close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY6399

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
BY (11) 6399
(13) C1
(19)
7
(51) A 61K 38/02, 39/39,
(12)
47/00, A 61P 37/02
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
ЛЕКАРСТВЕННЫЙ СОСТАВ С ИММУНОМОДУЛЯТОРНЫМ
ДЕЙСТВИЕМ, СОДЕРЖАЩИЙ ПЕПТИДЫ И
ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ СРЕДСТВА
BY 6399 C1
(21) Номер заявки: 19980872
(22) 1997.02.21
(86) PCT/EP97/00828, 1997.02.21
(31) 196 07 044.9 (32) 1996.02.24 (33) DE
(31) 196 38 313.7 (32) 1996.09.19 (33) DE
(31) 196 48 687.4 (32) 1996.11.25 (33) DE
(46) 2004.09.30
(71) Заявитель: Берингер Ингельхейм Интернациональ ГмбХ (DE)
(72) Авторы: ШМИДТ Вальтер (DE/AT);
БИРНШТИЛЬ Макс (CH/AT); ШТАЙНЛАЙН Петер (DE/AT); БУШЛЕ Михаэль (DE/AT); ШВАЙГХОФФЕР Томас
(HU/AT)
(73) Патентообладатель: Берингер Ингельхейм Интернациональ ГмбХ (DE)
(57)
1. Лекарственный состав для иммуномодуляции, содержащий, по меньшей мере, один
обладающий иммуномодуляторным действием пептид в сочетании со вспомогательным
средством, отличающийся тем, что пептид является лигандом для молекулы MHC, экспримируемой организмом подлежащего воздействию индивидуума, а вспомогательное
средство обеспечивает увеличение степени связывания пептидов с клетками организма
индивидуума и усиление проникновения в клетки, а также усиление иммуномодуляторного эффекта пептида.
2. Лекарственный состав по п. 1, отличающийся тем, что пептид является лигандом
для MHC-I.
3. Лекарственный состав по п. 1, отличающийся тем, что пептид является лигандом
для MHC-II.
4. Лекарственный состав по п. 1, отличающийся тем, что пептид является лигандом
для HLA-A2.
5. Лекарственный состав по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что содержит
пептид, происходящий от белка патогенного возбудителя.
6. Лекарственный состав по п. 5, отличающийся тем, что пептид происходит от бактериального белка.
7. Лекарственный состав по п. 5, отличающийся тем, что пептид происходит от вирусного белка.
8. Лекарственный состав по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что содержит
пептид, происходящий от белка-антигена опухоли.
9. Лекарственный состав по п. 8, отличающийся тем, что антиген опухоли происходит от антигена опухоли, экспримируемого организмом подлежащего воздействию
индивидуума.
10. Лекарственный состав по п. 8, отличающийся тем, что антиген опухоли является
часто встречающимся антигеном.
BY 6399 C1
11. Лекарственный состав по любому из пп. 8-10, отличающийся тем, что антиген является антигеном меланомы.
12. Лекарственный состав по любому из пп. 1-11, отличающийся тем, что содержит
несколько пептидов, являющихся лигандами для молекул MHC различных классов, экспримируемых организмом подлежащего воздействию индивидуума.
13. Лекарственный состав по любому из пп. 1-11, отличающийся тем, что содержит
один или несколько пептидов, происходящих от иммуногенного белка, белка опухоли или
продукта их распада, имеющих естественное происхождение.
14. Лекарственный состав по пп. 1-11, отличающийся тем, что содержит один или
несколько пептидов, отличных от пептидов, происходящих от иммуногенного белка, белка опухоли или продукта их распада, имеющих естественное происхождение.
15. Лекарственный состав по п. 1, отличающийся тем, что пептид представляет собой
антагонист пептида, происходящего от белка, являющегося возбудителем аутоиммунного
заболевания.
16. Лекарственный состав по любому из пп. 1-15, отличающийся тем, что вспомогательное средство представляет собой органический поликатион или смесь органических
поликатионов.
17. Лекарственный состав по п. 16, отличающийся тем, что пептид имеет отрицательный заряд.
18. Лекарственный состав по п. 16 или 17, отличающийся тем, что вспомогательное средство представляет собой основную полиаминокислоту или смесь основных полиаминокислот.
19. Лекарственный состав по п. 18, отличающийся тем, что вспомогательное средство представляет собой полиаргинин.
20. Лекарственный состав по п. 18, отличающийся тем, что вспомогательное средство представляет собой полилизин.
21. Лекарственный состав по любому из пп. 16-20, отличающийся тем, что вспомогательное средство конъюгировано с клеточным лигандом.
22. Лекарственный состав по п. 21, отличающийся тем, что клеточный лиганд представляет собой углеводный остаток.
23. Лекарственный состав по п. 22, отличающийся тем, что клеточный лиганд представляет собой фукозу.
24. Лекарственный состав по п. 21, отличающийся тем, что клеточный лиганд представляет собой трансферрин.
25. Лекарственный состав по любому из пп. 1-24, отличающийся тем, что дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель и представляет собой раствор
или суспензию для парэнтерального введения.
26. Лекарственный состав по любому из пп. 1-24, отличающийся тем, что представляет собой гидрогель для топической аппликации.
(56)
WO 94/27642 A1.
WO 94/16731 A1.
WO 93/07283 A1.
Изобретение относится к области иммуномодуляции и представляет собой дальнейшие разработки в области терапевтических вакцин на основе опухолевых клеток, которые,
главным образом, основаны на следующих предпосылках: на том, что существует качественная и количественная разница между опухолевыми и нормальными клетками; на том,
что иммунная система имеет принципиальное свойство распознавать эту разницу; на том,
2
BY 6399 C1
что иммунная система может быть стимулирована (посредством иммунизации с помощью
вакцин) для распознавания опухолевых клеток на основании этой разницы.
Для того чтобы добиться противоопухолевой реакции нужно выполнить, по меньшей
мере, два условия. Во-первых, необходимо экспримировать антиген против опухолевых
клеток, который не встречается в нормальных клетках или встречается ограниченно, для
того, чтобы стала возможным качественная разница между нормальной тканью и тканью
опухоли. Во-вторых, нужно соответственно активизировать иммунную систему, чтобы
она реагировала на этот антиген. Существенное затруднение в иммунотерапии опухолей
состоит в незначительной иммуногенности, прежде всего человека. На ранних этапах обнаруживают антигены, ассоциируемые с опухолями и специфичные для опухолей, которые представляют собой нео-эпитопы и могут являться потенциальными целями для атаки
иммунной системы. Если иммунной системе не удается устранить опухоли, которые экспримируют эти нео-эпитопы, то это объясняется недостаточностью иммунного ответа на
нео-антиген, а не является недостатками нео-эпитопов.
В иммунотерапии рака на клеточной основе развиваются две общие стратегии: с одной
стороны, адаптивная иммунотерапия, которая использует развитие in vitro реактивных в отношении опухоли Т-лимфоцитов и их повторное введение пациентам; с другой стороны, активная
иммунотерапия, использующая опухолевые клетки, в ожидании вызвать либо новый, либо усиленный иммунный ответ, который приведет к системному ответу опухоли. Противоопухолевые
вакцины на основе активной иммунотерапии получают различными способами; примером являются облученные опухолевые клетки, которые замещаются иммуностимулирующими вспомогательными средствами, такими как Coryntbakterbum parvum или Bacillus Calmette Guerin
(BCG), чтобы вызвать иммунную реакцию на антиген опухоли (Oettgen и Old, 1991).
В последнее время в активной иммунотерапии против рака используют генетически модифицированные опухолевые клетки. Обзор различных попыток отчуждения опухолевых
клеток путем усиления иммуногенности за счет введения различных генов дается у Zatloukal
и др., 1993. Одно из ранее известных направлений предусматривает использование опухолевых клеток, которые генетически модифицируются для продуцирования цитокина.
Идентифицирование и изолирование антигенов опухоли и ассоциированных с опухолью антигенов (Tas), а также выделяемых из них пептидов (например описанные у Wolfel
и др., 1994а и 1994b); Carrel и др. 1993, Lehman и др., 1989, Tib-bets и др. 1993, или описанные в различных опубликованных международных заявках WO 92/20356, WO 94/05304,
WO 94/23031, WO 95/00159) являются предпосылкой разработки дальнейшего направления применения антигенов опухоли в качестве иммуногенов для вакцины против опухоли,
причем как в виде белков, так и в виде пептидов. Из работ Boon и др., 1992; Boon и др.,
1994; Boon и др., 1995; van Peel и др. 1995; Van der Eynde, 1995, известно, что злокачественную меланому представляют выделяемые из опухолевых антигенов пептиды в МНС-1соответствии. С помощью противоопухолевой вакцины, представляющей собой антигены
опухоли как таковые, до сих пор не была достигнута иммуногенность, достаточная для того, чтобы вызвать клеточный иммунный ответ, который требуется для уничтожения опухолевых клеток, содержащих антиген опухоли (Marchand и др., 1995). Для достижения того, чтобы клетки, представляющие антиген ("Antigenpresenting cells", "APCs") несли на
своей поверхности определенный пептидный антиген, предлагалось "придать пульсацию"
пептидам, что в результате приводит к наполнению клеток пептидами (Tykocinski и др.,
1996). Было также отмечено, что совместное применение вспомогательных средств лишь
относительно усиливает иммунный ответ (Oettgen и Old, 1991).
Третье направление в активной иммунотерапии, ставящее задачу усиления эффективности противоопухолевых вакцин, базируется на ксеногенизированных (отчужденных)
опухолевых клетках. Эта концепция основана на предпосылке, что иммунная система реагирует на опухолевые клетки, которые экспримируют чуждый белок, и в связи с этим реа-
3
BY 6399 C1
гированием вызывается иммунный ответ против тех антигенов, которые поставляются
опухолевыми клетками вакцины.
Центральную роль в регулировании специфического иммунного ответа играет тримолекулярный комплекс, состоящий из компонентов: антиген-рецептора Т-клетки, МНС
(Major-Histocompatability Complех)-молекулы и ее лигандов, и являющийся пептидным
фрагментом, выделенным из белка.
МНС-молекулы (и соответствующие молекулы HLAs) представляют собой пептидрецепторы, которые при обязательной специфичности обеспечивают связывание многих
различных лигандов. Предпосылкой этого являются аллельспецифичные пептидные мотивы, которые обнаруживают следующие критерии специфичности: пептиды имеют определенную длину, в зависимости от МНС-гаплотипа, для MHC-I-гаплотипа, как правило, от
восьми до десяти аминокислотных остатков. Обычно две из позиций аминокислотных остатков образуют так называемый "анкер", который через одну аминокислоту или через
аминокислотный остаток окружен близко-родственными боковыми цепями. Точное положение анкерных аминокислот в пептиде и требования к их свойствам варьируются в зависимости от МНС-гаплотипов. С-термин пептидных лигандов представляет собой часто
алифатический или заряженный остаток. Такие МНС-пептид-лигандные компоненты известны до сих пор применительно к H-2Kd, Kb, Kk, Kkml, Db, HLA-A*0201, A*0205 и
В*2705 гаплотипам.
В рамках белкового обмена внутри клетки невырожденные, вырожденные и инородные генные компоненты, например вирусные белки или антигены опухоли, разлагаются
на мелкие пептиды, некоторые из которых представляют собой потенциальные лиганды
для МНС-молекул. Этим создается предпосылка для их предъявления через МНСмолекулы, следствием чего является клеточный иммунный ответ, причем, в частности еще
не до конца выяснено, каким образом пептиды вырабатываются в клетке в качестве МНСлигандов. Инородные или отчужденные белки и их фрагменты могут быть распознаны,
связаны и устранены посредством иммуноглобулина, представляющего иммунный ответ.
Это относится также ко всем антигенам опухоли: на примере антигенов МИС1, СЕА и
НЕR2/новый, ассоциируемых с опухолями, доказано, что иммуноглобулины, которые
проявляют себя специфично по отношению к этим белкам, могут распознавать и умерщвлять содержащие белок клетки. Чтобы вызвать специфический опухолево-антигенный
иммунный ответ были испытаны различные формы МИС1 и СЕА в качестве иммуногенов
(например, в рекомбинированных поксвекторах; Bronte и др., журнал Immunol. 154: 5282,
1995) в опытах на животных и при предварительных испытаниях.
В рамках предложенного изобретения были продолжены размышления, используемые
при разработках клеточной противоопухолевой вакцины: в то время, когда не злокачественные, нормальные клетки организма допускаются иммунной системой, организм реагирует на нормальную клетку, если она, например на основе вирусной инфекции, синтезирует чуждые организму белки с иммунозащитой. Причиной этого является то, что МНСмолекулы представляют чужеродные пептиды, которые относятся к чуждым организму
белкам. Как следствие иммуносистема отмечает, что с этой клеткой происходит что-то
нежелательное, чужеродное. APCs (сюда относятся макрофаги, дендритные клетки, клетки Лангергана, В-клетки, а также, возможно, недавно открытые бифенотипичные клетки,
которые проявляют свойства как В-клеток, так и макрофагов; Tykocinski и др., 1996) активируются, генерируют новый специфический иммунитет и элиминируют клетку.
Опухолевые клетки содержат соответствующие специфичные для опухоли антигены опухоли, которые не являются достаточной вакциной, т.к. на основании их незначительной иммуногенности игнорируются иммунной системой. Если опухолевая клетка нагружена не чужеродным белком, а чужеродным пептидом, то дополнительно к чужеродным пептидам также и собственные антигены опухоли этой клетки воспринимаются как чужие. В результате
4
BY 6399 C1
такого отчуждения при помощи пептида можно достичь того, что вызванный чужеродными
пептидами клеточный иммунный ответ будет обращен против антигенов опухоли.
Причина незначительной иммуногенности опухолевых клеток может быть не только
качественной, но и количественной проблемой. Для пептида, полученного от антигена
опухоли, это может означать, что он представлен МНС-молекулами, однако в концентрации, которая является незначительной, чтобы вызвать клеточный специфичный для опухоли иммунный ответ.
Увеличение количества специфичных для опухоли пептидов на опухолевой клетке
должно способствовать отчуждению опухолевой клетки, что ведет к клеточному иммунному ответу. Было предложено антиген опухоли или полученный из него пептид представить на поверхности клетки, чтобы он передавался посредством ДНК, кодирующей соответствующий белок, или пептида, как описано в международных заявках WO 92/20356,
WO 94/05303, WO 94/23031 и WO 95/00159.
В немецкой заявке на патент Р 19543649.0 представлена клеточная вакцина, содержащая
в качестве активного компонента опухолевые клетки, нагруженные одним или несколькими
пептидами таким образом, что опухолевые клетки вместе с пептидами распознаются иммунной системой индивидуума как чуждые, т.к. они могут быть с одной стороны "чужеродными
пептидами" или "ксенопептидами" - это значит, что они отличны от пептидов, полученных от
белков, которые экспримированы опухолевыми клетками индивидуума. Другая категория
пептидов получена от антигенов опухоли, которые экспримированы клетками индивидуума.
Эти пептиды другой категории способствуют повышению иммуногенности вследствие того,
что они существуют на опухолевых клетках вакцины в концентрации, которая выше, чем
концентрация тех же пептидов на опухолевых клетках индивидуума.
В основе предлагаемого изобретения лежит задача создать новый лекарственный состав, в частности вакцину с иммуномодуляторным эффектом.
В развитии концепции клеточной вакцины, опубликованной в немецкой заявке на патент
Р 19543649.0, в рамках предложенного изобретения рассматривается лекарственный состав,
содержащий пептиды с иммуномодуляторным действием не с клетками, а в сочетании со
вспомогательным средством, чтобы вызвать или усилить клеточный и/или гуморальный, преимущественно системный иммунный ответ, на патогенные возбудители или антиопухолевую
реакцию или вызвать толерантность против белков с автоиммунным действием.
Неожиданно было установлено, что определенные вспомогательные средства, например поликатионы, о которых стало известно в 1965 году, могут способствовать переносу
белков в клетках (Ryser и др., 1965; Ryser и др., 1978; Shen и др., 1981), повышают иммуногенность пептидов.
Изобретение касается лекарственного состава для иммуномодуляции, содержащего,
по меньшей мере, один обладающий иммуномодуляторным действием пептид в сочетании
со вспомогательными средствами. Состав отличается тем, что пептид является лигандом
для молекулы МНС, экспримируемой организмом подлежащего воздействию индивидуума, а вспомогательное средство обеспечивает увеличение степени связывания пептидов с
клетками организма индивидуума и усиление проникновения в клетки, а также усиление
иммуномодуляторного эффекта пептида.
В дальнейшем для краткости пептиды с иммуномодуляторным действием будут обозначены как "пептиды". Термин "пептид", если он не относится непосредственно к лигандам, может временно обозначать фрагменты белков или белки, от которых получен пептид, или представляет собой продукт клеточного распада. Под "иммуномодуляторным
действием" понимается возникновение или усиление клеточного и/или гуморального,
преимущественно системного иммунного ответа. В этой форме реального воплощения лекарственный состав, согласно изобретению, действует как вакцина. В предпочтительной
форме исполнения пептиды являются лигандами для, по меньшей мере, одной МГТСмолекулы, которая экспримируется организмом подлежащего лечению индивидуума.
5
BY 6399 C1
МНС-молекулы человека, согласно международным традициям, в дальнейшем будут
обозначены как "HLA" (Антиген лейкоцита человека).
Под "клеточным иммунным ответом" следует понимать, прежде всего, цитотоксический Т-клеточный иммунитет, который, вследствие генерирования цитотоксических CD8положительных Т-клеток и СВ4-положительных помощников-Т-клеток, способствует разрушению опухолевых клеток или клеток, пораженных патогенным возбудителем.
Под "гуморальным иммунным ответом" следует понимать выработку иммуноглобулинов,
которые селективно распознают опухолевые клетки или структуры, созданные патогенными
возбудителями, и, в дальнейшем, совместно с другими системами, как например, дополнение,
ADCC (Цитотоксичность, зависящая от антител) или фагоцитоз, способствуют разрушению
этих опухолевых клеток, патогенных возбудителей или пораженных ими клеток.
Пептид, содержащийся в вакцине, получают от антигена или он представляет собой, в
случае с белком, антиген, против которого должен быть вызван клеточный и/или гуморальный иммунный ответ. Этим достигается тот результат, что Т-клетки распознают соответственно другие цитотоксические эффекторные клетки, содержащие возбудитель болезни, опухолевые клетки, содержащие антиген, и/или генерируют антитела.
Для иммунизации против возбудителей болезней, таких как бактерии, вирусы, паразиты, применяют белки или пептиды, которые представляют собой белок соответствующего
возбудителя или происходят от него. Прежде всего, для этой цели подходят белки, которые остаются неповрежденными высокими мутационными скоплениями этих возбудителей. Например, HPV16/17 (Human Pappiloma Virus; Feltkamp и др., 1995); Hepatitis В Virus
Core Antigen (Vitiello и др., 1995), Plasmodium Bergheu (Widmann и др. 1992), Influenzavirus-Nukleoprotein/Hepatitic С Virus.
Реальным воплощением изобретения является белок, способствующий возникновению противоопухолевой реакции, антиген опухоли или пептид, происходящий от антигена опухоли; при этом в качестве противоопухолевой вакцины используют лекарственный
состав. В случае терапевтического использования вакцины пептид получают от антигена
опухоли, который экспримирован опухолевыми клетками индивидуума. Этими антигенами опухоли являются, например, такие антигены, которые экспримированы организмом
индивидуума в такой незначительной концентрации, что опухолевые клетки не распознаются как чуждые.
Антигены опухоли индивидуума могут быть определены стандартными методами в
ходе установления диагноза и выработки терапевтических мер: антигены опухоли могут
быть обнаружены самым простым способом - иммуногистохимическим при помощи антител. Если антигенами опухоли являются ферменты, например тиразиназы, они могут быть
обнаружены при помощи ферментных исследований. Для определения антигенов опухоли
с известной последовательностью может быть привлечен RT-PCR-метод (Boon, Т. и др.
1994; Coulie, P.G. и др. 1994; Weynants, P. и др., 1994). Дальнейшими методами обнаружения антигенов опухоли являются исследования на базе CTLs со спецификой, соответствующей определяемым антигенам опухоли. Исследования такого рода были описаны
Herin и др., 1987; Coulie и др.,1993; Сох и др., 1994; Rivoltini и др., 1995; Kawakami и др.,
1995, а также в международной заявке WO 94/14459. Из этих источников заимствованы
различные антигены опухоли или полученные от них пептидные эпитопы, которые применимы в рамках предложенного изобретения. Примеры используемых антигенов опухоли приведены в недавно опубликованных обзорных статьях авторов Rosenberg, 1996 и
Henderson Firm, 1996.
Относительно используемых антигенов опухоли данное изобретение не подлежит ограничению.
Противоопухолевая вакцина, содержащая антиген опухоли или происходящий от него
пептид, может использоваться не только для терапевтических, но и для профилактических
целей. При профилактическом применении целесообразно назначать смесь пептидов, про6
BY 6399 C1
исходящих от представителей часто встречающихся антигенов опухоли. При терапевтическом применении противоопухолевой вакцины используют один или более пептидов,
причем считают, что они присутствуют в антигенах опухоли индивидуума. Противоопухолевая вакцина, согласно изобретению, по сравнению с клеточной вакциной имеет то
преимущество, что она полезна индивидууму на относительно ранней стадии (стадия I и
II) заболевания, когда еще нельзя получить достаточно опухолевых клеток для изготовления клеточной вакцины.
В предпочтительном реальном воплощении изобретения пептид, ввиду возникновения
клеточного иммунного ответа, согласуется с MHC-I- или МНС-II-подтипами вакцинируемого индивидуума. Таким образом, пептид проявляет или содержит последовательность,
которая обеспечивает его связывание с МНС-молекулой.
Другое реальное воплощение лекарственного состава в виде противоопухолевой вакцины содержит, кроме всего прочего, полипептид, обладающий иммуностимулирующим
действием, в частности цитокин. В предпочтительной форме реального воплощения изобретения в качестве цитокина используют интерлейкин 2(IL-2) или GM-CSF, например, в
дозировке около 1000 единиц; другие примеры для цитокина: IL-4, IL-12, IFN-α, IFN-β,
IFN-γ, IFN-ω, TNF-α, а также их сочетания, например, IL-2 + IFN- γ, IL-2 + I1L-4, IL2 + TNF-α или TNF-α + IFN-γ.
Лекарственный состав в реальном воплощении согласно изобретению служит цели
достижения устойчивости по отношению к белкам или фрагментам белков, которые вызывают аутоиммуноиндуцированные заболевания, то есть используется для терапии аутоиммунных заболеваний. Пептиды, используемые в этой реальной форме воплощения изобретения, происходят от белков, вызывающих аутоиммунные заболевания.
В противоположность применению предмета изобретения, в качестве противоопухолевой вакцины или в качестве вакцины против патогенных возбудителей, в которой пептиды сочетаются с участком исходного белка (опухолевый антиген или белок патогенного
возбудителя) по существу таким образом, что пептид распознается в качестве "оригинального антигена", при реализации настоящего изобретения для лечения аутоиммунных заболеваний и других подобных заболеваний используют пептиды, которые проявляют по отношению к аминокислотной последовательности исходного белка критические отличия.
Эти пептиды на основе их анкерных позиций связаны с МНС-молекулой, однако проявляют в своей последовательности мутации, которые являются причиной того, что они
функционируют в качестве антагонистов, снова отключающих активированные специфические Т-клетки (Kerch и Alien, 1996).
В качестве пептидных антагонистов подходят как натуральные антагонисты, обнаруженные в вирусах (Bertoletti и др., 1994), так и антагонисты, которые были найдены в результате систематических исследований, например благодаря просеиванию пептидных
библиотек. Примером пептидных антагонистов являются пептиды, которые способны отключать Т-клетки, специфичные для белка Myelin Basic. Они были испытаны на эффективность в экспериментах на животных (Brocke, 1996).
Пептид, который должен вызвать клеточный иммунный ответ, должен быть связан с
МНС-молекулой. Чтобы иметь следствием иммунный ответ в организме индивидуума,
подвергаемый лечению индивидуум должен иметь в своем организме соответствующую
HLA-молекулу. Определение HLA-подтипа индивидуума представляет собой, применительно к возникновению клеточного иммунного ответа, одну из существенных предпосылок для эффективного использования пептида для данного индивидуума.
HLA-подтип пациента может быть определен стандартными методами, например тестом на микролимфотоксичность (Практическая иммунология, 1989). Этот тест основан на
принципе, при котором изолированные из крови пациента лимфоциты смешивают с лечебной сывороткой или с моноклональным антителом против определенной HLAмолекулы в присутствии дополнения (С) кролика. Положительные клетки растворяются и
7
BY 6399 C1
способны принять краситель индикатора, в то время как неповрежденные клетки остаются
неокрашенными.
Для определения HLA-I или HLA-II-гаплотипа индивидуума может быть также привлечена RT-PCR ("Revers Transcriptase Polymerase Chain Reaction") (Curr. Prot. Mol. Biol.
главы 2 и 15). Для осуществления этого исследования у индивидуума берут кровь и изолируют из нее РНК. Эту РНК подвергают обратному преобразованию, вследствие чего
возникает кДНК индивидуума. кДНК служит матрицей для полимерной цепной реакции с
исходными парами, которые специфически вызывают увеличение DNA-фрагмента, соответствующего определенному HLA-гаплотипу. Если после агаростворчатого электрофореза появляется ДНК-полоса, организм индивидуума экспримирует соответствующую HLAмолекулу. Если полоса не возникает, пациент в этом отношении негативен.
Определение используемого согласно изобретению пептида при помощи HLAмолекулы происходит относительно его анкерных аминокислот и его длины; установленные анкерные позиции и длина гарантируют, что пептид вписывается в пептидную связующую борозду соответствующей HLA-молекулы индивидуума. Следствием этого является стимулирование иммунной системы и возникновение клеточного иммунного ответа,
который, в случае использования происходящего от опухолевого антигена пептида, направлен против опухолевых клеток индивидуума.
Пептиды, используемые в рамках предложенного изобретения, присутствуют в значительной по ширине полосе. Их последовательность может быть получена от иммуногенных белков естественного происхождения или их продуктов клеточного распада, например от вирусных или бактериальных пептидов, от опухолевых антигенов; они могут быть
также антагонистами пептидов, происходящих от белков, индуцированных от аутоиммунных заболеваний.
Соответствующие пептиды могут быть подобраны на основании известных из литературы пептидных последовательностей.
В виду возникновения клеточного иммунного ответа могут быть определены пептиды,
например на основании пептидов, полученных от иммуногенных белков различного происхождения (описанных применительно к различным HLA-мотивам авторами Rammensee
и др., 1993, Rammensee и др., 1995, Falk и др., 1991) и которые вписываются в связующую
борозду молекул соответствующего HLA-подтипа.
Для пептидов, проявляющих частичную последовательность белка с иммуногенным
действием, на основании уже известных или при необходимости еще устанавливаемых
полипептидных последовательностей, посредством коррекции последовательностей с учетом HLA-специфических требований может быть установлено, какие пептиды представляют подходящих кандидатов. Примеры подходящих пептидов можно найти, например, у
Rammensee и др., 1993, Falk и др., 1991, и Rammensee, 1995, а также в международной заявке WO 91/09869 (HIV-пептиды); пептиды, происходящие от опухолевых антигенов,
описаны в опубликованных международных заявках на патент WO 95/00159, WO
94/05304. Ссылки даются на библиографические источники и на цитируемые в связи с
рассматриваемой проблемой статьи. К предпочитаемым кандидатам относятся пептиды,
иммуногенность которых уже обнаружена, то есть пептиды, происходящие от известных
иммуногенов, например вирусных или бактериальных белков.
Вместо использования оригинальных пептидов, которые подходят к связующим бороздам MHC-I- или МНС-II молекул, то есть пептидов, происходящих неизменными от белков
естественного происхождения при помощи установленных минимальных требований относительно анкерных позиций и длины на основании последовательности оригинальных пептидов, могут быть произведены изменения, если в результате этих изменений будет не только
не снижена, но преимущественно усилена эффективная иммуногенность пептида, которая состоит в его соединительном химическом сродстве с МНС-молекулой и его способности стимулировать рецепторы Т-клеток. В этом случае, согласно изобретению, используют пептиды
8
BY 6399 C1
искусственного происхождения, которые синтезируют в соответствии с требованиями их
способности связываться с МНС-молекулой. Так, например, исходя из Н2-Кd-лиганд Ley Phe
Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile (LFEAIEGFI), могут быть изменены аминокислоты, не являющиеся
анкерными аминокислотами, чтобы получить пептид последовательности Phe Phe Ila Gly Ala
Leu Glu Glu Ile (FFIGALEEI); кроме того, анкерная аминокислота Ilе в позиции 9 может быть
заменена на Leu. Обнаружение эпитопов MHC-I- или МНС-II-лиганд или их вариаций может
быть достигнуто согласно методике, описанной у Rammensee и др., 1995. Длина пептида соответствует, в случае его согласования с MHC-I молекулой, преимущественно минимальной
последовательности от 8 до 10 аминокислот с необходимыми анкерными аминокислотами.
МНС-II-соединительный мотив, который распространяется на новые аминокислоты, обнаруживает повышенную степень вырождения в анкерных позициях. Недавно на основании рентгеноструктурного анализа МНС-II-молекул были разработаны методики, делающие возможным точный анализ МНС-II-соединительных мотивов и, исходя из этого, вариаций пептидных последовательностей (Rammensee и др., 1995 и цитируемые там оригинальные
библиографические источники).
При необходимости, пептид может быть удлинен на С- и/или на Т-термин, поскольку
такое удлинение не нарушает способности пептида связываться с МНС-молекулой и поскольку удлиненный пептид может на клеточном уровне реагировать на минимальную
последовательность.
В реальном воплощении изобретения пептид заряжен отрицательно. Благодаря этому,
пептид может быть удлинен отрицательно заряженными аминокислотами или отрицательно заряженные аминокислоты могут быть внедрены в пептид преимущественно в позициях, не являющихся необходимыми для распознавания через специфические CTLs, или
в качестве анкерных аминокислот для достижения электростатического связывания пептида с поликатионным вспомогательным средством, таким как полилизин.
В реальном воплощении изобретения антиген присутствует не в форме пептида, а в
форме белка, фрагмента белка или смеси белков или белковых фрагментов. В рамках
предложенного изобретения используют большие фрагменты белков или целые белки, от
которых можно гарантированно ожидать, что они после применения APCs пациентом
преобразуются в пептиды, которые подходят МНС-молекуле.
Белок представляет собой антиген или опухолевый антиген, от которого произведены сохраняемые после преобразования осколки. В этой форме реального воплощения изобретения
вспомогательное средство служит цели сделать возможным или усилить напряжение клеток,
особенно APCs как дендритных клеток или макрофагов, опухолевыми антигенами или фрагментами. Воспринимаемые таким образом белки или фрагменты белков преобразуются клетками и могут, сообразно с этим, быть представлены в МНС-соответствии иммуноэффектных
клеток и таким образом вызывают или усиливают иммунный ответ (Braciale и Braciale, 1991;
Kovacsovics Bankavski и Rock, 1995; York und Rock, 1996).
Реальное воплощение изобретения, в котором белки или большие фрагменты белков
введены в качестве антигенов, имеет то преимущество, что сохраняется незначительная
зависимость от HLA-типа индивидуума, так как белок распадается на большое количество
осколков и таким образом становится возможным изменение в большом диапазоне "подходящих" форм пептида.
В случае введения белков или фрагментов белков можно подтвердить идентичность
преобразованных конечных продуктов посредством химического анализа (расщепление
по Эдману или масс-спектрометрия преобразованных фрагментов; см. обзорную статью
Rammensee и др., 1995, а также цитируемые в ней библиографические источники) или
биологических испытаний (способность APCs к стимулированию Т-клеток, являющихся
специфическими для преобразованных фрагментов).
9
BY 6399 C1
Выбор пептидных кандидатов, способных вызвать клеточный иммунный ответ, осуществляют, традиционно, в несколько этапов. В целом кандидатов проверяют при помощи
теста, прежде всего, на их способность связываться с МНС-молекулой.
Используемый при этом метод исследования основан на способности пептидов стабилизировать пустые МНС-молекулы, как это описано, например, у Stuber и др., 1994, и
McIntyre и др., 1996. При этом пептид наносится на клетки, способные экспримировать
соответствующую МНС-молекулу, но не связывающие вследствие генетического дефекта
эндогенные пептиды в МНС-соответствие. Подходящими клеточными линиями этого типа
являются RMA-S (мыши) и Т2 (человека) или их трансформируемые варианты. Таким образом могут быть обнаружены только стабилизированные от соответствующего пептида
МНС-молекулы. Это достигается преимущественно посредством FACS-анализа, который
основан на проточной цитометрии (Flow Cytometry, 1989; FACS Vantage TM Users Guide,
1994, Cell Quest TM User's Guide, 1994). Стабильные МНС-молекулы обнаруживаются
подходящим анти-МНС-антителом и вторым (например поликлональным) антителом, которое метят флуоресцентным красителем, например FITC (Fluoresceinisothiocyanat). Лазером определенной длины волны в потоке стимулируют отдельные клетки; измеряют излучаемую флуоресценцию, которая зависит от количества пептидов, связанных с клеткой.
Другим методом определения связанного с клеткой количества пептидов является
Scatchard-Plot, как описано у Sette и др., 1994. Для этой цели используют пептид, помеченный, например, I125. Этот пептид инкубируют в течение ночи с изолированными или полученными рекомбинантно МНС-молекулами при температуре 4 °С при различно дефинированных концентрациях пептида. Для определения неспецифического взаимодействия пептида
в некоторых испытаниях добавляют избыток немеченных пептидов, которые парализуют неспецифическое взаимодействие меченых пептидов. Затем неспецифически связанный пептид
удаляют, например при помощи гелиевой хроматографии. Количество связанных пептидов
определяют в сцинциляционном счетчике на основании эмитированной радиоактивности.
Обработку полученных данных осуществляют стандартными методами.
Обзор методов для характеристики МНС/пептидного взаимодействия, анализа МНСлиганд и пептидных соединительных испытаний, осуществляемых в рамках предложенного изобретения, можно найти у Rammensee и др. 1995.
На следующем этапе пептидные кандидаты с хорошим качеством сцепления проверяют на их иммуногенность.
Возникновение клеточного иммунного ответа может быть подтверждено путем определения пептидоспецифического CTLs, например при помощи метода, описанного в
Current Protocols in Immunology, глава 3, или у Blomberg и др., 1993. Другое определение
наличия клеточного иммунного ответа дается тогда, когда при отсутствии Т-клеток у подопытного животного (что достигается путем лечения животного антителами, которые
смещают CD4- или CD8-клетки) не возникает иммунный ответ (Current Protocols in
Immunology. Глава 3).
Клеточный иммунный ответ может быть проявлен также путем определения реакции
"задержанной сверхчувствительности" - DTH-реакции у иммунизированных животных.
Для этого в подошву лап мышей впрыскивают пептиды, после чего измеряют степень
припухлости места инъекции (Grohman и др., 1995; Puccetti и др., 1994).
Индукция гуморального иммунного ответа посредством пептидов, являющихся чуждыми организму антигенами, которые экспримированы подлежащим лечению организмом
в незначительной концентрации, может быть определена путем обнаружения специфических антител в сыворотке. Для определения титра антитела в сыворотке используют Enzyme Linked Immunoassay (ELISA). При этом специфические антитела определяют по их
связыванию с используемым для иммунизации пептидом при помощи цветной реакции.
Альтернативным методом является Western Blot. При этом специфические антитела сыворотки связаны с иммобилизированным на мембране пептидом. Связанные антитела в за10
BY 6399 C1
заключение снова подтверждаются цветной реакцией (ссылка на оба метода приведена в
Current Protocols in Immunology. Редактор Coligan и др., 1991).
Прежде всего, после вакцинирования при помощи чужеродных антигенов, например
вирусного происхождения, следует ожидать образования антител. Не исключено, что специфические антитела могут быть образованы взамен мутированных или переэкспримированных пептидов, происходящих от клеточных опухолевых антигенов. Разрушение опухоли такими антителами может происходить после связывания антител с опухолевыми
клетками при помощи других компонентов иммунной системы. В качестве других компонентов могут быть использованы, например, зависящая от антител цитотоксичность
(ADCC) или фагоцитоз посредством макрофагов (Roitt I.M., Brostoff I., Male D.K. Immunology, Churchill Living-stone).
Возникновение клеточного иммунного ответа при помощи пептидов, полученных от
белков, иммуногенное действие которых неизвестно, может быть подвергнуто тестированию, как это описано у Rivoltini и др., 1995, или у Kawakami и др., 1994а. Для этого требуются Т-клетки, которые способны распознать нужный пептид, если он представлен
МНС-молекулами. В случае наличия пептидов, которые происходят от опухолевых клеток, соответствующие Т-клетки получают из опухолево-инфильтрированных лимфоцитов
(TILs), как это описано у Kawakami и др., 1994b; в случае наличия чужеродных пептидов
такие Т-клетки получают аналогично из периферийной крови. Т-клетки инкубируют при
помощи клеточных линий, например Т2 (Alexander и др., 1989) или RMA-S (Каrre и др.,
1986), смешанных с соответствующим пептидом, и растворяют их, если речь идет об иммуногенном пептиде.
Еще одна возможность тестирования связанных с МНС пептидных кандидатов на их
иммуногенность состоит в исследовании соединения пептидов с Т2-клетками. Такой тест
основан на особенности Т2-клеток (Alexander и др., 1989) или RMA-S-клеток (Karre и др.,
1986) проявлять себя дефектно в ТАР-пептидном механизме переноса и представлять стабильно МНС-молекулы только тогда, когда на них нанесены пептиды, представленные в
МНС-соответствии. Для теста используют, например, Т2-клетки или RMA-S-клетки, которые стабильно переносятся при помощи HLA-гена, например HLA-A1- и/или НLА-А2генами. Если клетки смешаны с пептидами, являющимися хорошими HLA-лигандами, в
то время как они представлены в HLA-соответствии, таким образом, что могут быть распознаны иммунной системой как чужеродные, такие пептиды способствуют тому, что
HLA-молекулы содержатся на поверхности клетки в значительном количестве. Определение HLAs на поверхности клетки, например при помощи моноклональных антител, позволяет идентифицировать подходящие пептиды (Malnati и др., 1995; Sykulev и др., 1994). В
этом случае целесообразно использовать стандартный пептид с хорошей HLAспособностью связывания.
В виду широкой применимости лекарственного состава, согласно изобретению, целесообразно использовать смесь нескольких пептидов, каждый из которых может быть связан с другой МНС-молекулой, преимущественно с одним из двух или трех наиболее часто
встречающихся МНС-подтипов. С помощью вакцины на основе смеси пептидов, которые
могут быть связаны с этими гаплотипами, может быть охвачен широкий круг пациентов.
В реальном воплощении изобретения вакцина может содержать большие последовательности пептидов. Применяемые пептиды могут в этом случае, с одной стороны, отличаться тем, что они связаны с различными HLA-подтипами. Этим достигается то, что охватываются большие или все без исключения HLA-подтипы одного пациента или большой группы пациентов.
Дальнейшая, при известных условиях дополнительная изменчивость используемых
пептидов может состоять в том, что пептиды, связанные с определенным HLA-подтипом,
отличаются относительно их (не для HLA-соединения) определяющей последовательности, в то время как они происходят, например, от разных белков тех же патогенных возбу11
BY 6399 C1
дителей или от различных возбудителей. От такой изменчивости может быть достигнуто
усиление стимулирования иммунного ответа или иммунизация против различных возбудителей.
Количество действующих пептидов в составе согласно изобретению может варьироваться в широком диапазоне. Количество пептидов зависит, в частности, от рода применения и соответствующего формулярия. Вводимое количество пептидов должно составлять от порядка 10 мкг до порядка 5000 мкг на дозу, в целом - от 1,0 мкг до порядка 1000
мкг, в частности от порядка 10 мкг до порядка 500 мкг. Введение может проводиться одно- или многократно, при многократном применении целесообразно ограничиться минимум трехкратным введением. В частности, при терапевтическом использовании применение может осуществляться с интервалами (например от 1 × в неделю до 1 × в месяц) в течение любого по длительности промежутка времени, который зависит от специфического
иммунного статуса пациента или течения болезни.
Лекарственный состав, согласно изобретению, может применяться также ex vivo:
принцип возможного применения состоит в том, что APCs, например, дендритные клетки,
культивируют ex vivo, клеточную культуру инкубируют с составом согласно изобретению
и APCs, которые представляют пептид в МНС-соответствии, вводят подвергаемому лечению пациенту. Для этого варианта применения используют известные из библиографических источников методы, например, как описано у Porgador и Gilboa, 1995; Young и Inabe,
1996.
Содержащееся в составе согласно изобретению вспомогательное средство обладает
свойствами облегчать поступление пептидов в клетки или связывание пептида с клетками
пациента и усиливать иммуногенность пептида. Вспомогательное средство может, например, по меньшей мере кратковременно, делать проницаемыми мембраны клеток, в которые должен попасть пептид, чтобы способствовать его проникновению в клетку. Может
быть предпочтительным, но не обязательным, чтобы пептид был связан со вспомогательным средством, например, через электростатическое взаимодействие между электропроницаемым пептидом и поликатионным вспомогательным средством. Введение пептида в
клетку может быть вызвано тем, что пептид на основании своей пространственной близости к клеточной мембране может сквозь нее проникать, как только вспомогательное средство обеспечит ее абсорбцию. Действие вспомогательного средства может быть основано
на том, что оно увеличивает критическую для проникновения в клетку концентрацию пептида на поверхности клетки, или оно осуществляет фагоцитоз или жидкостное перемещение пептида в клетку.
Является неожиданным то, что присутствие вспомогательного средства усиливает не
только проникновение пептида в клетку, но и обусловливает усиление иммуномодуляторного действия пептида, которое может быть сведено к корректному предъявлению пептида через МНС-молекулы.
В лекарственном составе могут присутствовать вспомогательные средства, а также
практически все мембранопроницаемые субстанции, которые используются для переноса
нуклеиновых кислот в клетки; в этой связи дана ссылка на публикацию международной
заявки WO 93/19768, где приведены субстанции такого рода.
В предпочтительной форме воплощения изобретения вспомогательное средство представляет собой основную полиаминокислоту или смесь основных полиаминокислот.
Степень полимеризации полиаминокислот может варьироваться в широком диапазоне.
Она составляет от порядка 5 до порядка 1000, в частности от порядка 15 до порядка 500.
Преимущественно в рамках предлагаемого изобретения в качестве вспомогательного
средства используют полиаргинин.
Другим предпочтительным вспомогательным средством в рамках предлагаемого изобретения является полилизин.
12
BY 6399 C1
Примерами других подходящих, в частности, поликатионных органических соединений (основных полиаминокислот) являются полиорнитин, гистон, протамин, полиэтиленимин или их смеси.
Вспомогательное средство, при необходимости, может быть связано с клеточными лигандами, например с трансферрином, gp 120, LDL (низкоплотный гипопротеин), αфетуином, EGF (фактор эпидермального роста)-пептидами или с представителем других
клеточных лигандов, которые описаны в международной заявке WO 93/07283, для переноса ДНК посредством рецепторно передающегося эндоцитоза, углеводными остатками,
например маннозой или фукозой (лиганды для микрофагов) или антителами (или их
фрагментами) вместо белков на поверхности клетки. При необходимости используют поликатионные вспомогательные средства, например полиаргинин или полилизин, которые
при известных условиях связаны с клеточными лигандами как составная часть комплекса
с ДНК, например в форме плазмида-ДНК.
ДНК может быть свободна от последовательностей, которые кодируют функциональные белки, в этом случае ДНК является пустым плазмидом.
В реальном воплощении изобретения ДНК содержит последовательности, которые
кодируют иммуномодуляторные белки, в частности цитокин, например IL-2, интерферон,
GM-CSF.
Чтобы исследовать механизм переноса пептидов посредством основных полиаминокислот, в рамках предлагаемого изобретения измеряют выделение лактатдегидрогеназы
(LDH). В то время как в обрабатываемых полиаргининовых пробах концентрации выделенных LDH практически не были обнаружены, после инкубации с полилизином в клеточных избыточных состояниях были обнаружены высокие концентрации LDH. Эти результаты позволяют сделать вывод, что воздействие полилизина может быть сведено к
проницаемости клеточной мембраны.
Не ограничиваясь теорией, можно сказать, что действие лекарственного состава согласно изобретению состоит в том, что пептид при помощи вспомогательного средства
проникает в представляющие собой цель клетки или связывается с клетками, которые
встречаются в эндотермальном слое кожи. Целевыми клетками могут являться такие
представляющие антиген клетки, от которых пептид при известных условиях после осуществления процесса может быть представлен В- и/или Т-клетками. Примерами целевых
клеток являются макрофаги, фибробласты, кератиноциты, клетки Лангеранса, дендритные
клетки или β-клетки.
В рамках предлагаемого изобретения было исследовано, могут ли маленькие пептиды
в присутствии основных полиаминокислот или гликозилированных форм поликатионов
быть приняты в увеличенном объеме подобными макрофагами, представляющими антиген клетками (APCs). По результатам исследования остатков сахара стало известно, что
они принимаются макрофагами через опосредованный рецепторами эндоцитоз. Наблюдение за APCs позволило установить, что они представляют собой in vivo (в живом организме) тип клеток, который принимает пептиды и представляет их другим иммунным клеткам. Результаты опытов in vitro (вне организма), которые показывают, что APCs в присутствии тестированных вспомогательных средств эндоцитируют повышенное количество
пептидных антигенов, являются ссылкой на то, что эти вспомогательные средства способны также in vivo (в организме) усиливать предъявление пептидов по отношению к цитотоксическим эффекторным клеткам, а также вызывать их активирование, что приводит к
усилению иммунного ответа против содержащейся в вакцине мишени.
В качестве вспомогательных средств могут быть использованы также при известных
условиях дополнительно к упомянутым выше вспомогательным средствам компоненты в
форме частиц. Для частиц подходят материалы, которые используют для синтеза пептидов, например силикагель или искусственная смола, поскольку они являются физиологически восприимчивыми и из них возможно получить частицы, которые достаточно малы
13
BY 6399 C1
для возможности проникновения в клетку. При помощи вспомогательных средств в форме
частиц можно получить высокие локальные концентрации пептида, что облегчает его
"принятие" клеткой.
Вид принимаемого вспомогательного средства, целесообразность его модификации
при помощи клеточных лигандов или добавления ДНК, а также требуемое количество
вспомогательного средства по отношению к пептиду могут быть определены эмпирически, например произвольно выбранное соотношение пептида к вспомогательному средству (которое может принципиально колебаться в широком диапазоне), может быть
определено посредством титрования.
Испытание вспомогательных средств может осуществляться в принципе теми же методами, что и испытание пептидов, при известных условиях в несколько этапов.
Способность вспомогательного средства повышать связывание и/или проникновение
внутрь пептида с APCs может быть измерена, например на первом этапе, когда APCs инкубируют с меченным флуоресцентным веществом пептидами и вспомогательным средством. Обусловленное вспомогательным средством повышенное принятие или связывание
может быть определено методом проточной цитометрии через сравнение с клетками, которые смешаны только с пептидами.
На втором этапе испытываемые in vitro (вне организма) вспомогательные средства могут быть исследованы на предмет того, воздействует ли и в каком масштабе их наличие в
присутствии пептида на APCs, причем по описанным выше для испытания пептидов методам может быть измерена МНС- концентрация на клетках.
Следующая возможность для испытания эффективности вспомогательного средства
заключается в применении in vitro моделирующей системы. При этом APCs инкубируют
вместе со вспомогательным средством и пептидом и измеряют относительное активирование Т-клеточного клона, который специфически распознает используемый пептид
(Coligan 1991, Lopez 1993).
Эффективность формулировки может быть также доказана через клеточный иммунный ответ посредством подтверждения "задержанной сверхчувствительности" (DТН)-реакции
у иммунизированных животных.
В заключение, иммуномодуляторную эффективность формулировки определяют в
опыте над животными. Для этого могут быть введены в действие также модели опухолей,
известными пептидными последовательностями, распознаваемыми по иммунным клеткам.
Вакцина, содержащая пептид и вспомогательное средство, может применяться в варьируемых соотношениях, касательно пептида к вспомогательному средству и общему количеству. Степень защиты от роста опухоли является мерой эффективности противоопухолевой вакцины.
Лекарственный состав может приниматься парентерально, топически, орально или локально. Преимущественно его применяют парентерально, например подкожно, внутрикожно или внутримышечно, предпочтительно подкожно или внутрикожно, чтобы, прежде
всего, достичь кожных клеток (кератиноциты, фибробласты), дендритных клеток, клеток
Лангерганса или макрофагов в качестве клеток-мишеней. В рамках опухолевой терапии
противоопухолевая вакцина может применяться также внутриопухолево.
Состав для парентерального применения согласно изобретению представлен в виде
раствора или суспензии пептидов и вспомогательного средства в фармацевтически приемлемом носителе, преимущественно водном носителе. В качестве водного носителя могут
быть использованы, например, вода, буферная вода, солевой раствор (0,4 %), раствор глицина (0,3 %), гиалуроновая кислота и аналогичные известные носители. Помимо водных
носителей могут быть использованы такие растворители, как, например, диметилсульфоксид, пропиленгликоль, диметилформамид и их смеси. Состав может, кроме того, содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, например буферные вещества, а также неорганические соли для достижения нормального осмотического давле14
BY 6399 C1
ния и/или эффективной лиофилизации. Примерами такого рода добавок являются соли
натрия и калия, например хлориды и фосфаты, сахароза, глюкоза, белковые гидролизаты,
декстран, поливинилпирролидон или полиэтиленгликоль. Составы могут быть стабилизированы при помощи традиционных приемов, например при помощи стерильной фильтрации. Состав в этой форме может быть расфасован непосредственно или лиофизирован и
перед употреблением смешан со стерильным раствором.
В реальном воплощении лекарственный состав согласно изобретению представлен в
форме для топического применения, например для дермального или трансдермального
применения. Лекарственный состав может быть представлен, например в виде гидрогеля
на основе полиакриловой кислоты или полиакриламида (Dolobene®, Merckle), в виде мази, например с полиэтиленгликолем (PEG) в качестве воспринимающей среды, как, например, стандартная мазь DA В 8 (50 % PEG 300, 50 % PEG 1500), или в виде эмульсии,
прежде всего микроэмульсии на основе "вода в масле" или "масло в воде", при необходимости с добавкой из липосом. В качестве ускорителя проникания подходят, в частности,
производные сульфоксида, например диметилсульфоксид или децилметилсульфоксид, а
также транскутол (диэтиленгликольмоноэтилэфир) или циклодекстрины, пирролидоны,
например 2-пирролидон, N-метил-2-пирролидон, 2-пирролидон-5-карбоновая кислота или
биологически расщепляемый N-(2-гидроксиэтил)-2-пирролидон и их сложный эфир жирной
кислоты, производные карбамида, как, например, додецилкарбамид, 1,3-дидодецилкарбамид
и 1,3-дифенилкарбамид, терпены, например D-димоны, ментон, а-терпинол, карвол, лимонооксид или 1,8-синеол.
Другими формами реального воплощения являются аэрозоли, например для применения в качестве распыления в нос или для ингаляции.
Состав согласно изобретению может быть введен также при помощи липосом, представленных в форме эмульсий, пены, мицеллы, нерастворимых монослоев, фосфолипидных дисперсий, слоистых пластов и подобных им веществ. Эти средства, при помощи которых вводят состав, являются воспринимающей средой для целенаправленной доставки
пептидов к определенной ткани, например, лимфоидной или опухолевой, или для увеличения времени полуобмена пептида.
В случае реального воплощения состава согласно изобретению в локальной форме он
может содержать также УФ-абсорбер, что при профилактическом применении против меланомы он действовал в то же время, как средство защиты от солнца.
Специалист может выбрать подходящие вспомогательные материалы и формы из
"Remington's Pharmaceutical Sciences" 1990.
Перечень чертежей
Фиг. 1: Вакцинирование DBA/2 мышей против мастоцитомы Р815 при помощи пептида KYQAVTTTL
Фиг. 2: Вакцинирование DBA/2 мышей против мастоцитомы Р815 при помощи пептида SYFPEITHI
Фиг. 3: Вакцинирование DBA 2-мышей против мастоцитомы Р815 при помощи
SYFPEITHI
Фиг. 4: Вакцинирование DBA/2 мышей против меланомы М-3 смесью пептидов
Фиг. 5: Вакцинирование DBA/2 мышей против меланомы М-3 топическим методом
применения лекарства
Фиг. 6: Вакцинирование DBA/2 мышей против меланомы М-3 метастазов
Фиг. 7: Лечение имеющих М-3 микрометастазы мышей путем вакцинирования смесью
пептидов
Фиг. 8: Опосредованное полилизином наполнение клеток тирозиназой
Фиг. 9: Активирование Т-клеток терапевтической модели после вакцинирования (IFNγ-выделение из клеток селезенки вакцинированных животных как реакция на М-3-клетки)
15
BY 6399 C1
Фиг. 10: Индукция антивирусного иммунитета посредством инфлуэнцануклеокапсидпептида ASNENMETM и фукозилированного полилизина в качестве вспомогательного
средства (CTL-активирование)
Фиг. 11: Усиление связывания пептидов с APCs при помощи основных полиаминокислот
Фиг. 12: Обеспечение проницаемости клеточной мембраны при помощи основных полиаминокислот (LDH-выделение после обработки клеток полилизином или полиаргинином)
Фиг. 13: Введение полиаргинина внутрь пептидов
Фиг. 14: Перемещение пептидов из костного мозга в клетки, представляющие
антиген
Фиг. 15: Повышение эффективности перемещения пептидов в клетки, представляющие антиген, при помощи поликатионоактивных полиаминокислот и гистонов
Фиг. 16: Эффективность перемещения в зависимости от степени полимеризации основных аминокислот
Фиг. 17: Перемещение пептидов с полиаргининами, обладающими низким молекулярным весом
Фиг. 18: Влияние на эффективность перемещения в зависимости от заряда пептида.
В следующих примерах, если нет специальных указаний, были использованы следующие материалы и методики:
A) Клетки
a) клеточные линии
Меланомные клеточные линии мышей Cloudman S91 (Клон М-3; АТСС № CCL 53.1),
мастоцитомные клеточные линии Р815 (АТСС № Т1В 64) и моноцито-макрофаговые клеточные линии P388D1 (АТТС Т1В 63) получают от АТСС. Клетки культивируют в DMEMсреде с высоким содержанием глюкозы ("High Glucose DMEM, life Technologies) с добавлением 10 % FCS', 2 мМ L-глутамина и 20 мкг/мл гентамицина. Клетки подвергают обычным испытаниям на отсутствие заражения микоплазмой (PCR - Mycoplasma Detection Kit, Stratagene).
Муриновая клеточная линия RMA/S (лимфома мыши) описана у Каrrе и др., 1986 и у
Ljunggren и др., 1990.
b) представляющие антиген клетки из костного мозга.
Прежде всего, продувают бедренные кости DBA/2-мышей. Клетки костного мозга
культивируют в DMEM-среде с высоким содержанием глюкозы с добавлением 10 % FCS,
5 % лошадиной сыворотки, 2 мМ L-глутамина и 20 мкг/мл гентамицина в присутствии 200
единиц/мл GM-CSF-мыши (Li и др., 1989; Genzyme Cambridge, MA, USA). Все 24 часа в
течение первых пяти дней замене подвергают две трети среды, чтобы удалить не связанные с ней гранулоциты и В-клетки (Inaba и др., 1992). Как связанные, так и свободные
клетки собирают в промежутке между 8 и 10 днями в результате инкубации с PBS/5 мМ
EDTA и при плотности 3×104 клеток на гнездо высевают на предметное стекло 8гнездового микроскопа (Nunc, Roskidle, Danemark). Более 90 % клеток проявляет положительную реакцию с антителом F4/80 (Endogen, Cambridg, MA, USA).
B) Синтез пептидов
Пептиды синтезируют в пептидном синтезаторе (Модель 433А с Feedbackmonitor, Applied Biosystems, Foster City, Kanada) при использовании TentaGel S PHB (Rapp, Tubingen)
в качестве твердой фазы по методу с применением 9-флуоренилметоксикарбонила
(HBTU-активирование Fastmocтм, масштаб 0:25 мМ). Пептиды растворяют в 1М ТЕАА, рН
7,3 и подвергают очистке методом обратной хроматографии в Vydac С 18 - колонне. Последовательности подтверждают масс-спектрометрией с применением аппарата MAT Lasermat (Finnigan, San Jose, Kanada).
16
BY 6399 C1
С) Перечень используемых пептидов
Пептид обоПринадлежащий
Последовательность
значение
к нему антиген
КРЕР117
SYFPEITHI
КРЕР118
КРЕР162
КРЕР163
КРЕР164
КРЕР143
КРЕР145
КРЕР146
КРЕР150
KYQAVTTTL
GPPHSNNFGY
ISTQNHRAL
LPYLGWLVF
RYAEDYEEL
PYLEQASRI
YYVSRDTLI
YYSVKKTFL
ASNENMETM
Тирозинкиназа
JAK1
Тum-Р198
Тum-Р358
Р91А
Р815
trp-1
тирозиназа
тирозиназа
trp-1
инфлуэнцануклеокапсидпептид
Аминокислота
Нумерация в
белке
МНС-гаплотип
355-363
H2-Kd
14-22
4-13
12-20
35-43
H2-Kd
H2-Dd
H2-Ld
H2-Ld
H2-Kd
H2-Kd
H2-Kd
H2-Kd
H2-Kb
Пептидные смеси
Пептидная смесь I для М-3 противомеланомной вакцины:
Крер143, kpep145, kpep146, kpep150.
Пептидная смесь III противомастоцитомной Р815 вакцины:
kpep117, kpep118, kpep162, kpep163, kpep164.
D) Изготовление вакцины
D1) Однопептидные вакцины
a) Для изготовления однопептидной контрольной вакцины без вспомогательного средства берут пептид в концентрации 1 мг/мл в PBS. Инкубационный период до момента
инъекции составляет 4 часа при комнатной температуре.
b) Однопептидные вакцины с полилизином (если в дальнейшем не указано ничего
другого, используют полилизин, длина цепи которого равна 200) в качестве вспомогательного средства готовят путем смешивания пептида и полилизина в указанных количествах в HBS. Инкубационный период до момента инъекции составляет 4 часа при комнатной температуре.
1) Для получения вакцины с содержанием 16 мк/г эффективного пептида смешивают
11,8 мкг полилизина с 160 мкг пептида kpep117 в общем объеме в 1 мл HBS.
2) Для получения вакцины с содержанием 100 мкг эффективного пептида смешивают
74 мкг полилизина с 1 мг пептида kpep117 в общем объеме 1 мл HBS.
с) Однопептидную контрольную вакцину с Incomplete Freund's Adjuvans (вспомогательным средством) (IFA) готовят в результате эмульгирования пептида и IFA в указанных количествах. Инкубационный период до момента инъекции составляет 30 мин при
комнатной температуре.
1) Для контрольной вакцины, содержащей 16 мкг эффективного пептида, эмульгируют 192 мкг пептида kpep117 в 600 мкл HBS с 600 мкл IFA.
2) Для контрольной вакцины, содержащей 100 мкг эффективного пептида, эмульгируют 1,2 мкг пептида kpep117 в 600 мкл HBS с 600 мкл IFA.
D2) Пептидные смеси в качестве вакцины
а) Пептидная смесь I в качестве контрольной вакцины без вспомогательного средства
с содержанием 250 мкг каждого пептида kpep143, kpep145, kpep146, kpep150 в общем объеме в 1 мл PBS.
17
BY 6399 C1
b) Пептидная смесь III в качестве контрольной вакцины без вспомогательного средства с содержанием 250 мкг каждого пептида kpep117, kpep118, kpep162, kpep163, kpep164 в
общем объеме в 1 мл PBS.
c) Пептидную смесь в качестве вакцины с полилизином в качестве вспомогательного
средства готовят в результате смешивания 1 мг пептидной смеси I (содержащей 250 мкг
каждого пептида) с 74 мкг полилизина в HBS. Инкубационный период до момента инъекции составляет 4 часа при комнатной температуре.
d) Пептидную смесь III в качестве вакцины с полилизином, используемым как вспомогательное средство, готовят в результате смешивания 1,25 мкг пептидной смеси III (содержащей 250 мкг каждого пептида) с 93 мкг полилизина с HBS. Инкубационный период
до момента инъекции составляет 4 часа при комнатной температуре.
e) Пептидную смесь I в качестве контрольной вакцины с вспомогательным средством
готовят в результате эмульгирования 1,2 мг пептидной смеси I в 600 мкл HBS (с содержанием 300 мкг каждого пептида) с 600 мкл IFА. Инкубационный период до момента инъекции составляет 30 минут при комнатной температуре.
f) Пептидную смесь III в качестве контрольной вакцины с вспомогательным средством
готовят в результате эмульгирования 1,5 мг пептидной смеси III в 600 мкл HBS (с содержанием 300 мкг каждого пептида) с 600 мкл IFA. Инкубационный период до момента
инъекции составляет 30 минут при комнатной температуре.
g) Для топического применения с полилизином в качестве вспомогательного средства
инкубируют 1 мг пептидной смеси I (содержащей 250 мкг каждого пептида) с 74 мкг полилизина в течение 4 часов в общем объеме в 400 мкл HBS. Полученную смесь добавляют
в 1,6 гидрогели DOLOVENE (Merckle).
h) Для топического применения контрольной вакцины без вспомогательного средства
1 мг пептидной смеси I (содержащей 250 мкг каждого пептида) в общем объеме в 200 мкл
HBS добавляют в 1,8 г гидрогели DOLOVENE (Merckle).
i) Изготовление связанного с фукозой полилизина (длина цепи: 240 или 220) осуществляют в соответствии с методом, описанным у MacBroom и др. 1992, причем достигается
замещение около 40 % (исходные материалы β-фукопираносильфенилизотиоционат и полилизин получают от SIGMA).
j) Если используют конъюгаты трансферрин/полилизин (способ изготовления описан в
международной заявке WO 93/07283), количество устанавливают таким образом, что абсолютное количество полилизина составляет 75 мкг на мг пептида. Если плазмидную
ДНК (пустой плазмид pSP65, LPS-свободный, Boehringer Mannheim) интегрируют в комплексе, соотношение составляет 37,5 мкг DNA / 75 мкг полилизина / 1 мг пептида. В случае использования 160 мкг вместо 1 мг пептида количество других компонентов сокращают на тот же коэффициент (6,25).
Е) Инъекция вакцины
Перед проведением подкожной инъекции мышей в группах до 8 животных подвергают анестезии в изолированной воздушной камере. После 3,5 мин обработки галотаном
(4 % в О2, процент выделения 4) мыши около 1 минуты находятся под наркозом; в это
время подкожно впрыскивают вакцину.
Внутрибрюшную инъекцию проводят без предварительной анестезии.
Объем инъекции каждой вакцины составляет 100 мкл на животное, что соответствует
100 мкл одиночного пептида или пептидной смеси I на животное. В случае применения
пептидной смеси объем инъекции каждой вакцины составляет 100 мкл на животное, что
соответствует 100 мкл одиночного пептида или пептидной смеси I на животное. В случае
применения пептидной смеси III каждой мыши вводят 125 мкг общего пептидного количества.
18
BY 6399 C1
F) Топическое применение вакцины
На одну мышь берут 200 мг мази, содержащей 100 мкг пептида или пептидной смеси I
или 125 мкг пептидной смеси I. Мазь втирают в кожу выбритых животных, а именно во
всю поверхность спины и в уши. Точное количество втираемой мази контролируют при
помощи весов.
G) Применение вакцины против роста опухоли на мышах
Протокол испытания эффективности противораковой вакцины в профилактических
или терапевтических целях на мышах соответствует, если не было специальных указаний,
описанному в международной заявке WO 94/21808 принципу, причем в качестве мышиной модели используют DBA/2-модель.
Пример 1
Вакцинирование DВА/2 мышей против мастоцитомы Р815
160 мкг пептида последовательности KYQAVTTTL (kpep118), полученного от описанного у Lethe и др., 1992 опухолевого антигена Р198, лиганда H2-Kd, смешивают с 11,8 мкг
полилизина 300 в 500 мкл HBS и инкубируют в течение 4 часов при комнатной температуре. Затем добавляют 500 мкл EBSS (Earl's буферный солевой раствор). По 100 мкл полученной смеси вводят подкожно восьми мышам с недельным интервалом. После этой
предварительной иммунации неделю спустя появляются опухоли, причем каждой мыши
контралатерально вводят 5×104 клеток мастоцитомной клеточной линии Р815 (АТСС Nr
TIB 64; эти клетки экспримируют опухолевый антиген, от которого получают пептид
kpep118) в 100 мкл EBSS. Результат этого опыта представлен на фиг. 1 (закрашенные
квадраты).
В параллельно проводимом опыте смешивают 200 мкг пептида с 500 мкл HBS и затем
эмульгируют с 500 мкл вспомогательного средства. Предварительной иммунизации (по
100 мкл полученной эмульсии) подвергают восемь мышей, которым затем пересаживают
с помощью клеток Р815 опухоли, как описано выше (фиг. 1: закрашенные кружки).
Для проведения следующего параллельного опыта клеточную противоопухолевую
вакцину готовят следующим образом:
160 мкг пептида kpep118 смешивают с 3 мкг трансферрин-полилизина (ТfpL), 10 мкг
pL и 6 мкг плазмида psp 65 (LPS-свободный) в 500 мкл HBS-буфера. После 30 минут выдержки при комнатной температуре вышеупомянутый раствор добавляют в склянку с Т
75-клеточной культурой, содержащей 1,5 × 106 клеток аллогенной фибробластовой клеточной линии NIHH3T3 (АТСС Nr CRL 1658) в 20 мкл DMEM-среды (10 % FCS, 20 мМ
глюкозы) и инкубируют при 37 °С. Три часа спустя клетки смешивают с 15 мл свежей
среды и инкубируют в течение ночи при 37 °С и 5 % СО2. За 4 часа до применения клетки
облучают 20 Gy. Приготовление вакцины осуществляют по способу, описанному в международной заявке WO 94/21808. Предварительную иммунизацию при помощи этой вакцины проводят с недельным интервалом в объеме 105 клеток. Неделю спустя фиксируют
появление опухоли, как описано выше (фиг. 1: закрашенные треугольники). Обнаружено,
что вакцина, содержащая пептид с полилизином, наилучшим образом защищает мышей от
образования опухоли.
Пример 2
Вакцинирование DВА/2 мышей против мастоцитомы Р815 при помощи однопептидной вакцины
а) Три однопептидных вакцины, содержащих либо один пептид kpep117 в PBS
(фиг. 2а), либо пептид kpep117, эмульгированный в IF А (фиг. 2b), либо пептид kpep117 с
полилизином (длина цепи 240) в качестве вспомогательного средства (фиг. 2с) испытывают на их защитное действие против появления Р815-опухоли.
19
BY 6399 C1
Вакцины готовят по способу, описанному в разделе D. Объем инъекции составляет
каждый раз 100 мкл; инъекцию проводят подкожно (sc) или внутрибрюшинно (ip). Неинъекцированные мыши служат для негативного контроля, целоклеточная вакцина, состоящая из Р815-клеток, выделяющих GM-CSF - для позитивного контроля (P815-GM-CSF;
105 клеток в 100 мкл на мышь были введены подкожно). Каждая экспериментальная группа состоит из восьми животных, проводят три вакцинирования (sc) с интервалом в 7 дней.
Неделю спустя после последнего вакцинирования животные получают контралатеральный опухолевый вызов от 5 × 104 Р815-клеток. Животные ежедневно подвергают осмотру,
возникновение опухолей контролируют с недельным интервалом.
Пептид kpep117 с полилизином в качестве вспомогательного средства проявляет лучший противоопухолевый эффект при впрыскивании по 100 мкг на животное подкожно
(защищенными оказались три из восьми животных). Этот эффект также хорош, как эффект, достигаемый при помощи целоклеточной вакцины (защищенными оказались четыре
из восьми животных). Впрыскивание 16 мкл пептида с полилизином на одно животное
менее эффективно (защищенными оказались два животных), но явно лучше, чем впрыскивание 100 мкл пептида в PBS (фиг. 2а, отсутствие защитного эффекта). Также пептид,
эмульгированный в IFA, не дает того эффекта, который достигается в сочетании с полилизином (фиг. 2с).
b) В следующем эксперименте на Р815-мастоцитомных мышах сравнивают два немодифицированных полилизина с различной длиной цепи: короткой, из 16 лизиновых групп
(pL16) и длинной, из 240 групп (pL240). Животным из контрольных групп впрыскивают
от 100 мкг пептида kpep117, растворенного в PBS или эмульгированного в IFA. Две клеточные контрольные вакцины, выделяющие GM-CSF, используют в качестве позитивного
контроля (vgl.a), причем одну вакцину получают из стабильно переносимых Р815-клеток,
а вторая вакцина - посредством скоротечного перемещения по методу (AVET), описанному у Wagner и др., 1992. Обе цельноклеточные вакцины обеспечивают четырем-пяти из
восьми животных защиту. Вакцины на основе пептидов, состоящие из одного пептида или
из пептида, эмульгированного в IFА, не проявляют защитного эффекта: у всех животных
вскоре после появления опухоли, последняя начинает развиваться. Если, однако, применяют пептид с полилизином, вакцина защищает животных против появления опухоли: два
из восьми животных защищены, если используют длинный полилизин (рl 240) и четыре из
восьми животных в случае использования короткого полилизина. Эти результаты, представленные на фиг. 3, показывают, что единичный пептид в сочетании с полилизином в
качестве вспомогательного средства вызывает эффективную противоопухолевую защиту,
сравнимую с защитой, обеспечиваемой эффективной целоклеточной вакциной, выделяющей цитокин, которая в литературе фигурирует в качестве стандарта при антиопухолевом
вакцинировании (Dranoff и др., 1993; Schmidt и др., 1995).
Пример 3
Вакцинирование DBA2 мышей против мастоцитомы Р815 при помощи противоопухолевой вакцины, содержащей Р815-единичные пептиды или смеси Р815-пептидов
Для приготовления вакцины используют следующие пептиды:
Крер118 (100 мкг на инъекцию)
Пептидная смесь III (kpep117, kpep118, kpep162, kpep163, kpep164). Эта пептидная
смесь содержит все доныне известные Р815-пептиды; за одну инъекцию вводят 25 мкг каждого пептида.
В качестве позитивного контроля используют Р815-клетки, выделяющие GM-CSF.
В процессе предварительного испытания kpep117 проявляет себя как пептид с лучшим
защитным действием против появления Р815-опухоли, если используют 100 мкг пептида
вместе с полилизином (7,5 мкг полилизина / 100 мкг пептида в соответствии со стандартным соотношением; полилизин: длина цепи = 200). Незначительное количество (16 мкг)
20
BY 6399 C1
kpep117 менее эффективно. В этом примере впрыскивают по 100 мкг kpep118 на животное, а именно один раз только с полилизином (группа В), один раз с трансферринполилизином (группа С) и один раз с трансферрин-полилизином / ДНК (группа D). В качестве контроля используют kpep118 с IFA. В этом эксперименте один kpep118 не проявляет защитного действия против появления опухоли.
В проведенных в примере 4 опытах показано, что вакцина, содержащая пептидную
смесь из меланомных пептидов, обнаруживает защитный эффект против меланомы. Отсюда
в этом примере было протестировано, подходит ли концепция пептидной смеси для Р815.
Пептидную смесь III применяют один раз только с полилизином (группа Е), один раз с
трансферрин-полилизином (группа F) и один раз с трансферрин-полилизином / DNA
(группа G). В качестве контроля используют пептидную смесь III в IFA. В качестве негативного контроля используют мыши; в качестве позитивного контроля - перенесенные
GM-CSF P815-клетки (105 клеток на мышь).
Проведенные в этом примере опыты разрабатывались, в сравнении с другими опытами, нетипично: в группе позитивного контроля (GM-CSF выделяющие клетки) у всех животных вскоре после появления опухоли происходило ее развитие, причем большая часть
этих опухолей также быстро исчезала, как и появлялась. Возможное объяснение этому заключается в том, что опухоль некоторое время развивалась, прежде чем она была разрушена. Другое возможное объяснение заключается в том, что диагностированное как опухоль вздутие проистекало не от роста опухоли, а являлось сильным иммуноклеточным
инфильтратом (гранулемой). Так как животные не подвергались вскрытию, причина не
была окончательно установлена; во всяком случае, предполагаемые опухоли были, в конце концов, уничтожены. Другой интересный результат был получен в группе G, в которой
животные были подвергнуты лечению при помощи сочетания пептидной смеси III и полилизина. У всех животных развивались опухоли, но у двух из всех животных величина
вздутия (или иммуноклеточного инфильтрата) была относительно незначительной, не
увеличивалась, и мыши не выглядели нездоровыми. Оба этих животных не были умерщвлены и находились под дальнейшим наблюдением. Неожиданно девять недель спустя после появления опухоль обнаружена не была: результат до сих пор не наблюдаемый. Два из
восьми животных уничтожили, в конце концов, свое опухолевое бремя. Уничтожение
опухолей могло быть также объяснено содержанием kpep117 в пептидной смеси, что аналогично примеру 2, где два из восьми животных были защищены при помощи 16 мкг
kpep117, и три из восьми животных - при помощи 100 мкг kpep117. Защитный эффект мог,
тем не менее, быть вызван более чем одним пептидом смеси.
Пример 4
Защита DВА/2 мышей от меланомы М-3 путем предварительной иммунизации с помощью противоопухолевой вакцины, содержащей смесь пептидов
Применяют профилактическую вакцину, содержащую смесь меланомных пептидов
(пептидная смесь I, раздел D2).
Порядок проведения предварительной иммунизации при помощи вакцины, а также
появление опухоли соответствует порядку, описанному в примере 2, с той разницей, что
появление опухоли вызывают использованием М-3-клеток (105 клеток на животное). В качестве контрольной вакцины используют целоклеточную вакцину из М-3-клеток, которая
выделяет оптимальное количество IL-2 (1000-2000 единиц на 105 клеток) и изготовлена по
способу, описанному у Schmidt и др., 1995. При избранных условиях испытаний эта вакцина позволяет получить 100 %-ную защиту (фиг. 4). Четырем группам подопытных животных вводят вакцины с пептидной смесью. Две группы получают (либо sc, либо ip) пептиды, эмульгированные в IFА. Другие две группы получают (либо sc, либо ip) пептиды
вместе с полилизином (pL240).
21
BY 6399 C1
Фиг. 4 иллюстрирует защитный эффект пептидной вакцины с полилизином (pL240) в
качестве вспомогательного средства; 50 % подвергнутых лечению мышей были защищены от М-3 опухолевого вызова по сравнению с неподвергнутыми лечению животными, у
которых очень быстро образовались значительные опухоли. Этот эффект мог быть достигнут только при подкожном впрыскивании пептидно-полилизиновой вакцины или при
нанесении на кожу гидрогеля (фиг. 5). В трех других контрольных группах мышей, которые подвергались лечению при помощи пептид/полилизиновых вакцин i.p. или при помощи пептидов в IFА, вакцина была в основном неэффективна. Предполагаемые опухоли не
были отторгнуты и развивались, в сравнении с опухолями неподвергнутых лечению контрольных животных, с незначительным замедлением. Эти результаты показывают, что
вакцина, содержащая пептидную смесь, позволяет достичь противоопухолевого защитного эффекта, если она содержит полилизин. При избранных условиях испытаний эта пептидная вакцина была наполовину менее эффективна, чем клеточная IL-2-вакцина, которая
в соответствии с появившимися недавно сообщениями (Zatioukal, 1993, Zatioukal, 1995)
защищает до 100 % животных от появления опухоли за счет использования 10 живых М3-клеток.
Пример 5
Защита DВА/2 мышей от М-3 метастазов
а) Применяют терапевтическую вакцину, содержащую смесь меланомных пептидов
(пептидная смесь I, описанная в разделе D2). Проводят три вакцинирования (sc) с недельным интервалом. Первое вакцинирование проводят пять дней спустя после появления метастазов; делают прививку против пятидневных метастазов. 1,2 × 104 М-3 клеток вводят
для образования метастазов; используют технологию, описанную в международной заявке
WO 94/21808 и у Schmidt и др., 1996.
В качестве вакцины используют пептидную смесь I: без вспомогательного средства
(pepmix I PBS), с IFA в качестве вспомогательного средства (IFA pepmix I) или с фукозомодифицированным полилизином (fpl pepmix I). Контрольные группы мышей не получают никакой вакцины (неинъецированные) или получают приведенную в примере 4 вырабатывающую IL-2 М-3-целоклеточную вакцину. Из фиг. 6 видно, что лучшая степень защиты была достигнута в группе, в которой применялась пептидная смесь I с фукозомодифицированным полилизином в качестве вспомогательного средства (фиг. 6а). 50 %
мышей смогли отторгнуть метастазы (четыре мыши из восьми). Этот способ лечения был
даже эффективнее, чем способ применения целоклеточной вакцины, который позволил
защитить только 33 % мышей (три из девяти). Применение пептидной вакцины с IFA или
без вспомогательного средства привело исключительно к замедлению прирастания метастазов опухоли (фиг. 6b).
b) В следующем эксперименте на терапевтической модели исследуют защитный эффект вакцины, содержащей пептидную смесь I и вводимой подкожно. Контрольные группы мышей получают пептидную смесь в PBS (без вспомогательного средства) или с IFA.
В качестве вспомогательного средства используют немодифицированный полилизин 240.
Кроме того, в качестве вспомогательного средства используют фукозо-модифицированный
полилизин 200 (fpl200). В качестве контроля в этом эксперименте участвует группа животных с IL-2 экспримирующей клеточной вакциной. Как показано на фиг. 7 а, вакцина
пептид/полилизин при лечении М-3-метастазов оказалась эффективной. Характерная
норма исцеления в этом эксперименте была достигнута лишь при использовании фукозомодифицированного полилизина. При лечении таким способом 50 % животных отторгли
метастазы, что в сравнении с применением IL-2-вакцины, которая позволяет в этом случае
вылечить 70 % животных, является хорошим результатом.
с) В следующем эксперименте на терапевтической модели тестируют, как изменения и
модификации отражаются на противоопухолевом эффекте. При этом дополнительно к не22
BY 6399 C1
модифицированному и к фукозо-модифицированному полилизину 200 тестируют короткий немодифицированный полилизин pL16, длинный полилизин pL450 и следующий поликатион, а именно полиаргинин (pArg720). В качестве позитивного контроля используют
клеточную М-3-вакцину, выделяющую оптимальное количество (≥10 ng 105 клеток) GMCSF (Schmidt, 1995). Также в этом опыте контрольные группы содержат пептидную смесь
в IFA или без любого вспомогательного средства. Как и в примере 5b), лучший эффект
был достигнут, если в качестве вспомогательного средства был использован фукозополилизин, фиг. 7b. В этих группах 40 % животных отторгли метастазы, в сравнении с
30 % в группе с использованием короткого полилизина рL16. Кроме группы, которая получила пептиды вместе с полиаргинином, у животных других групп, которым была введена пептидная вакцина, было отмечено лишь непродолжительное замедление при возникновении опухолей. Немодифицированный полиаргинин был в этом эксперименте также
эффективен, как фукозо-модифицированный полилизин, что привело к отторжению метастазов у четырех животных из десяти.
Фиг. 7 иллюстрирует повторение этого обусловленного полиаргинином эффекта в независимом эксперименте. Здесь также вакцинирование при помощи пептидной смеси в
сочетании с полиаргинином позволило достичь у четырех из восьми подвергнутых лечению животных противоопухолевого эффекта.
Пример 6
Наполнение клеток тирозиназой при использовании полилизина в качестве вспомогательного средства
Этот пример служит в качестве опыта, который показывает, что полилизин, как вспомогательное средство, пригоден для наполнения клеток большими фрагментами белка или
целыми белками, причем в качестве клеток были использованы замещающие М-3-клетки.
Для наполнения клеток 160 мкг FITC-маркированной тирозиназы (ЕС 1.14.18.1; сигма)
смешивают с 3 мкг полилизина (pL240) и в течение 3 часов инкубируют при комнатной
температуре. Затем полученный раствор помещают в склянку с клеточной культурой Т75
с объемом 2 × 106 М-3 клеток и инкубируют при температуре 37 °С. Затем клетки дважды
промывают PBS, отделяют при помощи PBS/2 мМ EDTA и смешивают с 1 мл PBS/5 %
FCS для проведения FACS-анализа. Фиг. 8 иллюстрирует наполнение М-3-клеток тирозиназой (левая кривая показывает контроль, правая - степень наполнения тирозиназой).
Пример 7
Определение активирования Т-клеток после иммунизации на терапевтической модели
После того как вакцина пептид/поликатион на терапевтической модели мыши (см.
пример 5) однозначно продемонстрировала свою эффективность, было исследовано, ведет
ли этот способ лечения к активированию Т-клеток. Для этого проводят секрецию цитокина в качестве маркера после инкубации клеток селезенки вакцинированных животных с
парентеральными М-3-клетками (Kawakami и др., 1994b).
Готовят одноклеточные суспензии селезенки вакцинированных и не подвергнутых лечению животных, что произошло благодаря эритроцитомизу с гипотоническим буфером
(0,15 NH4Cl, 1 мМ КНСО3, 0,1 мМ EDTA, ph 7,4). Связанные клетки удаляют, в то время
как 3 × 106 клеток селезенки на мл DMEM - среды (10 % FCS) инкубируют в чашках Петри в течение 90 минут при температуре 37 °С. Связанные клетки путем осторожного отбора при помощи пипетки и совместного культивирования с 1 × 103 парентальными клетками культивируют в различных количественных соотношениях. Клетки культивируют в
200 мкл DMEM- среды (10 % FCS), 2 мМ L-глутамина и 20 мкг гентамицина в 96 гнездовых плоскодонных чашках для тканевой культуры. На девятый день собирают 100 мкл состава и соответствующее IFN-γ - содержание замеряют с использованием коммерчески
приобретенных комплектов ELISA-приборов (Endogen, Camdridg, MA, USA) в соответст23
BY 6399 C1
вии с инструкцией изготовителя. Выяснилось, что после девятидневной инкубации большие количества IFN-γ в среду выделяли только клетки селезенки вакцинированных животных, в то время как в Co-культуре клеток селезенки не подвергнутых лечению животных и М-3-клеток практически не было обнаружено IFN-γ. Результат этого эксперимента
представлен на фиг. 9.
Пример 8
Индукция антивирусного иммунитета при помощи инфлюэнцануклеокапсидпептида
ASNENMETM и фукозилированного полилизина в качестве вспомогательного средства
Вводят в действие вакцину, содержащую на 1 мг пептида ASNENMETM 75 мкг fpLys.
Вакцину вводят путем разовой инъекции, как указано в методическом разделе, причем на
животное приходит 100 мкг пептида / 7,5 мкг fphys. Для контроля проводят инъекцию 100 мкг
одиночного пептида (PBS) и соответственно не проводят никакой инъекции (безинъекционный контроль).
RMA-S мышиные лимфомные клетки инкубируют в течение ночи в бессывороточной
среде при температуре 260 °С с 10 мкг/мл пептида ASNENMETM.
10 дней спустя после вакцинирования клетки селезенки вакцинированных животных
изолируют, смешивают с наполненными пептидом RMA-S-клетками в соотношении 5:1 и
культивируют в течение еще пяти дней (Stuber и др., 1994). Определяют число уцелевших действующих клеток селезенки в различных культурах. Затем для определения CTL-активности
посредством стандартного 4-х часового исследования на выделение европия (Blomberg и др.,
1993), клетки смешивают в различных соотношениях с RMA-S клетками, которые прежде разбавляют пептидом ASNENMETM и внутрикомплексным соединением европия. Как иллюстрирует фиг. 10 специфический иммунитет в этом эксперименте был достигнут только благодаря
вакцинированию с пептидом и fpLys, но не в случае, если был введен один пептид.
Пример 9
Испытание различных основных полиаминокислот на их способность усиливать проникание внутрь и/или связывание пептидов с APCs
Для реализации этих испытаний проводят флуоресцентные исследования: модель пептидного антигена последовательности LFEAIEGFI (МСН Kd-ограниченные) помечают
флуоресцентным красителем Fluoresceinisothiocyanat (FITC) в соответствии с инструкцией
изготовителя (Molecular Probes). Прием или связывание помеченного FITC пептида одного (импульсное) или вместе с различными концентрациями основных аминокислот (полилизин с длиной цепи от 16 до 490, полиаргинин с длиной цепи от 15 до 720) через МНС
Kd-ограниченную моноцито-макрофаговую клеточную линию P388D1 определяют методом проточной цитометрии. Для этого 1 × 106 P388D1 клеток инкубируют в конечном
объеме 1 мл среды (DMEM/10 % FCS) в трубках центрифуги с 5 мкг FITC-меченного пептида одного или со смесью пептида и полиаминокислот в течение 30 минут при температуре 37 °С, а затем интенсивно промывают, чтобы удалить несвязанный пептид. Полиаминокислоты добавляют в концентрации 50, 25, 12, 6 и 3 мкг на мл среды, содержащей 5
мкг FITC-меченного пептида. Сравнивают относительную флуоресцентную интенсивность различных испытаний, чтобы оценить эффективность приема и/или связывания
пептида. Результат этих испытаний представлен на фиг. 11; испытания проводят соответственно с 25 мкг pL450 или PArg450. При избранных условиях полиаргинин проявил себя
почти в пять раз эффективнее, чем полилизин.
Пример 10
Исследование механизма, посредством которого APCs принимает пептиды
Пептиды могут быть приняты APCs посредством специфических механизмов, таких как,
например, макропиноцитоз или рецепторно опосредованный эндоцитоз (Lanzavecchia, 1996).
24
BY 6399 C1
Альтернативный механизм состоит в том, что полиаминокислоты могут делать клеточную
мембрану проницаемой и таким образом способствуют диффузии пептидов из среды в цитоплазму.
а) Стала ли клеточная мембрана проницаемой проверяют путем измерения выделения
цитоплазматического фермента лактатдегидрогеназы (LDH) после инкубации Р388D1клеток с полиаминокислотами (полилизин или полиаргинин) при изотонических условиях
с использованием имеющихся в продаже приборных комплектов (Cytotox 96, Promega,
Madison, Wisconsin, USA) в соответствии с инструкциями изготовителя. На основании
приведенных на фиг. 12b результатов можно предположить - действие pLys состоит в том,
что он делает клеточную мембрану проницаемой, что проявляется в высоких концентрациях выделяемого при изотонических условиях цитоплазматического фермента. В противоположность этому после использования pArg (фиг. 12b) LDH практически не обнаруживается. При сравнении проб с использованием только полиаминокислот и проб с использованием смесей полилизина или полиаргинина с пептидом не было установлено
различий в выделении LDH. После инкубации только с пептидом не было обнаружено измеримой LDH-активности.
b) Произошло ли проникновение внутрь меченных FITC-пептидов в присутствии или
при отсутствии основных полиаминокислот исследуют на основании опубликованного
Midoux и др., 1993 принципа. От клеток попавшие внутрь частицы переносятся к эндосомам. По сравнению с цитоплазмой или средой клеточной культуры нейтральные рНвеличины показывают, что эти органеллы с величиной рН порядка 5 - кислые. Эмитируемая FITC флуоресценция очень зависит от рН. В среде с рН-условиями, как они имеют
место в эндосомах, флуоресценция подавлена. Отсюда меченные FITC-пептиды, которые
от клеток передаются эндосомами, показывают уменьшенную флуоресценцию. При добавлении монензина низкое рН-значение эндосом нейтрализуется, что ведет к измеримой
усиленной флуоресценции попавших внутрь меченных FITC пептидов.
Клетки инкубируют со смесью из полиаргинина (средняя величина молекулярного веса 100.000, длина цепи 490) и флуоресцентно меченного пептида при температуре 4 °С
или 37 °С. Число инкубированных при 37 °С проб сохраняют и перед проточноцитометрическим анализом при температуре 4 °С обрабатывают 50 мкМ монензина.
Это позволяет обнаружить, что инкубирование APCs с определенными основными
аминокислотами, например полилизином (pLys) и полиаргинином (pArg), усиливает прием или связывание пептида с APCs.
Как следует из фиг. 13, в клетках, обработанных только пептидом или с монензином,
наблюдается незначительное увеличение флуоресценции. В противоположность этому
флуоресцентные сигналы в пробах, обработанных монензином и смесью из полиаргинина
и пептида, были сильно увеличены. Приема пептидов не наблюдалось, если пробы были
инкубированы при 4 °С. Характерное увеличение флуоресценции после обработки монензином указывает на то, что вызванная pArg наполняемость приводит к аккумулированию
пептидов в везикулах внутри клеток (Midoux и др., 1993; фиг. 13). Как и следовало ожидать,
после обработки монензином наполненных полилизином проб наблюдается незначительное
увеличение флуоресценции. Наполнение полилизином при 4 °С обусловило измеряемое увеличение флуоресценции, что является дальнейшим указанием на то, что действие полилизина
сводится главным образом к проницаемости клеточных мембран (фиг. 12b).
Пример 11
Исследование наполнения APCs короткими пептидами
APCs, выделенные из костного мозга и сохраняемые при помощи GM-CSF, исследуют
комбинацией флуоресцентно меченного пептида с полилизином (pL200; SIGMA) или
только пептидом методом флуоресцентной микроскопии. Для обнаружения приема пептидов при помощи микроскопа на предметное стекло высеивают APCs и инкубируют с 40 мкг
25
BY 6399 C1
флуоресцентно меченного пептида LFEAIEGFI или со смесью из 50 мкг/мл полилизина
(pL200) и 40 мкг пептида LFEAIEGFI в течение 30 минут при температуре 37 °С. После
тщательного промывания клетки фиксируют 4 %-ным параформальдегидом, покрывают
антиобесцвечивателем (Dako, Glostrup, Danemark) и флуоресцентно микроскопированы
(Zeiss). Ядра окрашивают в контрастные цвета при помощи 4,6-диамедино-2-фенилиндола
(DAPI, SIGMA). Как показано на флуоресцентной микрофотографии, фиг. 14, клетки, инкубированные с пептидом и полилизином (А), по сравнению с клетками, обработанными
только пептидом (В), проявляют явно повышенную степень приема пептидов. В то время как
флуоресценция обработанных только пептидом (импульсная) клеток проявляется выборочно
и в форме частиц, интенсивная флуоресценция обработанных в присутствии полилизина и
пептида клеток проявляется не локализованно и равномернее распределена по клетке.
Пример 12
Количественное определение наполнения клеток пептидом методом проточной цитометрии
а) После того, как в результате проведенных согласно примеру 11 опытах, было показано, что APCs являются для наполнения маленькими пептидами замечательными клетками-целями, in vitro (вне организма) проводят FACS-испытания с целью идентифицировать
подходящие для пептидной вакцины вспомогательные средства. Это исследование делает
возможным быстрое количественное испытание флуоресцентномеченных пептидов; в качестве пептидной модели используется пептид последовательности LFEAIEGFI. В этих
опытах в качестве APCs используют мышиные клеточные линии P388D1 1 × 106 клеток в
конечном объеме в 1 мл DMEM-среды с высоким содержанием глюкозы и 10 % FCS инкубируют в течение 30 минут при 37 °С с 5 мкг пептида с флуорсцентной конечной концентрацией в 5 ммоль/мл. Клетки обрабатывают либо только пептидами, либо комбинацией пептида с поликатионами или пептида с гистонами при возрастающей концентрации
(от 3 до 50 мкг/мл), как показано на фиг. 15. Используют следующие соединения: А: полиорнитин (средний диапазон молекулярного веса 110,000 длина цепи 580); В: насыщенный аргинином гистон; С: насыщенный лизином гистон; D: полиаргинин (средний диапазон молекулярного веса 100,000, длина цепи 490); Е: полилизин (средний диапазон молекулярного веса 94,000, длина цепи 450). В предварительных испытаниях было
установлено, что инкубационный период в 30 минут выявил максимальную степень приема пептидов. Более длительный период обработки (4-8 часов) не выявил характерного
усиления флуоресцентного сигнала. Перед проведением анализа клетки были 5х промыты
большим объемом PBS, содержащим 0,2 % BSA. Клетки в 1 мл ледяного PBS / 0,2 % BSA
были снова восприняты и исследованы методом проточной цитометрии (FACScan; Becton
Dicknson, San Jose, CA, USA).
Полиаргинин и полилизин проявляют себя самыми эффективными вспомогательными
средствами; полиорнитин проявляет при избранных условиях цитотоксический эффект.
Усиление приема пептидов, благодаря полиаргинину и полилизину, соотносится с концентрацией (фиг. 15 d, e); степень приема возрастает в соответствии с длиной цепи
(фиг. 16).
Обнаружено, что полиаргинин с увеличением в 0,3 раза относительно контрольной
величины проявляет более широкий подходящий диапазон концентрации, чем полилизин,
который показывает максимальное увеличение менее чем в 0,2 раза, и что полиаргинин
при всех используемых длинах цепи для переноса белков эффективнее, чем полилизин
(фиг. 16): полиаргинин делает возможным эффективный перенос при таких низких концентрациях, как 3 мкг/мл, в то время как для полилизина необходимы концентрации
25 мкг/мл, чтобы вызвать характерное увеличение флуоресценции (фиг. 15 d, e).
Чтобы установить, существует ли при переносе пептидов нижняя граница длины цепи,
синтезируют полиаргинины различной длины цепи (10-30 групп) и исследуют их на спо26
BY 6399 C1
собность повышать перенос пептидов при высоких концентрациях поликатионов
(фиг. 17). Для этих опытов используют пептид LFEAIEGFI, испытываемые полимеры полиаргинина вводят в действие в концентрации 100 мкг/мл.
Даже незначительное увеличение переноса пептидов было обнаружено уже при самом
коротком испытуемом полиаргинине.
с) Основные аминокислоты - это положительно заряженные молекулы. Отсюда можно
предположить, что отрицательно заряженные пептиды посредством электростатического
взаимодействия могут связываться с этими поликатионами, что, возможно, приводит к
усиленному приему пептидов. Чтобы проверить эту гипотезу была сопоставлена способность катионоактивных полиаминокислот принимать короткие пептиды в зависимости от
их заряда в Р388D1-клетках. В следующей таблице представлены используемые отрицательно заряженные пептиды, которые отвечают всем условиям, необходимым для МНС-1соединения (Rammensee и др., 1995). Пептид 1 получен от TRP мыши (протеин из семейства тирозиназы), пептид 2 - от инфлуэнца гемаглутинина (Schmidt и др., 1996), пептид 3 от тирозиназы мыши, пептид 4 - от Р198 опухолевого антигена, пептид 5 - от бетагалактозидазы (Gavin и др., 1993). (Mr относится к диапазону молекулярного веса, "fluor" - к
флуоресцеину).
Последовательность
YAEDYEEL
LFEAIEGFI
IFMNGTMSQV
KYQAVTTTL
TPHPARIGL
Mr
1031
1038
1127
1024
961
Mr fluor
1389
1396
1485
1382
1319
Таблица
заряд
заряд + fluor
4 x отрицательный 6 х положительный
2 х отрицательный 4 х положительный
нейтральный
2 х отрицательный
1 х положительный 1 х отрицательный
2 х положительный
нейтральный
На основании методов, применяемых для мечения пептида флуоресцином, введены
два отрицательных заряда. Было выяснено, что после инкубации с полиаргинином, пептиды (5 нмоль на пробу) с наивысшим числом отрицательных зарядов эффективнее всего
переносятся в Р388D1-клетки. Это указывает на то, что ионное взаимодействие между
пептидом и поликатионом усиливает перенос пептидов в клетки (фиг. 18). Тем не менее, в
сравнении с клетками, которые были обработаны только пептидом, также и в случае использования нейтральных пептидов в присутствии поликатионов были приняты большие
количества. Обработка только пептидом позволила выявить у всех испытываемых пептидов почти идентичные флуоресцентные сигналы; на основании изложенного на фиг. 18 в
качестве "только пептида" показан как замещающий полученный с помощью пептида
LFEAIEGFI флуоресцентный сигнал.
Источники информации:
Alexander. J. и др., 1989, Immunogenetics 29, стр. 380.
Alired, D.C. и др., 1992, журнал Clin. Onkol 10 (4), стр. 599-605.
Avrameas, А. и др., 1996, Европейский журнал Immunol. 26, стр. 394-400.
Behr, J.P., 1994, Bioconjug-Chem., сентябрь-октябрь 5 (5), стр. 382-9.
Bertoletti, А. и др., 1994, Nature, 369, 407-410.
Biologic Therapy of Cancer, редакторы: DeVita V.T.Jr., Hellman, S., Rosenberg,
S.A.,Verlag, J.B. Lippincott Company, Philadelphia, New York, London, Hagerstown.
Blomberg, K. und Ulfstedt, A.C., 1993, журнал Immunol. Methods 160: стр. 27-34.
Boon, Т., 1992, Adv Cancer Res 58, стр. 177-210.
Boon, Т., 1993, Спектр науки (Mai), стр. 58-66.
Boon, Т. и др., 1994, Annu. Rev. Immunol. 12, стр. 337-65.
27
BY 6399 C1
Boon, Т. und van der Bruggen, P., 1996, журнал Exp med 183, стр. 725-729.
Braciale. T.J. und Braciale V.L., 1991, Immunol. Today, стр. 124-129.
Brocke. S., и др., 1996, Nature 379 (6563), стр. 343-346.
Bronte, и др., 1995, журнал Immunol. 154, стр. 5282.
Carrel, S. und Johnson, J.P., 1993, Current Opinion in Oncology 5, 383-389.
Coligan, J.E., и др., 1991, Nature 351, стр. 290-296.
Coligan, J.E., и др., 1991, Current Prot. In Immunol., Wiley, New York.
Coulie, P.G. и др., 1992, Int. журнал Cancer, 50, стр. 289-297.
Coulie, P.G. и др., 1995, Proc Natl Acad Sci USA 92, стр., 7976-80.
Coulie, P.G. и др., 1994, журнал Exp. Med. 180, стр. 35-42.
Cox, A.L. и др., 1994, Science 264, 5159, стр.716-9.
Current Protocols im Molecular Biology, 1995, Herausgeber: Ausubel F.M. John Wiley и
Sons. Inc.
Dranoff, G. и др., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 90, стр. 3539-3543.
Dranoff, G. und Mulligan, R.C., 1995 Advances in Immunology 58, стр. 417.
Falk, К. и др., 1991, Nature 351, стр. 290-296.
Felgner, J.H. и др., 1994, журнал Diol.Chem. 269, стр. 2550-2561.
Feltkamp, M.C. и др. 1995, Eur. журнал Immunol. 25 (9), стр. 2638-2642.
Fenton, R.G. и др. 1993, журнал Natl. Cancer Inst. 85, 16, сир. 1294-302.
Fisk, В. и др., 1995, журнал Exp. Med. 1881, стр. 2109-2117.
Flow Cytometry, Acad, Press, Methods in Cell Biology, 1989, Vol. 33, авторы:
Darzynkiewicz, Z. Und Crissman, Y.A.
Gedde Dahl, T. 1992, Hum Immunol. 33,4, 266-74.
Grohmann, U. 1995, Eur. Immunol. 25, 2797-2802.
Guarini, A. 1995, Cytokines and Molecular Therapy 1, 57064.
Han, X.K. 1995, PNAS 92, 9747-9752.
Handbych: FACS Vantage ™ User's Guide, April 1994, Becton Dickinson.
Handbuch: CELL Quest ™ Software User's Guide, June 1994, Becton Dickinson.
Henderson, R.A., und Finn, О.J., 1996 Advances in Immunology 62, 217-256.
Hérin M. и др., 1987, Int. журнал Cancer, 39, стр. 390.
Hock, H. и др., 1993, Cancer Research 53, стр. 714-716.
Houbiers, J.G. и др. 993, Eur. журнал Immunol 23, стр. 2072-7.
Huang, A.Y.C., und Pardoll, D.M. (1996). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, стр. 9730-5.
Inaba, К., и др., 1992, урнал Exp. Med 176, стр. 1693-1702.
Jung, S. и др., 1991, журнал Exp Med. 173, 1, 273-6.
Kawakami, Y. и др., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, стр. 6458-62.
Kawakami, Y. и др., 1994а, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91,9, стр. 3515-9.
Kawakami, Y. и др., 1994b, журнал Exp.Med. 180, 1, стр. 347-52.
Kawakami, Y. и др., 1995, журнал Immunol. 154, стр. 3961-3968.
Kärre, К. и др., 1986, Nature 319, 20. Feb., стр. 675.
Kersh, G.J. и др., 1996, Nature 380 (6574), стр. 495-498.
Kovacsovics Bankowski, M. Und Rock, K.L., 1995, Science 267, стр. 243-246.
Lanzavecchia, A., 1996, Curr.Opin. Immunol. 8, стр. 348-354.
Lehmann, J.M. и др., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, стр. 9891-9895.
Lethe, В. и др., 1992, Eur. журнал Immunol. 22, стр. 2283-2286.
Li, H. и др., 1989, журнал Exp. Med. 169, стр. 973-986.
Lill, N.L., Tevethia, M.J., Hendrickson, W.G., und Tevethia, S.S. (1992).
Журнал Exp. Med. 176, стр. 449-57.
Ljunggren, H.G., и др., 1990, Nature 346, стр. 476-480.
Loeffler, J.-P. и др., 1993, Methods Enzymol. 217, стр. 599-618.
Lopez, J.A. и др., 1993, Eur. журнал Immunol. 23, стр. 217-223.
28
BY 6399 C1
MacBroom, C.R. и др., 1972, Nath. Enzymol. 28, стр. 212-219.
Mackiewicz, А. и др., 1995, Human Gene Therapy 6, стр. 805-811.
Malnati, M.S. и др., 1995, Science 267, стр. 1016-1018.
Mandelboim, О. и др., 1994, Nature 369, 5 may, стр.67-71.
Mabdelboim, О. и др., 1995, Nature Meticine 1,11, стр. 1179-1183.
Marchand, M., и др., 1995, Int журнал Cancer 63, стр. 883-5.
Mclntyre, C.A., и др., 1996, Cancer Immunol. Immunother. 42, стр. 246-250.
Midoux, Р., и др., 1993, NATO ASI Series H67, стр. 49-64.
Morishita, R., и др., 1993, журнал Clin. Invest. 91, 6, стр. 2580-5.
Nabel, G.J., и др., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, стр. 11307-11311.
Noguchi, Y., и др., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. YSA 91, стр. 3171-3175.
Oettgen, H.F. und Old, L.J., 1991, Biologic Therapy of Cancer, редакторы: De Vita,
V.T.Jr., Hellman, S., Rosenberg. S.A., Verlag, J.B., Lippincott Company, Philadelphia, New
York, London, Hagerstown, стр. 87-119.
Ostrand-Rosenberg, S., 1994, Current Opinion in Immunology 6, стр. 722-727.
Pardoll, D.M., 1993, Immunology Today 14,6, стр. 310.
Practical Immunology, редакторы Leslie Hudson and Frank C. Hay, Blackwell Scientific
Publications, Oxford, London, Edinburgh, Boston, Melbourne Peace, D.J., и др., 1991, журнал
Immunol. 146, 6, стр. 2059-65.
Peoples, G.E. и др., 1994, журнал Immunol. 152, 10, стр. 4993-9.
Plautz, G.E. и др., 1993, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 90, стр. 4645-4649.
Porgador, A., Gilboa, E., 1995, журнал Ехр. Med. 182, стр. 255-260.
Puccetti, P. и др., 1995, Eur. журнал Immunol. 24, стр. 1446-1452.
Rammensee, H.G., и др., 1993, Annu.Rev Immunol 11, стр. 213-44.
Rammensee, H.G., и др., 1993, Current Opinion in Immunology 5, стр. 35-44.
Rammensee, H.G., и др., 1995, Current Biology 7, стр. 85-96.
Rammensee, H.G., и др., 1998, Current Opinion in Immunology 7, стр. 85-96.
Rammensee, H.G., и др., 1995, Immunogenetics 41, стр.178-228.
Remington's Pharmaceutical Sciences, 18, Auflage 1990, Mack Publishing Company,
Easton, Penn. 1990.
Remy, J.S. и др. 1994, Bioconjug-Chem., Nov-Dec, 5 (6), стр. 647-54.
Rennie, J. und Rusting, R., 1996, Scientific American September, стр. 28-30.
Rivoltini, L. и др., 1995, журнал Immunology 154, 5, стр. 2257-2265.
Robbins, P.F., и др., 1994, Cancer Res 54, стр. 3124-6.
Robbins, P.F., и др., 1995, журнал Immunol 154, стр. 5944-50.
Robbins, P.E. und Rosenberg, S.A., 1996, журнал Ехр. Med. 183, стр.1185-92.
Robbins, P.E. und Kawakami, Y., 1996, Curr Opin Immunol 8, стр. 628-638.
Roitt I.M., Brostoff J., Male D.K. Immunology, Churchill Livingstone.
Rosenberg, S.A., 1996, Annual Reviews of Medicine, 47, стр.481-491.
Ryser, H.J. und Hancock, R., 1965, Science 150, стр. 501-503.
Ryser, H.J. und Shtn, W.C., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, стр. 3867-3870.
Schmidt, W., и др., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, стр.4711-4714.
Schmidt, W., и др., 1996, Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 93, стр. 9759-63.
Sette, А., и др. 1994, Mol. Immunol. 31 (11), стр. 813-822.
Shen, W.C. und Ryser, H.J., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, стр. 1872-1876.
Shen, W.C. und Ryser, H.J., 1989, Mol. Pharmacol. 16, стр. 614-622.
Shen, W.C. und Ryser, H.J., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 78, стр. 7589-7593.
Skipper, J., und Stauss, H.J., 1993, журнал Exp. Med. 177, 5, стр. 1493-8.
Slingluff, C.L. и др.,1994, Current Opinion in Immunology 6, стр.73-740.
Stein, D. и др., 1994, журнал ЕМВО, 13, 6, стр. 1331-40.
Stuber, G., и др., 1994, Eur. журнал Immunol 24, стр. 765-768.
29
BY 6399 C1
Sykulev, Y. и др., 1994, Immunity 1, стр. 15-52.
Theobald. M., Levine, A.J., und Sherman L.A. (1995) PNAS 92, стр. 11993-7.
Tibbets, L.M., и др., 1993, Cancer, Jan. 15, Xol.71, 2, стр. 315-321.
Tykocinski, M.L., и др., 1996, Am. журнал Pathol. 148, стр. 1-16.
Van der Bruggen, P., и др., 1994, Eur. журнал Immunol. 24, 9, стр. 2134-40 Issn: 00142980.
Van der Eynde, B. und Brichard, V.G., 1995, Current Opinion Immunol. 7, стр. 674-81.
Van Pel, A. und Boon, Т., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, стр. 4718-4722.
Van Pel, А., и др., 1995, Immunological Reviews 145, стр. 229-250.
Vitiello, А., и др., 1995, журнал Clin. Inv. 95, 1, стр. 341-349.
Wagner, E., и др., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, стр. 341-4.
Wagner, E., и др., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, стр. 6099-103.
Wang, R.F., и др., 1995, журнал Ехр. Med.181, стр. 799-804.
Weynants, P. и др., 1994, Int. журнал Cancer 56, стр. 826-829.
Widmann, С. и др., 1992, журнал Immunol. Vethods 155 (1), стр. 95-99.
Wölfel, Т. и др., 1994 a), Int. журнал Cancer 57, стр. 413-418.
Wölfel, Т. и др., 1994 b), Eur. журнал Immunol. 24, стр. 759-764.
York, I.A. und Rock, K.L., 1996, Ann. Rev. Immunol. 14, стр. 369-396.
Yoshino, I. и др., 1994 а), журнал Immunol. 152, 5, стр. 2393-400.
Yoshino, I. и др., 1994 b), Cancer Res., 54, 13, стр. 3387-90.
Young, J.W., Inaba, K., 1996, журнал Exp. Med., 183, стр. 7-11.
Zatloukal, К. и др. 1993, Gene 135, стр. 199-20.
Zatloukal, К. и др. 1995, журнал Immun. 154, стр. 3406-3419.
Фиг. 1
Фиг. 2a
Фиг. 2b
Фиг. 2c
30
BY 6399 C1
Фиг. 3
Фиг. 4
Фиг. 5
Фиг. 6a
Фиг. 6b
Фиг. 7a
31
BY 6399 C1
Фиг. 7b
Фиг. 7c
Фиг. 8
Фиг. 9
Фиг. 10
Фиг. 11
32
BY 6399 C1
Фиг. 12
Фиг. 13
Фиг. 14
Фиг. 15
33
BY 6399 C1
Фиг. 15b
Фиг. 15c
Фиг. 16
Фиг. 17
Фиг. 18
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
34
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
572 Кб
Теги
by6399, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа