close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY6838

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
BY (11) 6838
(13) C1
(19)
7
(51) G 01N 33/48
(12)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
РЕАКЦИОННЫЙ СОСТАВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ
ФОСФАТ-НЕЗАВИСИМОЙ ГЛУТАМИНАЗЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ
ОБРАЗЦАХ
(21) Номер заявки: a 20010503
(22) 2001.05.31
(46) 2005.03.30
(71) Заявитель: Государственное научное
учреждение "Институт биохимии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Валюк Татьяна Чеславовна;
Величко Магдалена Григорьевна; Нефедов Леонид Иванович (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт биохимии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
BY 6838 C1
(57)
Реакционный состав для определения активности фосфат-независимой глутаминазы в
биологических образцах, содержащий трис-(оксиметил)-аминометан гидрохлорид, двухзамещенный фосфат калия, хлорид калия, динатриевую соль малеиновой кислоты, Lглутамин и воду дистиллированную, отличающийся тем, что дополнительно содержит
никотинамидадениндинуклеотид окисленный (НАД + ), L-метилфеназинметосульфат и дихлорфенолиндофенол при следующем соотношении компонентов, мкмоль/л:
трис-(оксиметил)-аминометан гидрохлорид
99,5-100
двухзамещенный фосфат калия
0,9-1,0
хлорид калия
0,09-0,1
динатриевая соль малеиновой кислоты
24,5-25,0
L-глутамин
19,5-20,0
+
НАД
10,0
L-метилфеназинметосульфат
0,0065
дихлорфенолиндофенол
0,02
вода дистиллированная
остальное.
(56)
Kovacevic Z. Biochimica et Biophysica Acta. Enzymology. - 1974. - V.334. - No 1. - P. 199207.
US 4177109, 1979.
Эмирбеков Э.З. и др. Укр. биохим. журнал, 1979. - Т.51. - № 6. - С. 684-686.
Maity P. et al. J.Exp.Clin.Cancer Res. - 1999. - V. 18. - No 4. - P. 475-480.
Segura J.A. et al. Protein Expression and Purification. - 1995. - V.6. - Iss.3. - P. 343-351.
Изобретение относится к области аналитической биохимии и может быть использовано для оценки процесса утилизации L-глутамина с помощью фермента фосфат-независимая глутаминаза в различных биологических образцах.
BY 6838 C1
Наиболее близким к заявляемому является реакционный состав для определения активности фосфат-независимой глутаминазы, содержащий трис-(оксиметил)-аминометангидрохлорид - 100 мкмоль/л, двухзамещенный фосфат калия - 1 мкмоль/л, хлорид калия 0,1 мкмоль/л, малеиновую кислоту - 25 мкмоль/л, L-глутамин - 10 мкмоль/л, воду дистиллированную - остальное (Kovacevic Z. Distribution of glutaminase isoenzymes in kidney cells //
B.B.A. - 1974. - Vol. 334. - P. 199-207). Для остановки реакции используется трихлоруксусная кислота, карбонат калия, серная кислота и нитропруссид-феноловый реактив (Исмаилов И.А., Эмирбеков Э.З. Глутаминазная и глутаматдекарбоксилазная активность ткани
мозга при гипотермии и зимней спячке // Укр. биохим. жур. - 1980. - T. 52. - № 6. - С. 683-688).
Недостатками данного реакционного состава являются обязательное наличие безаммиачной воды, выпадение осадка после остановки реакции, что требует дополнительного
центрифугирования проб перед работой на регистрирующих приборах, работа с токсичными веществами (ацетон, фенол, трихлоруксусная, серная, гипохлорная кислоты), длительность процесса постановки реакции для определения активности фермента вследствие
получасовой инкубации проб и дополнительного центрифугирования, невозможность работать с биологическими образцами, отобранными у животных с экспериментальными
опухолями (например, ткань печени, опухоли).
Задачей изобретения является создание нового реакционного состава для определения
активности фосфат-независимой глутаминазы, сокращения времени постановки реакции,
повышения доступности и надежности определения, работы с образцами тканей, отобранными у опухоленосителей.
Задача достигается тем, что в реакционный состав по сравнению с прототипом добавлены никотинамидадениндинуклеотид окисленный, L-метилфеназинметосульфат, дихлорфенолиндофенол, увеличена концентрация субстрата, исключены ацетон, фенол, трихлоруксусная, серная, гипохлорная кислоты. Это способствует повышению надежности и доступности определения активности фосфат-независимой глутаминазы в промежутке времени
10 мин при оптимальной температуре инкубации среды (37 °С).
Заявленный реакционный состав для определения активности фосфат-независимой
глутаминазы содержит трис-(оксиметил)-аминометан гидрохлорида, двухзамещенный фосфат калия, динатриевую соль малеиновой кислоты, хлорид калия, L-глутамин, никотинамидадениндинуклеотид окисленный (НАД+), L-метилфеназинметосульфат, дихлорфенолиндофенол (ДХФИФ) при следующем соотношении компонентов, мкмоль/л: трис-(оксиметил)-аминометан гидрохлорид - 99,5-100; двухзамещенный фосфат калия - 0,9-1,0;
хлорид калия - 0,09-0,10; динатриевая соль малеиновой кислоты - 24,5-25,0; L-глутамин 19,5-20,0; НАД+ - 10; L-метилфеназинметосульфат - 0,0065; дихлорфенолиндофенол - 0,02;
вода дистиллированная - остальное.
Предложенные нововведения обосновываются следующим образом:
1) L-глутамин в концентрации 20 мкмоль/л позволяет работать с образцами тканей,
отобранными у животных-опухоленосителей, поскольку развитие онкопроцесса связано с
избыточным потреблением глутамина опухолью (Colquhoun A., Newsholme E.A. Aspects of
glutamine metabolism in human tumour cells // Biochem. Mol. Int. - 1997. - Vol.122. - № 2. P. 451-464);
2) никотинамидадениндинуклеотид окисленный облегчает двусторонний обмен атомами водорода и электронами, отделенными от субстрата, и акцепторами электронов
(МакМюррей У. Обмен веществ у человека. - M.: Мир, 1980. - С. 118);
3) L-метилфеназинметосульфат - акцептор электронов, осуществляющий перенос электронов на последующий акцептор;
4) дихлорфенолиндофенол - акцептор электронов, снимающий электроны с L-метилфеназинметосульфата, в результате чего развивается окраска акцептора от темно-синей
(при образовании окисленной формы) до светло-голубой (при образовании восстановленной формы).
2
BY 6838 C1
Заявленный реакционный состав использовали для определения активности фосфатнезависимой глутаминазы в шести образцах из тканей печени и опухоли крыс-опухоленосителей саркомы M-1 в трех независимых сериях опытов. За ходом реакций следили на
регистрирующих приборах - спектрофотометры VSU-2P и Spekol-221, при λ = 600 нм по
приросту оптической плотности вследствие наработки продукта.
В таблице представлены полученные расчетные данные по активности фосфат-независимой глутаминазы из тканей крыс-опухоленосителей с применением заявленного реакционного состава.
Активность фосфат-независимой глутаминазы, полученная путем применения заявленного реакционного состава в различных сериях опытов, мкмоль ДХФИФ/мин-г белка
Образец ткани
печени
опухоли
1-я
180,8±24,7
107,3±120,1
Серия опытов
2-я
185,7±25,9
101,5±18,7
3-я
190,4±31,6
108,5±19,4
Результаты, представленные в таблице, свидетельствуют об оптимальном соотношении компонентов заявленного реакционного состава для определения активности фосфатнезависимой глутаминазы в диапазоне указанных выше концентраций, поскольку это не
дает большой вариации данных по активности фермента, позволяет получать воспроизводимые результаты.
Заявленный реакционный состав для определения активности фосфат-независимой
глутаминазы может быть широко использован в биохимической и медицинской практике
для диагностики злокачественных новообразований и разработки стратегии их лечения,
поскольку изменение активности фермента в раковой ткани коррелирует со степенью ее
злокачественности.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
135 Кб
Теги
патент, by6838
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа