close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY5752

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
BY (11) 5752
(13) C1
(19)
7
(51) G 01N 33/15,
(12)
C 12Q 1/34
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭФФЕКТОРНЫХ СВОЙСТВ
ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ
(21) Номер заявки: 970395
(22) 1997.07.18
(46) 2003.12.30
(71) Заявитель: Государственное научное
учреждение "Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Литвинко Наталья Михайловна;
Кучуро Светлана Викторовна; Желдакова Татьяна Анатольевна; Филич Елена Рэмовна (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
BY 5752 C1
(57)
1. Способ определения эффекторных свойств физиологически активных соединений
по отношению к ферментативному гидролизу фосфолипидов путем выявления изменения
активности фосфолипазы А2, отличающийся тем, что проводят преинкубацию исследуемого соединения с ферментом с последующим взаимодействием полученной смеси с субстратосодержащим агарозным гелем при температуре не выше 50 °С, вычисляют площади
лизисных зон в присутствии исследуемого соединения (S) и без него (S0) и рассчитывают
степень эффекторного воздействия по формуле:
S
S × 100 % .
S0
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что преинкубацию проводят в течение 0,5-5,0 ч.
(56)
E.HABERMANN, K.L.HARDT. Analytical biochemistry, 1972. - V. 50. - P. 163-165.
RU 930489676 A, 1996.
RU 94022481 A1, 1996.
RU 94045174 A1, 1996.
RU 92011348 A, 1995.
WO 94/25623 A1.
Изобретение относится к фармацевтической промышленности и медицине и может
быть использовано в качестве контрольного теста при получении, очистке и применении
лекарственных средств.
Фосфолипаза А2 (КФ 3.1.1.4), катализирующая гидролиз сложноэфирной связи во втором положении 1,2-диацил-sn-3-фосфоглицеридов, является важнейшим ферментом обмена липидов в организме (Брокерхоф X. Дженсен Р. Липолитические ферменты. - М.:
Мир, 1978. - C. 356).
BY 5752 C1
Известно, что фосфолипаза А2 принимает участие в патогенезе острого панкреатита.
Нежелательное увеличение активности фосфолипазы А2 происходит в течение многих болезней человека, таких как ишемия миокарда и гипоксия, воспалительные процессы, аллергия, тромбообразование, отеки при радиационном поражении и др.
Действие многих лекарственных средств прямо или опосредованно связано с ингибированием активности фосфолипазы А2. В частности, ницерголин, циннаризин, алигерон,
пирацетам, которые используются в химиотерапии гипоксии, ингибируют фосфолипазу А2 in
vitro. Местные анестетики хлорпромазин, лидокаин, тетракаин и др., а также антиаритмическое средство амиодарон являются сильными ингибиторами фосфолипазы А2 С. atrox.
Нарушение функциональной активности клеточных фосфолипаз может привести к
серьезным патологическим изменениям в жизнедеятельности организма. В частности, реакции гидролиза фосфолипидов, осуществляемой фосфолипазой А2 и приводящей к образованию свободной арахидоновой кислоты, принадлежит ключевая роль в биосинтезе
биологически активных эйкозаноидов простагландинов, тромбоксанов и лейкотриенов
(Литвинко Н.М., Кисель М.А. Эндогенные фосфолипазы А2. Структура и функция.
Минск: Наука и техника, 1991. - C. 270).
Методы определения активности фосфолипазы А2 трудоемки, требуют затраты больших количеств фермента, реактивов и времени, что создает определенные трудности
при выявлении ингибиторной активности исследуемых эффекторов (Vaskovsky V.E.,
Kostetsky E.V., Vasendin L.M. // Chromatogr. 1975. - V. 114. - № 1. - P. 129-141). Для успешного изучения ингибирования фосфолипазной реакции необходимы предварительные
экспрессные тесты на потенциальные ингибиторные свойства изучаемых соединений.
Наиболее близким к заявляемому является способ определения активности фосфолипазы А2 по степени гидролиза фосфолипидов, заключающийся в диффузии нативного
фермента в лецитин-агарозный гель с последующим измерением диаметра просветленной
зоны (Habermann Е. and Hardt K.L., Anal. Biochem., 1972. - V. 50. - P. 163-173). Однако
данный способ позволяет только фиксировать наличие активности фермента.
Задачей настоящего изобретения является разработка способа скрининга эффекторной
активности любого ряда химических соединений, который может быть использован в качестве контрольного теста при получении, очистке и применении лекарственных средств.
Поставленная задача решается заявляемым способом определения эффекторных (ингибиторных и активаторных) свойств физиологически активных соединений по отношению к
ферментативному гидролизу фосфолипидов с помощью выявления изменения активности
фосфолипазы А2.
Основной особенностью фосфолипазы А2, как и всех липолитических ферментов, является осуществление каталитической функции не в свободном объеме, как у большинства ферментов, а на поверхности раздела липид-вода. Для успешного осуществления
каталитического акта необходимо соблюдение определенных условий. В частности, со
стороны субстрата важны наличие поверхности раздела липид-вода, физическое состояние субстрата, его упаковка в составе поверхности и поверхностный электростатический
заряд, а также надмолекулярная организация субстрата. Сложное строение активного центра фосфолипазы А2, включающее совокупность раздельно существующих в молекуле
фермента центра распознавания поверхности, двух Са-связывающих сайтов и непосредственно каталитического центра, предполагает существование большого числа эффекторов,
которые могут оказывать действие на проявление ее каталитической активности. Поскольку отщепление фосфолипазой А2 арахидоновой кислоты приводит к целому каскаду
реакций с образованием в результате биологически активных соединений, среди которых
особое место занимают простагландины, указанные медиаторы или их метаболиты могут
оказывать воздействие на активность фосфолипазы А2 по принципу обратной связи. В литературе имеются отдельные противоречивые факты относительно действия простагландинов на активность фосфолипазы А2. В частности, простагландины Е2 и F2α не ингибируют
2
BY 5752 C1
фосфолипазу А2 из лейкоцитов, тогда как олигомер простагландина B1 ингибирует фермент из сердца крысы и нейтрофилов человека.
В соответствии с изобретением описывается способ определения эффекторных (ингибиторных и активаторных) свойств физиологически активных соединений по отношению
к ферментативному гидролизу фосфолипидов путем выявления изменения активности
фосфолипазы А2, заключающийся в том, что проводят преинкубацию исследуемого соединения с ферментом (в течении 0,5-5,0 ч), в частности с фосфолипазой А2, с последующим взаимодействием полученной смеси с субстратсодержащим агарозным гелем при
температуре не выше 50 °С, вычисляют площади лизисных зон в присутствии исследуемого соединения (S) и без него (S0) и рассчитывают степень эффекторного воздействия по
формуле:
S
× 100 % .
S0
Вследствие липолитического действия фосфолипазы А2 на мутную эмульсию яичного
желтка (субстрат), включенного в агарозный гель, вокруг лунки, содержащей фермент,
образуется прозрачная зона просветления, площадью S0 = πR02 - πr2, где R0 - радиус зоны
просветления, а r - радиус лунки. Поскольку имеется однозначная прямопропорциональная зависимость между диаметром зоны просветления и концентрацией фосфолипазы А2,
уменьшение площади зоны просветления должно указывать на уменьшение содержания
свободного фермента и, если присутствие дополнительных веществ в лунке вызывает образование зоны просветления меньшей площади (S = πR2 - πr2, где r - радиус лунки, a S и
R - площадь и радиус зоны просветления в присутствии ингибитора, причем S < S0), то
можно говорить об ингибирующем действии на фосфолипазу А2 этих веществ. Тогда относительное уменьшение площади зоны просветления S/S0 = (R2 - r2) / (R02 - r2) может
служить мерой остаточной активности фермента в присутствии ингибитора.
Способ обнаруживает ряд преимуществ: отличается хорошей воспроизводимостью
(точность воспроизведения колеблется от 1,2 до 3 %), малым расходом фермента и других
компонентов системы, позволяет одновременно проводить испытания нескольких десятков веществ (одна чашка Петри диаметром 88 мм позволяет произвести одновременно
скрининг 12-18 веществ). Для поставленных целей особенно важно, что при проведении
фосфолипазной реакции данным методом изменение концентрации субстрата не влияет на
его состояние (организацию) в геле. В липидно-водных системах организация субстрата
меняется с изменением его концентрации, а следовательно, по ходу реакции, что негативно сказывается на процессе гидролиза и создает определенные сложности при интерпретации результатов.
Для лучшего понимания сущности заявляемого изобретения приводятся примеры
конкретного выполнения, не ограничивающие объема изобретения.
Пример 1.
Для определения эффекторных свойств физиологически активных гидрофильных соединений, в частности, 9,10,11-метальных аналогов простагландинов, по отношению к активности фосфолипазы А2 используют диффузию фермента в лецитин-агарозном геле.
Мерой ингибирования служит относительное уменьшение площади зоны просветления
(S/S0), образующейся вследствие липолитического действия фермента на эмульсию яичного желтка, включенного в агарозный гель, которое рассчитывают по формуле:
S/S0 = (R2 - r2) / (R02 - r2),
где R, R0 - радиусы зон просветления в присутствии потенциального ингибитора и без него, r - радиус лунки.
Эмульсию яичного желтка (субстрат фосфолипазы A2) готовят по методу Хабермана и
Хардта. Для приготовления геля используют 0,05 М веронал-ацетатный буфер, рН 7,5.
3
BY 5752 C1
Гель содержит 0,8 % агарозы, 1,6 мМ СаСl2 и 27 % эмульсии яичного желтка. Высота слоя
геля в чашках Петри составляет 4 мм.
Фосфолипазу A2 (9 мкг в 20 мкл Н2О) преинкубируют в течение 3 ч с равным по объему
спиртовым раствором простагландина (1 мг/мл). 10 мкл этого раствора смешивают с равным объемом воды и вносят в вырезанную в геле круглую лунку (диаметр 4 мм, объем
25 мкл).
Реакцию проводят в течение 20 ч при 50 °С. Измерение диаметра зоны просветления
производят с помощью измерительной лупы с ценой деления 0,1 мм, причем величина R
меняется в пределах от 10 до 22 мм.
Пример 2.
Для определения эффекторных свойств физиологически активных гидрофобных соединений, в частности, производных глицерина, по отношению к активности фосфолипазы А2 используют диффузию фермента в лецитин-агарозном геле. Мерой ингибирования
служит относительное уменьшение площади зоны просветления (S/S0), образующейся
вследствие липолитического действия фермента на эмульсию яичного желтка, включенного в агарозный гель, которое рассчитывают по формуле:
S/S0 = (R2 - r2) / (R02 - r2),
где R, R0 - радиусы зон просветления в присутствии потенциального ингибитора и без него, r - радиус лунки.
Эмульсию яичного желтка (субстрат фосфолипазы А2) готовят по методу Хабермана и
Хардта. Для приготовления геля используют 0,05 М веронал-ацетатный буфер, рН 7,5.
Гель содержит 0,068 % агарозы, 1,6 мМ СаСl2 и 13 % эмульсии яичного желтка. Высота
слоя геля в чашках Петри составляет 4 мм.
0,012 %-ный предварительно прогретый (100 °С, 60 с) раствор фосфолипазы А2 инкубируют 45 мин с равным по объему 16,6 мМ раствором ингибитора, содержащим 0,65 %
NaCl и 0,1 % сывороточного альбумина. 10 мкл этого раствора смешивают с равным объемом воды и вносят в вырезанную в геле круглую лунку (диаметр 4 мм, объем 25 мкл).
Реакцию проводят в течение 20 ч при 50 °С. Измерение диаметра зоны просветления производят с помощью измерительной лупы с ценой деления 0,1 мм, причем величина R меняется в пределах от 10 до 22 мм.
Пример 3.
Для определения эффекторных (активаторных) свойств физиологически активных соединений, в частности, бетаина (глицинбетаина), мочевины и аминоэфира бензойной кислоты, по отношению к активности фосфолипаз А2 различного происхождения (змеиного
яда, пчелы и панкреаса свиньи) используют диффузию фермента в лецитин-агарозном геле. Мерой активирования служит относительное увеличение площади зоны просветления
(S/S0), образующейся вследствие липолитического действия фермента на эмульсию яичного желтка, включенного в агарозный гель, которое рассчитывают по формуле:
S/S0 = (R2 - r2) / (R02 - r2),
где R, R0 - радиусы зон просветления в присутствии потенциального эффектора и без него,
r - радиус лунки.
Эмульсию яичного желтка (субстрат фосфолипазы А2) готовят по методу Хабермана и
Хардта. Для приготовления геля используют 0,05 М веронал-ацетатный буфер, рН 7,5.
Гель содержит 0,068 % агарозы, 1,6 мМ СаСl2 и 13 % эмульсии яичного желтка. Высота
слоя геля в чашках Петри составляет 4 мм.
0,012 %-ный предварительно прогретый (100 °С, 60 с) раствор фосфолипазы А2 инкубируют 45 мин с равным по объему 16,6 мМ раствором ингибитора, содержащим 0,65 %
4
BY 5752 C1
NaCl и 0,1 % сывороточного альбумина. 10 мкл этого раствора смешивают с равным объемом воды и вносят в вырезанную в геле круглую лунку (диаметр 4 мм, объем 25 мкл).
Реакцию проводят в течение 20 ч при 50 °С. Измерение диаметра зоны просветления производят с помощью измерительной лупы с ценой деления 0,1 мм, причем величина R меняется в пределах от 10 до 22 мм.
В табл 1. представлены результаты определения активности фосфолипазы А2 после
преинкубации с различными представителями 9,10,11-метальных производных и аналогов
простагландинов. По приведенной в таблице величине остаточной активности фермента
видно, что все испытываемые вещества снижали активность фосфолипазы А2.
В табл. 2, 3 приведены средние значения из 3-4 опытов, указана среднеквадратичная
ошибка. В качестве контроля служили площади зоны просветления (S0) вокруг лунок с
внесенным в них в тех же условиях раствором фермента, в случае гидрофобных соединений преинкубированного в течение 3 ч с соответствующим по объему количеством спирта
без простагландина.
В табл. 4 представлены результаты определения активности фосфолипазы А2 после
преинкубации с бетаином (глицинбетаином), мочевиной (карбамидом) и аминоэфиром
бензойной кислоты. По приведенной в таблице величине S/S0, значение которой выше
единицы, видно, что все испытываемые вещества увеличивали активность фосфолипазы А2.
Представленные результаты по испытанию ингибиторного (производные простагландинов, как гидрофобных соединений, и производные глицерина, как гидрофильных соединений), а также активаторного (бетаин, мочевина и аминоэфир бензойной кислоты)
действия физиологически активных соединений на фосфолипазную реакцию позволяют
применять описанный в данной работе полуколичественный, удобный в выполнении метод
гель-диффузии фосфолипазы А2 для быстрого и одновременного тестирования эффекторной активности любого ряда химических соединений по отношению к ферментативному
гидролизу фосфолипидов.
Таблица 1
Характеристика гидролиза фосфатидилхолина фосфолипазой А2
после преинкубации фермента с некоторыми аналогами простаноидов
Шифр соединения
Общий гидролиз, %
Удельная активность
мкмоль/мин ⋅ мг
Ингибиторный
эффект, %
контроль
75,5 ± 1
51,75 ± 2
0
II
59,4 ± 3
40,36 ± 2
21,5 ± 3,6
III
61 ± 5
38,8 ± 4
16,3 ± 2
XI
77 ± 1
52,8 ± 1
-2
XXIV
58,6 ± 1,5
39,6 ± 1
23,5 ± 1,5
XXII
59 ± 1
39,3 ± 1
24 ± 1
Время реакции 2-5 мин, время преинкубации - 3 часа.
5
6
II
PGE2a
PGF2a
HO
HO
O
OH
OH
OH
Природные ПГ
3
R2
Аналоги ПГ на основе циклопентанона
2
1
I
R1
Шифр
в-ва
R4
R3
CH3
COOH
CH3
COOH
4
R3
O
R2
5
R4
R1
10,2 ± 0,7
10,4 ± 0,9
90,0 ± 3,0
89,0 ± 3,0
4,0 ± 0,1
4,3 ± 0,2
90,0 ± 6,0
92,0 ± 1,0
1 группы
2 группы
(Naja naja oxiana)
(Vipera russelli)
Общий Остаточная Общий Остаточная
гидролиз активность, гидролиз активность
(N, мкмоль) (N/N0 %) (N, мкмоль) (N/N0 %)
6
7
8
9
ФЛА2
Относительное уменьшение площади зоны просветления при гель-диффузии ФЛА2
в присутствии природных простагландинов (ПГ) и их аналогов
Таблица 2
BY 5752 C1
7
XXIV
XXIII
XXII
XXI
XX
XIX
XVIII
XVII
XVI
V
IV
1
III
3
-(CH2)7COOCH3
O
O
O
O
O
O
NH2
NH2
NH2
N
N
N
C4H9
CH3
CH3
CH3
COOCH3
CH2OH
COOH
C4H9
C4H9
OH
OH
C3H7
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
R4
R3
4
H
O
i-BuO
i-BuO
H
CH3
R2
R1
5
H
10,0 ± 0,01
10,0 ± 0,6
10,6 ± 0,01
10,2 ± 0,3
6
9,8 ± 0,7
86,0 ± 2,0
86,0 ± 2,0
93,0 ± 2,0
87,0 ± 1,0
7
84,0 ± 5,0
O
O
O
N
N
N
COOCH 3
CH2OH
COOH
CH 2 OH
C4H9
C4H9
C4H9
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
i-BuO
i-BuO
i-BuO
i-BuO
H
H
H
10,3 ± 1,4
11,0 ± 0,8
11,1 ± 1,4
11,3 ± 0,6
10,4 ± 0,3
9,8 ± 3,5
9,8 ± 0,7
89,0 ± 6,0
97,0 ± 5,0
95,0 ± 5,0
96,0 ± 3,0
89,0 ± 4,0
84,0 ± 3,0
84,0 ± 3,0
5. Содержащие в ω-цепи цикл изоксазола или фрагмент енаминокетона
-(СН2)7ОН
-(СН2)6СООН
OH
OH
1. Этиленовые
Аналоги ПГ на основе циклопентенона
2
-(CH2)4CH3
-
4,4 ± 0,2
4,5 ± 0,4
4,4 ± 0,5
4,5 ± 0,01
4,3 ± 0,5
4,4 ± 0,2
4,4 ± 0,2
4,8 ± 0,5
4,3 ± 0,2
4,1 ± 0,4
-
92,0 ± 5,0
94,0 ± 3,0
92,0 ± 9,0
100,0 ± 1,0
94,0 ± 6,0
94,0 ± 3,0
97,0 ± 3,0
92,0 ± 4,0
89,0±3,0
88,0 ± 3,0
Продолжение табл. 2
8
9
4,6 ± 0,3 100,0 ± 4,0
BY 5752 C1
BY 5752 C1
Таблица 3
Относительное уменьшение площади зоны просветления
при гель-диффузии фосфолипаз А2 в присутствии производных
глицерина (CH2OR1CH(OR2)CH2OR3)
№
1
2
3
4
Соединение
Трибутирин
Глицеральдегид
α-глицерофосфат
β-глицерофосфат
R1
С(O)С4Н6
СОН
PO3Na2
Н
R2
С(O)С4Н6
Н
H
PO3Na2
R3
С(O)С4Н6
Н
H
H
ФЛА2, S/S0
0,80
0,85
0,52
0,59
Таблица 4
Относительное увеличение зоны просветления при гель-диффузии фосфолипазы А2
из разных источников в присутствии следующих веществ
№
1
2
3
Соединение
Бетаин
(глицинбетаин)
Мочевина
(карбамид)
Формула
+
(CH 3 ) 3 NC H 2 COO -
S/S0
1,14 ± 0,04
NH2
O=C
1,24 ± 0,02
Фосфолипаза А2
панкреаса свиньи
1,16 ± 0,01
Фосфолипаза А2
пчелы
NH2
Аминоэфир бензой(C2H5)2N(CH2)4COOC6H5
ной кислоты
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
Примечание
Фосфолипаза A2
змеиного яда
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
218 Кб
Теги
by5752, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа