close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY5658

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
BY (11) 5658
(13) C1
(19)
7
(51) G 01N 33/50
(12)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИПИДНОГО СПЕКТРА
В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ
(21) Номер заявки: a 19980629
(22) 1998.07.09
(46) 2003.12.30
(71) Заявитель: Государственное учреждение "Научно-исследовательский
институт охраны материнства и
детства Министерства здравоохранения Республики Беларусь" (BY)
(72) Авторы: Данильчик Валентин Степанович; Шишко Георгий Александрович;
Шарихина Татьяна Валентиновна (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
учреждение "Научно-исследовательский
институт охраны материнства и детства
Министерства здравоохранения Республики Беларусь" (BY)
BY 5658 C1
(57)
Способ определения липидного спектра в биологическом материале методом тонкослойной хроматографии, включающий экстракцию липидов, нанесение липидного экстракта на
пластины с силикагелем, разделение его на фракции в смеси растворителей, идентификацию
липидных фракций и их количественное определение, отличающийся тем, что разделение
липидного экстракта осуществляют в три этапа, причем на первом этапе используют смесь
хлороформа, метанола и воды в соотношении 54,0:20,0:1,5, на втором - смесь петролейного
эфира, диэтилового эфира и ледяной уксусной кислоты в соотношении 90,0:20,0:1,0 и на
третьем - смесь петролейного эфира, диэтилового эфира и ледяной уксусной кислоты в соотношении 90,0:60,0:1,0, а количественное определение липидных фракций осуществляют путем сканирования пластин в отраженном свете на денситометре, по полученным результатам
определяют процентное содержание каждой фракции, принимая за 100 % сумму площадей
пиков всех фракций, рассчитанных по формуле
A = [(H 1 − H 0 ) × W ] × K 0 ,
Фиг. 1
BY 5658 C1
где H1 - расстояние от нулевой линии до вершины пика,
H0 - расстояние от нулевой линии до основания пика,
W - половина основания пика,
K0 - поправочный коэффициент, рассчитанный параллельным определением содержания
липидных фракций окрашиванием сульфофосфованилиновой и фосфомолибденовой кислотами,
затем унифицированным методом определяют суммарные липиды и рассчитывают
количество каждой фракции, учитывая ее процентное содержание.
(56)
Диагностика патологических состояний у новорожденных по данным дифференцированного исследования липидов пуповинной крови. - Мн., 1990. - С. 9-13.
RU 2062468 C1, 1996.
RU 2034849 C1, 1995.
EP 0652437 A1, 1995.
EP 0159564 A1, 1985.
EP 0159563 A1, 1985.
RU 2042952 C1, 1995.
Изобретение относится к медицине и биологии и может использоваться для диагностики и прогнозирования патологических состояний у людей и экспериментальных животных.
Задачей способа является идентификация и количественная оценка максимально
большого количества липидных фракций.
Способ осуществляется следующим образом. Берут в зависимости от вида от 30 до 60 мкл
биологического материала. Необходимое количество материала вносят в химическую
пробирку, в которую медленно вливают 3 мл смеси Фолча (хлороформ : метанол в соотношении 2 : 1). Образуется взвесь мелких частиц денатурированного белка белого цвета (в
случае плазмы) или бурых тяжей (в случае эритроцитов). Оставляют пробирку на 15 мин
при комнатной температуре, после чего доливают 1,5 мл дистиллированной воды и инкубируют в течение 10-12 ч в холодильнике. В верхней части (водно-метаноловой) содержатся нелипидные компоненты, в нижней (хлороформной) - липидный экстракт. Нижний
слой отсасывают и с помощью пипетки переносят в центрифужную пробирку. Объем экстракта доводят до 3 мл добавлением хлороформа, перемешивают, отбирают 0,5 мл для определения уровня общих липидов.
Далее липидный экстракт наносят на пластины с силикагелем. Предварительно пластины размечают в положении, в котором продольные полосы (царапины) на обратной
стороне перпендикулярны разделительному пути на слое силикагеля. Вдоль пластины наносят продольные линии через 2,0-2,5 см - границы между дорожками (пластину 15 × 15 см
можно разделить на 6 дорожек). Высота пластины для тонкослойной хроматографии равна 15,0 см. На пластине вдоль боковых краев счищают слой силикагеля в 2-3 мм с целью
уменьшения краевого эффекта. Затем простым мягким карандашом ставят вспомогательные метки.
Линию старта на всех пластинах отмечают одинаково. От основания пластины отступают 1,5 см и на этом уровне ставят две точки карандашом, расстояние между которыми
должно составлять 0,9-1,0 см - это места нанесения образца.
Пластины ставят для промывки в камеру, которую обкладывают полоской фильтровальной бумаги. Заполняют пластину смесью хлороформ : метанол : вода в соотношении
2,7 : 1,0 : 0,75 соответственно (54,0 : 20,0 : 1,5) и оставляют для насыщения парами рас-
2
BY 5658 C1
творителя на 40 мин. После промывки пластину ставят в сушильный шкаф и сушат при
100 °С в течение часа для активации.
На подготовленную пластину сразу же наносят липидный экстракт в виде узкой полоски (не шире 1 мм) в места линии старта, предварительно закрыв остальной слой силикагеля фольгой. Перед нанесением сухой экстракт липидов растворяют в 40 мкл смеси
хлороформ : метанол (3 : 1).
Затем пластину помещают в камеру, в которую заливают разделительную смесь хлороформ : метанол : вода в соотношении 2,7 : 1,0 : 0,75 соответственно, закрывают крышкой и оставляют в вытяжном шкафу при комнатной температуре на две минуты. После
этого пластину помещают во вторую камеру, внутри обложенную фильтровальной бумагой и содержащую разделительную смесь (петролейный эфир : диэтиловый эфир : ледяная
уксусная кислота в соотношении 90,0 : 20,0 : 1,0 соответственно), закрывают крышкой,
оставляют на 10 мин. Высушенную пластину помещают в третью камеру, обложенную внутри фильтровальной бумагой и содержащую смесь-растворитель петролейный
эфир : диэтиловый эфир : ледяная уксусная кислота в соотношении 90,0 : 60,0 : 1,0 на
20 мин.
Для выявления фракций пластины обрызгивают свежеприготовленным 5 %-ным раствором фосфорномолибденовой кислоты в 96,6 %-ном этиловом спирте. Затем пластины
подсушивают на воздухе до испарения растворителя, помещают в сухожаровой шкаф
(+100 °С) на пять минут до появления окрашенных фракций липидов. Липидные компоненты окрашиваются в сине-зеленый цвет на желтом фоне. Пластины прокладывают тонкой бумагой, помещают в полиэтиленовый пакет, хранят в защищенном от света месте для
денситометрии.
В порядке возрастания Rf относительная подвижность фракций (отношение расстояния от линии старта до середины фракции к расстоянию от старта до финиша фронта растворителя) липидные фракции располагаются в порядке, указанном на приведенных
денситограммах.
Денситометрирование осуществляют на денситометре, сканирующем в отраженном
свете на пластине длиной 15 см. По денситограммам определяют процентное соотношение каждой фракции, принимая за 100 % сумму площадей пиков всех фракций липидов на
денситограмме. Площади пиков соответствующих фракций липидов на хромотограмме
рассчитаны по формуле А = [(H1 - Н0) ⋅ W] ⋅ К0,
где H1 - расстояние от нулевой линии до вершины пика;
Н0 - расстояние от нулевой линии до основания пика (фон);
W - половина основания пика (мм) (H1 и Н0 измеряют в единицах оптической плотности);
К0 - поправочный коэффициент, рассчитанный параллельным определением содержания
липидных фракций окрашиванием сульфофосфованилиновой и фосфомолибденовой кислотами. Пример расчета содержания липидных фракций приведен в прилагаемой таблице.
Для перехода к количественному определению фракций липидов в г/л определяют
общие липиды унифицированным методом с использованием сульфофосфованилинового
реактива и делают расчет для каждой фракции, зная ее процентное содержание.
Пример осуществления способа проиллюстрирован чертежами, где представлены денситограммы липидных спекторов на тонком слое силикагеля на пластинах "Silufol": фиг. 1
- плазмы крови, фиг. 2 - эритроцитарных мембран, фиг. 3а - отечной жидкости, фиг. 3б мочи, где
1 - фракция холинсодержащих липидов (ХФ),
2 - фракция аминсодержащих фосфолипидов (АФ),
3 - фракция преаминсодержащих фософолипидов (пАФ),
4 - фракция гликолипидов (ГЛ),
5 - фракция моно- и диацилглицеринов (МДГ),
6 - фракция 7-холестанол (∆7 - ХС),
3
BY 5658 C1
7 - фракция свободный холестерин (СХС),
8 - фракция 4α-метил-∆7-холестанол(4α-м-∆7-ХС),
9 - фракция 4α-метил-∆8-холестанол(4α-м-∆8-ХС),
10 - фракция неэстерифицированных жирных кислот (НЭЖК),
11а - фракция триацилглицеринов 1 (ТГ1),
11б - фракция триглицеринов 2 (ТГ2),
12 - фракция эфиров холестерина (ЭХС),
13 - фракция свободных углеродов (СУ).
Описанным способом можно в одной микропробе биоматериала выделить и дать количественную оценку основных классов липидов.
Липидные фракции
№
Название
п/п
1
ХФ
2
АФ
3
П-АФ
4
ГЛ
5
МДГ
6
∆-7ХС
7
СХС
8 4α-М-∆-7-ХС
9 4α-М-∆-8-ХС
10
НЭЖК
11
ТГ
12
ЭСХ
13
СУ
Исходные данные для расчета содержания липидных фракций
Содержание липидных фракций
Ho
Н
W
Кo
А
%
Г/л
340,00
65,00
60,00
95,00
70,00
60,00
550,00
60,00
60,00
115,00
265,00
780,0
95,0
50,00
50,00
50,00
50,00
50,00
50,00
50,00
50,00
50,00
50,00
50,00
50,00
50,00
32,00
23,00
8,00
19,00
7,00
10,00
31,00
15,00
23,00
45,00
69,00
88,00
63,00
1,45
1,45
1,00
1,18
2,34
1,00
0,73
1,00
1,00
1,43
1,79
0,73
0,62
13456,00
500,20
80,00
1008,90
327,60
100,00
11315,00
150,00
230,00
4182,75
26554,60
46895,20
1757,70
12,640
0,470
0,75
0,948
0,308
0,094
10,629
0,141
0,216
3,929
24,94
44,00
1,65
0,667
0,025
0,004
0,50
0,016
0,005
0,561
0,007
0,011
0,207
1,317
2,330
0,087
Фиг. 2
4
BY 5658 C1
Фиг. 3
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
5
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
903 Кб
Теги
патент, by5658
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа