close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY6206

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
BY (11) 6206
(13) C1
(19)
7
(51) G 01N 33/48
(12)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРЕОБЛАДАЮЩЕГО МЕХАНИЗМА
ГИБЕЛИ КЛЕТОК В КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ
(21) Номер заявки: a 20001173
(22) 2000.12.28
(46) 2004.06.30
(71) Заявитель: Государственное учреждение "Республиканский научнопрактический центр радиационной
медицины и экологии человека"
(BY)
(72) Авторы: Горанов Виталий Анатольевич; Мохорт Татьяна Вячеславовна;
Мельнов Сергей Борисович; Горанова
Юлия Анатольевна (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
учреждение "Республиканский научно-практический центр радиационной
медицины и экологии человека" (BY)
(57)
Способ определения преобладающего механизма гибели клеток в клеточных популяциях
путем цитофлюориметрического определения распределения фракций ДНК, отличающийся тем, что осуществляют динамическое наблюдение за избирательным накоплением
красителя компартментами клеток и при получении статистически достоверного различия
преобладания количества клеток, утративших диплоидную ДНК-организацию, делают
вывод об апоптозопосредованной гибели клеток, а при преобладании этидиумбромидпозитивных клеток - о некрозоопосредованной гибели клеток.
BY 6206 C1
(56)
Nusse M. et. al. Methods in cell biology. - 1994. - V. 42. - P. 149-158.
Изобретение относится к медицине, к разделу лабораторная диагностика.
Известен способ определения основных путей гибели клеток при патофизиологических процессах в клеточных популяциях путем цитофлюориметрического определения
поглощения красителя компартментами клеток - в частности ДНК с последующей дифференциацией пути гибели по спектрам осциляции, заключающийся в том, что с помощью
проточного цитофлюориметра определяется нарастание количества фрагментов ДНК в так
называемой гиподиплоидной части спектра осциляции по пропидиуму иодату (этидиуму
бромиду), по чем судят о количестве клеток, претерпевающих апоптоз [1].
Указанный способ является прототипом по отношению к заявляемому. Общим признаком для заявляемого способа и прототипа является цитофлюориметрическое определение распределения фракций ДНК.
Однако указанный способ обладает следующими недостатками.
Недостаточной точностью дифференциации пути гибели клеток в период исследования
в случае преобладания в популяции клеток, претерпевающих позднюю стадию апоптоза
(программируемой клеточной гибели), когда происходит наложение цитофлюориметрических характеристик клеток, гибнущих как путем апоптоза, так и путем некроза.
BY 6206 C1
Этот же момент обусловливает и следующий недостаток прототипа - трудность верификации временной динамики развития апоптозной гибели клеток в культуре.
Задача данного изобретения - повышение точности дифференциации путей гибели
клеток в популяции.
Поставленная задача достигается следующим образом: предложен способ определения
преобладающего механизма гибели клеток в клеточных популяциях путем цитофлюориметрического определения распределения фракций ДНК, отличающийся тем, что осуществляют динамическое наблюдение за избирательным накоплением красителя
компартментами клеток и при получении статистически достоверного различия преобладания количества клеток, утративших диплоидную ДНК-организацию, делают вывод об
апоптозопосредованной гибели клеток, а при преобладании этидиумбромидпозитивных
клеток - о некрозоопосредованной гибели клеток.
В основе данного способа лежат следующие механизмы, позволяющие реализовать
его на практике;
увеличение проницаемости мембраны к этидиум бромиду, что свидетельствует о ее
дестабилизации.
сепарация ядра клетки, сопровождающегося утратой диплоидности ДНК. Так как при
апоптозе фаза дезагрегации генетического материала (ДНК) в подавляющем большинстве
случаев предшествует заметным изменениям структурно-функциональной целостности мембраны клетки, то динамическое преобладание первого показателя над вторым позволяет
сделать заключение о том, что в данном образце отмечается некрозопосредованная гибель
клеток. Динамическое преобладание второго показателя над первым позволяет сделать
вывод о преобладании апоптозопосредованной гибели в данном образце.
Способ осуществляют следующим образом: необходимо провести исследование сепарации ядерно-мембранного повреждения в клеточных популяциях 2-х разных типов - суспензии свежеотобранных лимфоцитов периферической крови здоровых доноров и 6дневной монослойной культуре крысиных эмбриональных β-клеток поджелудочной железы, первоначально полученных путем ферментативной обработки выделенного и измельченного в стерильных условиях материала поджелудочных желез эмбрионов крыс и затем
культивированных при температуре 37 °С в среде RPMI1640 с 5 %-ной фетальной телячьей инактивированной сывороткой и 40 мкг/мл гентамицина.
При этом как безусловный стимул развития апоптоза в р-клетках поджелудочной железы используют интерлейкин-1 в концентрации 10 ЕД/мл при длительной экспозиции в
течение 72 часов с перерывом после 18 часов экспозиции на 12 часов, а для лимфоцитов преднизолон в различных аликвотах (0,01 мкг/мл; 0,1 мкг/мл; 0,5 мкг/мл). В качестве
позитивного контроля для воспроизведения некроза в экспериментальных популяциях
клеток используют высокую температуру инкубация (43,3 °С - 40 минут) для лимфоцитов
и аллоксан в концентрации 2 мМ для β-клеток. Разница между скоростью распада ядер и
скоростью повреждения мембраны клеток характеризует то, какой механизм преимущественно лежит в основе гибели клеток - некроз или апоптоз. В случае преобладания
апоптотической гибели клеток должно наблюдаться быстрое уменьшение количества
ядер, содержащих ДНК в виде диплоидного набора (2п), в то время как количество клеток,
позитивных на повреждение мембраны и распад на фрагменты:
(в тестах с этидиумом бромидом) будет "отставать" от количества фрагментированной
ДНК. В случае преобладания некроза будет наблюдаться обратная картина. Количество
распавшихся ядер определяют с помощью цитофлюориметра FACS vantage в динамике
культивирования (стандартная двухэтапная методика [2]). Для получения необходимого
количества клеток,
(10 000) используют методику сортировки клеток, исследуемых в каждом экспериментальном образце (лунка 96-луночного планшета) на цитофлюориметре FACS vantage. Благодаря этому, к окончанию эксперимента потери клеточного составляют от 2,1 % до 3,0 %.
2
BY 6206 C1
Определение второго показателя этидиум-позитивных клеток (ЭПК) осуществляют
основной по методике Rossi P.M. et. al. 1996 [3], преимущественно включающей инстиляцию 0,01 % этидиума бромида в среду культивирования клеток.
Для окончательной верификации преобладающего механизма гибели исследуемых
клеток осуществляют динамическое наблюдение за избирательным распределением красителя компартментами клеток по соотношению количеств распавшихся ядер и этидиумбромидпозитивных клеток.
Для свежеотобранных лимфоцитов периферической крови здоровых доноров при инкубации с преднизолоном в концентрации ОД мкг/мл оно равно на 0,5 часу инкубации 0,99; на 2 час инкубации - 2,1; на 6 часу инкубации - 1,7. Статистическая достоверность
различия между исследуемыми показателями для каждого периода времени: на 0,5 час инкубации р>0,1; на 2 час инкубации р<0,01; на 6 часу инкубации - р<0,01. Это свидетельствует об активно-протекающем апоптозе клеток в данной популяции на 2 час инкубации.
Для свежеотобранных лимфоцитов периферической крови здоровых доноров при инкубации при высокой температуре (43,3 °С - 40 минут) оно равно на 0,5 часу инкубации 0,95; на 2 час инкубации - 0,78; на 6 часу инкубации - 1,08. Статистическая достоверность
различия между исследуемыми показателями для каждого периода времени: на 0,5 час
инкубации р>0,1; на 2 час инкубации р<0,01; на 6 часу инкубации - р>0,1. Это свидетельствует об активно-протекающем некрозе клеток в данной популяции на 2 часу инкубации.
Для 6-дневной монослойной культуре крысиных эмбриональных β-клеток поджелудочной железы при инкубации с интерлейкином-1 в концентрации 10 ЕД/мл (при длительной экспозиции в течение 72 часов с перерывом после 18 часов экспозиции на 12
часов) оно отражено на таблице.
Полученные результаты свидетельствуют об активно-протекающем апоптозе клеток в
данной популяции с 1 по 6 час инкубации и на 66 час инкубации.
Для 6-дневной монослойной культуре крысиных эмбриональных β-клеток поджелудочной железы при инкубации с аллоксаном в концентрации 2 мМ в течение 18 часов исследуемое соотношение колеблется в пределах 0,3-0,86 (р<0,05) на протяжении всего
периода инкубации. Это свидетельствует об активно-протекающем некрозе клеток в данной популяции на протяжении всей инкубации.
Таким образом, по сравнению с прототипом указанный способ обладает следующими
преимуществами:
1. Возможность четкой дифференцировки преобладание той или иной клеточной гибели (апоптоза/некроза) во временной динамике.
2. Возможность проведения скрининга значительного количества экспериментального
материала при экономии средств для "тонкой" идентификации каждого из процессов.
3. Простота выполнения заявляемого способа.
Источники информации:
1. Frey T. Nucleic acid dyes for detection of apoptosis in live cells. Cytometry, 1995, Nov I;
21(3): 265-74, с. 265-274 (прототип).
2. Buja L.M., Eigenbrodt M.L, Eigenbrodt E.H. Apoptosis and necrosis. Basic Types and
mechanisms of cell death//Arch. Pathol. Lab. Med. 1993. - V. li7, № 12. - P. 12G8-1214.
3. Rossi P.M., Campbell D.L, Pottier R.H. In vitro studies on the potential use of 5aminolaevulinic acid-mediated photodynamic therapy for gynaecological tumours.//British Journal of Cancer. 1996 (74), 881-887.
3
BY 6206 C1
Таблица 1
Соотношение количества распавшихся ядер и этидиум-бромидпозитивных клеток
при инкубации культуры β-клеток с интерлейкином-1
Время экспозиции
0
1ч
3ч
6ч
18 ч
24 ч
42 ч
48 ч
66 ч
72 ч
0,95
1,151 0,784 0,752 1,481 0,934
Cоотношение
1,053 1,703 3,303 1,690
Р
р>0,1 р<0,01 р<0,01 р<0,01 р>0,1 р>0,1 р<0,05 р<0,05 р<0,01 р>0,1
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
136 Кб
Теги
by6206, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа