (7:2; об/об) подвижность целевого продукта совпадала с Rf контрольного препарата ХДА.
Т. пл. целевого продукта 215-220 °С (с почернением).
УФ-спектр в 0,05 М К-фосфатном буфере (рН 7), λмакс нм (ε):265 (15200).
Элементный состав для ClC10H12N5O3; М = 285,70.
Вычислено, %: С 42,03; Н 4,24; N 24,52; С1 12,41.
Найдено, %: С 42,05; Н 4,25; N 24,48; С1 12,36.
Пример 2.
Условия примера соответствуют описанным в примере 1 за исключением того, что
процесс ведут при 63 °С и концентрациях 2-хлораденина и 2'-дезоксигуанозина в исходной реакционной смеси, равных 40 и 120 мМ, соответственно.
После выделения из реакционной смеси получают 1168 мг (85,2 мол. %) ХДА.
Пример 3.
Условия примера соответствуют описанным в примере 1 за исключением того, что
процесс ведут при 67 °С и концентрациях 2-хлораденина и 2'-дезоксигуанозина в исходной реакционной смеси, равных 80 и 240 мМ, соответственно.
После выделения из реакционной смеси получают 1191 мг (86,9 мол. %) ХДА.
Пример 4.
Получение ХДА при использовании биокатализатора на основе клеток различных
микроорганизмов.
Условия примера соответствуют описанным в примере 1 за исключением того, что в
качестве биокатализатора используют клетки различных штаммов микроорганизмов. Достигнутые выходы реакции синтеза ХДА (без выделения целевого продукта) представлены
в табл. 1.
Таблица 1
Сравнительная оценка эффективности наиболее активных штаммов микроорганизмов
Относительная
Штамм микроорганизмов
Выход ХДА, мол. %
эффективность, %
Escherichia coli БМ-21
97
100
Е. соli БМТ-1Д/1А
90
92
Е. coli W-3110
78
80
E.coliHB-101
61
63
Е. coli ЦМПМ В-2039
43
44
Е. coli ЦМПМ В-2035
28
29
Erwinia herbicola BKM-1216
65
67
Erw. herbicola ЦМПМ В-2927
29
30
5
BY 5602 C1
Пример 5.
Получение ХДА при использовании различных концентраций биокатализатора в реакционной смеси.
Условия примера соответствуют описанным в примере 1 за исключением того, что
процесс ведут при различных концентрациях биокатализатора в реакционной смеси. Достигнутые выходы целевого продукта представлены в табл. 2.
Таблица 2
Влияние концентрации биокатализатора в реакционной среде
на выход целевого продукта.
Концентрация биокатализатора
Продолжительность
Выход ХДА, мол. %
в реакционной среде, %
процесса, час
0,05
87
13
0,1
89
7
0,2
90
4
Из приведенных выше примеров следует, что положительный эффект достигается в
случае вариантов, характеризующихся сочетанием следующих параметров проведения
процесса: а) температура реакции - 63-67 °С; б) концентрация 2-хлораденина 40-80 мМ
(соответственно концентрация 2'-дезоксигуанозина 120-240 мМ); с) "рециклинг" (проведение процесса в две стадии).
Использование предлагаемого способа получения ХДА обеспечивает по сравнению с
известными решениями преимущество в виде увеличения выхода целевого продукта в
расчете на исходный 2-хлораденин с 59 до 85-90 мол. %, а также повышение производительности биореактора с 0,85 до 14,6-15,4 мг продукта/мл полезного объема и снижение
расхода биокатализатора с 0,23 до 0,05-0,09 мг/мг продукта.
Источники информации:
1. Пивник А.В., Кременецкая A.M., Яхнина Е.И., Романова М.И., Воробьев А.И. Первый опыт лечения зрелоклеточных лимфопролиферативных заболеваний аналогами пурина//Проблемы гематологии и переливания крови. - 1996. - № 2. - C. 55-62.
2. Saven A., Piro L.D. 2-Clorodeoxyadenosine: a potent antimetabolite with major activity in
the treatment of indolent lymphoproliferative disorders//Hematol. Cell Ther. - 1996. - V. 38. № 2. - P. 93-101.
3. Beutler E., Sipe J.C., Romine J.S., Koziol J.A., McMillan R., Zyroff J. The treatment of
chronic progressive multiple sclerosis with cladribine//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1996. V. 93. - № 4. - P. 1716-1720.
4. Kazimierczuk Z., Cottam H.B., Revankar G.R., Robins R.K. Synthesis of 2'-deoxyturbicidin, 2'-deoxyadenosine, and related 2'-deoxynucleosides via a novel direct stereospecific sodium salt glycosylation procedure//J. Am. Chem. Soc. - 1984. - V. 106. - № 21. - P. 6379-6382.
5. Huang M., Hatfield K., Roetker A.W., Montgomery J.A., Blakley R.L. Analogs of 2'deoxyadenosine: facile enzymatic preparation and growth inhibitoiy effects on human cell
lines//Biochem. Pharmacol. - 1981. - V. 30. - № 10. -P. 2663-2671.
6. Blank W.A., Elder K.J., Gati W.P., Paterson A., Pickard M.A., Wilson J.S. Synthesis of 2chloro-2'-deoxyadenosine by washed cells of E. coli//Biotechnol. Lett. - 1992. - V. 14. - № 8. P. 669-672.
7. Votruba I., Holy A., Dvorakova H., Gunter J., Hockova D., Hrebabecky H., Cihlar Т.,
Masojidkova M. Synthesis of 2-deoxy-β-D-ribonucleosides and 2,3-dideoxy-β-D-pentofuranosides on immobilized bacterial cells//Collect. Czech. Chem. Commun. - 1994. - V. 59. - № 10. P. 2303-2330.
6
BY 5602 C1
8. Mikhailopulo LA., Zinchenko A.I., Kazimierczuk Z., Barai V.N., Bokut S.B., Kalinichenko E.N. Synthesis of 2-chloro-2'-deoxyadenosine by microbiological transglycosylation//Nucleosides & Nucleotides. - 1993. - V. 12. - № (3&4). - P. 417-422.
9. Zinchenko A.I., Barai V.N., Bokut S.B., Kvasyuk E.I., Mikhailopulo LA. Synthesis of 9(β-D-arabinofuranosyl)guanine using whole cells of Escherichia coli//Appl. Microbiol. Biotechnol. - 1990. - V. 32. - № 3. - P. 658-661.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
193 Кб
Теги
by5602, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа