close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY5793

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
7
(51) C 12N 1/20,
(12)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
BY (11) 5793
(13) C1
(19)
C 12P 19/08//
(C 12N 1/20,
C 12R 1:01)
ШТАММ БАКТЕРИАЛЬНОЙ КУЛЬТУРЫ LEUCONOSTOC
MESENTEROIDES БМП-98 ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ДЕКСТРАНА
(21) Номер заявки: a 19990758
(22) 1999.07.29
(46) 2003.12.30
(71) Заявитель: Открытое акционерное
общество "Белмедпрепараты" (BY)
(72) Авторы: Царенков Валерий Минович;
Гаврилов Михаил Владимирович;
Скрипко Анна Дмитриевна; Петров Петр
Тимофеевич; Кузнецова Инна Ивановна;
Тюрин Виталий Иванович (BY)
(73) Патентообладатель: Открытое акционерное общество "Белмедпрепараты" (BY)
(57)
Штамм бактериальной культуры Leuconostoc mesenteroides БМП-98 (КПМКБ В18-1)
для производства декстрана - субстанции плазмозамещающих препаратов.
BY 5793 C1
(56)
EP 0363633 B1, 1990.
PL 227908, 1981.
RU 2039754 C1, 1995.
SU 1559717 A1, 1994.
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности, к производству плазмозамещающих препаратов на основе декстрана, и касается штамма продуцента декстрана.
Известны бактериальные культуры Leuconostoc dextranicum, Leuconostoc mesenteroides,
синтезирующие декстран из сахарозы (Sharpe M.E. at al. - Appl Microbiol., 1972, 23. - P. 389-397).
Для промышленного биологического синтеза нативного декстрана в РБ с 1958 года
использовался штамм Leuconostoc mesenteroides СФ-4, выделенный из сахарного песка.
(Сельцовская Г.С. Биологический синтез нативного декстрана - первый этап получения
плазмозаменителя полиглюкина. - М., 1957. - С. 6 (прототип). Декстранобразующая способность (ДОС) штамма СФ-4 на солевой среде составляет 36,4 % от количества сахара в
питательной среде при средней продолжительности ферментации 70 ч. (Волоханович А.И.
и др. Химико-фармацевтический журнал, 1975. - Т. 9. - № 3. - С. 42).
Задачей изобретения является получение штамма, имеющего более высокую ДОС при
укороченном цикле ферментации.
Новый штамм (условное название - БМП-98) получен путем воздействия ультрафиолета (лампа БУВ-30, интенсивность светового потока 4⋅10-5Вт) на микробную суспензию
штамма СФ-4 с последующим многоступенчатым отбором вариантов по признакам ДОС и
укороченного цикла ферментации.
Микроорганизмы штамма представляют собой слегка удлиненные граммположительные неподвижные кокки, размножающиеся поперечным делением. Спор не образуют. На
среде с сахарозой образуют капсулы, которые имеют полисахаридную структуру.
BY 5793 C1
Культурально-морфологические особенности штамма при выращивании на плотных
средах представлены в примерах 1-4.
Пример 1.
Агаризованная среда состава:
1. КСl
1,0 г
2. КН2РО4
2,0 г
3.Na2HPO412H2O
5,0 г
4. Пептон
1,0 г
5. Сахар-рафинад
100 г
6. Дрожжевой экстракт
0,02 г
7. Агар-агар
14 г
8. Вода дистиллированная
до 1000 мл.
рН среды 6,4 - 6,8, стерилизация 120 °С в течение 20 мин.
Штамм культивируют на чашках Петри в течение 48 ч при температуре 24 °С.
Колонии на агаризованной среде 5-6 мм в диаметре, блестящие, прозрачные, выпуклые, правильной круглой формы.
Пример 2.
Агаризованная среда состава:
1. КСl
1,0 г
2. КН2РО4
2,0 г
3.Na2HPO412H2O
5,0 г
4. Пептон
1,0 г
5. Глюкоза
100 г
6. Дрожжевой экстракт
0,02 г
7. Агар-агар
14 г
8. Вода дистиллированная
до 1000 мл.
рН среды 6,4-6,8, стерилизация 120 °С в течение 20 мин.
Штамм культивируют на чашках Петри в течение 48 ч при температуре 24 °С.
Колонии на агаризованной среде 2-3 мм в диаметре, блестящие, прозрачные, выпуклые, правильной круглой формы.
Пример 3.
Агаризованная среда состава:
1. Пептон
10,0 г
2. NaCl
5,0 г
3. Агар-агар
20,0 г
4. Вода мясная
до 1000 мл.
рН среды 7,2-7,4, стерилизация 121 °С в течение 30 мин.
Штамм культивируют на чашках Петри в течение 72 ч при температуре 25 °С.
Колонии на мясо-пептонном агаре мелкие, поверхностные, в диаметре до 1,5 мм, правильной круглой формы с гладким краем. Поверхность колоний гладкая, блестящая, профиль
выпуклый, цвет желтовато-кремовый. Внутренняя структура (при слабом увеличении микроскопа) однородная.
Пример 4.
Агаризованная среда состава:
Агар-агар
20,0 г
Сусло солодовое 7°Б
до 1000 мл.
Стерилизация 105 °С в течение 30 мин.
На 72 часу культивирования на чашках Петри с сусло-агаром при температуре 25 °С
штамм образует точечные, прозрачные поверхностные колонии, круглые, с гладким краем. Поверхность колоний блестящая, профиль плоский. Внутренняя структура (при слабом увеличении микроскопа) крупнозернистая.
2
BY 5793 C1
Физиолого-биохимические признаки штамма Leuconostoc mesenteroides БМП-98:
Штамм сапрофит, факультативный анаэроб. Термически неустойчив. Способен расти
в интервале температур от 18 °С до 30 °С. Оптимальная температура роста 24 ± 1 °С. Растет в интервале рН от 6,8 до 4,5. Оптимальный рН среды для образования декстрана находится в пределах 6,0-5,0.
Штамм БМП-98 превращает сахарозу в декстран, предварительно расщепляя ее на глюкозу
и фруктозу. Побочным продуктом брожения является молочная кислота. Ферментирует ксилозу, арабинозу, рафинозу, утилизирует аммонийные и аминные формы азота (пептоны, дрожжевой автолизат, дрожжевой экстракт). В присутствии сахарозы связывает неорганический фосфор.
Культура сохраняет жизнеспособность в течение 2 лет в лиофилизированном состоянии.
Штамм БМП-98 не патогенен, не обладает аллергенным действием, устойчив к посторонней микрофлоре.
Техническим результатом изобретения явилось получение штамма с высокой производительностью процесса биосинтеза декстрана при укороченном цикле ферментации.
Изобретение поясняется примерами 5 и 6.
Пример 5.
Крупную изолированную колонию с агаризованной среды (пример 1) бактериологической петлей вносят в жидкую среду для культивирования штамма. Посевная среда для
культивирования:
1. КСl
0,1 г
2. MgSO4
0,1 г
3. КН2РO4
1,0 г
4. Na2HPO412Н2О
2,5 г
5. NH4Cl
0,5 г
6. Соль Мора
0,01 г
7. Парааминобензойная кислота
0,05 г
8. Пептон
0,2 г
9. Сахар-рафинад
100 г
10. Вода дистиллированная
до 1000 мл.
Для приготовления среды используют чистые соли и бидистиллированную воду. Компоненты растворяют в подогретой воде в указанном порядке. После растворения доводят
объем водой до 1000 мл. Затем проверяют рН (должен быть 6,6 ± 0,2) и содержание сахара
(9,5 ± 0,5) %. Приготовленную среду фильтруют через двойной бумажный фильтр и разливают в стерильные пробирки по (11 ± 1) мл. Среду, разлитую в пробирки, стерилизуют
в автоклаве 30 мин при температуре 120 °С.
После стерилизации среда должна быть прозрачной. Приготовленную среду выдерживают по трое суток последовательно при температурах 37 °С и 24 °С соответственно для
установления ее стерильности.
Посевной материал выращивают при температуре 24 ± 1 °С в течение 24 ч, после чего в
количестве 10 мл вносят в колбу Эрленмейера с ферментационной питательной средой.
Ферментационная питательная среда состава:
1. КСl
0,1 г
2. MgSO4
0,1 г
3. КН2РО4
1,5 г
4. Na2HPO412Н2О
4,4 г
5. NH4Cl
0,5 г
6. Соль Мора
0,01 г
7. Парааминобензойная кислота
0,05 г
8. Пептон
0,3 г
9. Сахар-песок
100 г
3
BY 5793 C1
10. Дрожжевой экстракт
0,01-0,03 г
11. Вода дистиллированная
до 1000 мл.
Порядок приготовления данной среды аналогичен описанному выше для посевной
среды. рН среды 6,2 ÷ 6,8.
Среду, разлитую в колбы по 500 мл, стерилизуют в автоклаве 30 мин при 120 °С.
Ферментацию ведут при температуре 24 ± 1 °С в течение 52 ч, после чего определяют
содержание декстрана весовым методом после двукратного осаждения этиловым спиртом
пробы культуральной жидкости.
Декстранобразующая способность штамма БМП-98 составляет 37,5 % от количества
сахара в питательной среде при продолжительности ферментации 52 ч.
Пример 6.
Ферментационная питательная среда состава:
1. КСl
-0,1 г
2. MgSO4
-0,1 г
3. КН2РО4
1,5 г
4. Na2HPO412H2O
4,4 г
5.NH4Cl
0,5 г
6. Соль Мора
0,01 г
7. Пептон
0,3 г
8. Сахар-рафинад
100 г
9. Дрожжевой экстракт
0,2-0,3 г
10. Вода дистиллированная
до 1000 мл.
Способ приготовления среды, выращивание посевного материала, ведение процесса
ферментации, определение ДОС в соответствии с примером 5.
Сравнительная декстранобразующая способность штаммов СФ-4 и БМП-98 в условиях, описанных в примерах 5 и 6, представлена в таблице.
ДОС штаммов СФ-4 и БМП-98.
Выход (в %) декстрана
Продолжительность ферментации (в ч)
Пример № 5
СФ-4
БМП-98
36,4
37,5
70
52
Пример № 6
СФ-4
БМП-98
36,2
36,6
68
58
Выделяют декстран из культуральной жидкости осаждением этиловым спиртом при
рН от 6,0 до 6,4. Водно-спиртовый маточник декантируют, осадок растворяют в воде до
концентрации 6÷7 % и проводят очистку декстрана повторным спиртовым осаждением.
Продукт жизнедеятельности культуры Leuconostoc mesenteroides штамм БМП-98 - полисахарид декстран (α-1, 6-глюкан) является субстанцией в производстве плазмозамещающих препаратов гемодинамического и реологического ряда - полиглюкина, реополиглюкина, полиглюсоля, реоглюмана, неорондекса, рондферрина, спейсферрона - препаратов - гемокорректоров,
использующихся при лечении шоков различного происхождения - травматического, ожогового,
геморрагического и для лечения железодефицитных анемий.
Штамм Leuconostoc mesenteroides БМП-98 депонирован в коллекции промышленных
микроорганизмов концерна "Белбиофарм", регистрационный номер В 18-1 от 20.11.98 г.
Культура используется в производстве плазмозамещающих препаратов на АО "Белмедпрепараты".
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
4
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
149 Кб
Теги
by5793, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа