close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY6839

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
BY (11) 6839
(13) C1
(19)
7
(51) G 01N 33/48
(12)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
РЕАКЦИОННЫЙ СОСТАВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ
ФОСФАТ-ЗАВИСИМОЙ ГЛУТАМИНАЗЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ
ОБРАЗЦАХ
(21) Номер заявки: a 20010504
(22) 2001.05.31
(46) 2005.03.30
(71) Заявитель: Государственное научное
учреждение "Институт биохимии
Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Валюк Татьяна Чеславовна;
Величко Магдалена Григорьевна; Нефедов Леонид Иванович (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт биохимии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(57)
Реакционный состав для определения активности фосфат-зависимой глутаминазы в
биологических образцах, содержащий трис-(оксиметил)-аминометан гидрохлорид, ортофосфат калия, L-глутамин и воду дистиллированную, отличающийся тем, что дополнительно содержит хлорид калия, динатриевую соль малеиновой кислоты, никотинамидадениндинуклеотид окисленный (НАД+), L-метилфеназинметосульфат и дихлорфенолиндофенол при следующем соотношении компонентов, мкмоль/л:
BY 6839 C1
трис-(оксиметил)-аминометан гидрохлорид
ортофосфат калия
L-глутамин
хлорид калия
динатриевая соль малеиновой кислоты
НАД+
L-метилфеназинметосульфат
дихлорфенолиндофенол
вода дистиллированная
99,5-100
99,5-100
19,5-20,0
0,09-0,10
24,5-25,0
10,0
0,0065
0,02
остальное.
(56)
KOVACEVIC Z. Biochimica et Biophysica Acta. Enzymology, 1974. - V. 334. - No 1. P. 199-207.
US 4177109, 1979.
Эмирбеков Э.З. и др. Укр. биохим. журнал. - 1979. - Т. 51. - № 6. - С. 684-686.
KVAMME E. et al. J. Biol. Chem., 1970. - V. 245. - No 8. - Р. 1871-1882.
ALEDO J.C. et al. FEBS Lett., 1994. - V. 341. - No 1. - P. 39-42.
McGIVAN J.D. et al. Biochem. J., 1980. - V. 192. - No 2. - P. 537-542.
QUESADA A.R. et al. Biochem. J., 1988. - V. 255. - No 3. - P. 1030-1035.
BY 6839 C1
Изобретение относится к области аналитической биохимии и может быть использовано для оценки процесса утилизации глутамина в различных биологических образцах.
Фермент фосфат-зависимая глутаминаза катализирует реакцию гидролиза глутамина с
образованием глутаминовой кислоты и аммиака, протекающую при обязательном наличии
фосфат-ионов [Kvamme E., Torgner I.A., Roberg B. Kinetics and localization of brain phosphate activated glutaminase // J. Neurosci. Res., 2001. - V. 66. - № 5. - P. 951-958].
Наиболее близким к заявляемому является реакционный состав для определения
активности фосфат-зависимой глутаминазы по наработке аммиака, содержащий трис(оксиметил)-аминометан гидрохлорид в концентрации 100 мкмоль/л, ортофосфат калия 100 мкмоль/л, L-глутамин - 40 мкмоль/л, воду безаммиачную - остальное [Kovacevic Z.
Distribution of glutaminase isoenzymes in kidney cells // B.B.A. 1974. - V. 334. - № 1. - P. 199207]. Для остановки реакции необходимы трихлоруксусная кислота, карбонат калия, серная кислота и нитропруссид-феноловый реактив [Исмаилов И.А., Эмирбеков Э.З. Глутаминазная и глутаматдекарбоксилазная активность ткани мозга при гипотермии и зимней
спячке // Укр. биохим. жур. - 1980. - Т. 52. - № 6 - С. 683-688].
Недостатками данного реакционного состава являются: обязательное наличие безаммиачной воды, выпадение осадка после остановки реакции, что требует дополнительного
центрифугирования проб перед работой на регистрирующих приборах; работа с токсичными веществами (ацетон, фенол, трихлоруксусная, серная, гипохлорная кислоты); длительность процесса постановки реакции для определения активности вследствие получасовой инкубации проб и дополнительного центрифугирования; получение активности с
разбежкой данных в широком диапазоне.
Задачей изобретения является создание нового реакционного состава для выявления
активности фосфат-зависимой глутаминазы по наработке глутамата, сокращения времени
постановки реакции, повышения доступности и надежности определения.
Указанная задача достигается тем, что в реакционный состав по сравнению с прототипом добавлены хлорид калия, малеат, никотинамидадениндинуклеотид окисленный, Lметилфеназинметосульфат, дихлорфенолиндофенол, снижена концентрация глутамина,
исключены ацетон, фенол, трихлоруксусная, серная, гипохлорная кислоты. Это способствует повышению надежности, доступности определения активности фосфат-зависимой
глутаминазы в промежутке времени 10 мин при оптимальной температуре инкубации среды (37 °C).
Заявленный состав содержит трис-(оксиметил)-аминометан гидрохлорид, ортофосфат
калия, L-глутамин, динатриевую соль малеиновой кислоты, хлорид калия, никотинамидадениндинуклеотид окисленный (НАД+), L-метилфеназинметосульфат, дихлорфенолиндофенол (ДХФИФ) при следующем соотношении компонентов, мкмоль/л: трис-(оксиметил)аминометан гидрохлорид - 99,5-100; ортофосфат калия - 99,5-100; L-глутамин - 19,5-20,0;
хлорид калия - 0,09-0,10; динатриевая соль малеиновой кислоты - 24,5-25,0; НАД+ - 10,0;
L-метилфеназинметосульфат - 0,0065; ДХФИФ - 0,02; вода дистиллированная - остальное.
Предложенные нововведения обосновываются следующим образом:
1. хлорид калия является источником однозарядных ионов для поддержания кислотности реакционной среды;
2. малеиновая кислота является активатором фермента [Kvamme E., Tveit В., Svennebby G. Glutaminase from pig renal cortex. 1. Purification and general properties. 2. Activation
by inorganic and organic ions // J. Biol. Chem, 1970. - V. 245. - № 8. - P. 1871-1882];
3. введение активатора позволяет снизить концентрацию L-глутамина до 20 мкмоль/л;
4. никотинамидадениндинуклеотид окисленный облегчает двусторонний обмен атомами водорода и электронами, отделенными от субстрата, между глутаматдегидрогеназной системой и акцепторами электронов [Мак-Мюррей У. Обмен веществ у человека. M.: Мир, 1980. - С. 118];
2
BY 6839 C1
5. L-метилфеназинметосульфат - акцептор электронов, осуществляющий перенос электронов на последующий акцептор (дихлорфенолиндофенол);
6. дихлорфенолиндофенол - акцептор электронов, снимающий электроны с L-метилфеназинметосульфата, в результате чего развивается окраска акцептора от темно-синей
(при образовании окисленной формы) до светло-голубой (при образовании восстановленной формы).
Заявленный реакционный состав использовали для определения активности фосфатзависимой глутаминазы в шести образцах из тканей печени и опухоли крыс-опухоленосителей саркомы M-1 в трех независимых сериях опытов. За ходом реакций следили по
приросту оптической плотности вследствие наработки продукта на регистрирующих приборах - спектрофотометры VSU-2P и Spekol-221, при λ = 600 нм.
В таблице представлены полученные расчетные данные по активности фосфат-зависимой глутаминазы из тканей крыс-опухоленосителей с применением заявленного реакционного состава.
Активность фосфат-зависимой глутаминазы, полученная путем применения заявленного
реакционного состава в различных сериях опытов, мкмоль ДХФИФ/мин-г белка
Образец ткани
печени
опухоли
1-я
149,4±14,4
96,0±8,6
Серия опытов
2-я
145,7±17,9
99,2±8,8
3-я
157,4±21,6
98,7±9,4
Результаты, представленные в таблице, свидетельствуют об оптимальном соотношении компонентов заявленного реакционного состава в диапазоне указанных выше концентраций, поскольку это не дает большой вариации данных по активности фосфат-зависимой глутаминазы, позволяет получать воспроизводимые результаты.
Заявленный реакционный состав для определения активности фосфат-зависимой глутаминазы может быть широко использован в биохимической и медицинской практике для
диагностики злокачественных новообразований и разработки стратегии их лечения, поскольку изменение активности фермента в раковой ткани коррелирует со степенью ее злокачественности.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
135 Кб
Теги
патент, by6839
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа