close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY7250

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
BY (11) 7250
(13) C1
(19)
(46) 2005.09.30
(12)
7
(51) A 61K 38/42,
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
ВОДНЫЙ РАСТВОР ПИРИДОКСИЛИРОВАННОГО
ПОЛИМЕРИЗОВАННОГО ГЕМОГЛОБИНА, СПОСОБ ЕГО
ПОЛУЧЕНИЯ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ПРИ ПОТЕРЕ КРОВИ
(21) Номер заявки: a 19980977
(22) 1997.03.27
(31) 60/014,389 (32) 1996.03.28 (33) US
(85) 1998.10.26
(86) PCT/US97/05088, 1997.03.27
(87) WO 97/35883, 1997.10.02
(43) 1999.06.30
(71) Заявитель: НОРТФИЛЬД ЛАБОРАТОРИЗ, ИНК. (US)
(72) Авторы: ДеВОСКИН, Ричард, Е.;
ДАУБЛДЭЙ, Марк, Д. (US)
BY 7250 C1 2005.09.30
C 07K 14/805
(73) Патентообладатель: НОРТФИЛЬД ЛАБОРАТОРИЗ, ИНК. (US)
(56) US 5464814 A, 1995.
US 4826811, 1989.
US 5194590 A, 1993.
EP 361720 A1, 1990.
Платэ Н.А. и др. Физиологически активные полимеры. - М.: Химия, 1986. С. 248-253.
SU 1205910 A, 1986.
(57)
1. Водный раствор пиридоксилированного полимеризованного гемоглобина, включающий 10-24 % от массы общего гемоглобина полимера гемоглобина с молекулярной
массой 128 кД, 18-30 % от массы общего гемоглобина полимера гемоглобина с молекулярной массой 192 кД и 45-70 % от массы общего гемоглобина полимера гемоглобина с
молекулярной массой 256 кД.
2. Водный раствор гемоглобина по п. 1, отличающийся тем, что содержит:
общий гемоглобин в количестве 9,5-12,0 г/дл;
метгемоглобин в количестве менее 8 % от общего гемоглобина;
карбоксигемоглобин в количестве менее 5 % от общего гемоглобина;
натрий в концентрации 135-155 ммоль/л;
калий в концентрации 3,5-4,5 ммоль/л;
хлорид в концентрации 85-110 ммоль/кг.
Фиг. 1
BY 7250 C1 2005.09.30
3. Водный раствор гемоглобина по п. 2, отличающийся тем, что содержит:
свободное железо в количестве менее 2,0 ч/млн.;
тетрамеры в количестве менее 0,8 % от общего гемоглобина;
эндоксин в количестве менее 0,03 EU/мл.
4. Водный раствор гемоглобина по п. 3, отличающийся тем, что содержит:
фосфолипиды в количестве менее 50 нг/Нb;
гликолипиды в количестве менее 2 нг/Нb.
5. Водный раствор гемоглобина по п. 2, отличающийся тем, что имеет осмотическое
давление в пределах 280-360 ммоль/кг.
6. Водный раствор гемоглобина по п. 2, отличающийся тем, что диссоциация окисленного гемоглобина находится в пределах 23-32 торр.
7. Водный раствор гемоглобина по п. 1, отличающийся тем, что период его полураспада в организме человека составляет, по меньшей мере, около 15 ч.
8. Водный раствор гемоглобина по п. 1, отличающийся тем, что период его полураспада в организме человека составляет около 24 ч.
9. Водный раствор гемоглобина по п. 1, отличающийся тем, что не вызывает ощутимого снижения почечной активности при введении в организм человека в количестве до 5 л.
10. Водный раствор гемоглобина по п. 1, отличающийся тем, что не вызывает ощутимого снижения почечной активности при введении в организм человека в количестве
до 5 л, при этом период его полураспада в организме человека составляет 24 ч.
11. Водный раствор гемоглобина по п. 1, отличающийся тем, что пиридоксилированный полимеризованный гемоглобин представляет собой полимеризованный глютаральдегидом гемоглобин.
12. Водный раствор гемоглобина по п. 1, отличающийся тем, что включает около
16 % полимера гемоглобина с молекулярной массой около 128 кД, около 26 % полимера
гемоглобина с молекулярной массой около 192 кД и около 58 % полимера гемоглобина с
молекулярной массой около 256 кД.
13. Способ получения водного раствора пиридоксилированного полимеризованного
гемоглобина, включающий следующие стадии:
(а) удаление лейкоцитов путем фильтрации смеси, содержащей эритроциты, через
фильтр, имеющий минимальный средний размер пор, достаточный для предотвращения
прохождения лейкоцитов;
(б) лизис эритроцитов;
(в) введение монооксида углерода в резервуар, содержащий препарат, полученный на
стадии (б), нагревание до температуры около 60-62 °С в течение 10 часов и получение
термически обработанного раствора гемоглобина;
(г) фильтрацию термически обработанного раствора гемоглобина для удаления стромы и примесей стромы, осаждаемых при нагревании;
(д) дегазацию полученного на стадии (г) раствора путем барботирования кислорода и
затем азота через указанный раствор при температуре около 10 °С для создания пены и
получение дегазированного термически обработанного раствора гемоглобина;
(е) пиридоксилирование гемоглобина в дегазированном растворе и получение раствора пиридоксилированного гемоглобина;
(ж) полимеризацию пиридоксилированного гемоглобина с помощью агента полимеризации в течение времени, достаточного для получения раствора пиридоксилированного
полимеризованного гемоглобина, содержащего 10-24 % от массы общего гемоглобина полимера гемоглобина с молекулярной массой 128 кД, 18-30 % от массы общего гемоглобина полимера гемоглобина с молекулярной массой 192 кД и 45-70 % от массы общего гемоглобина полимера гемоглобина с молекулярной массой 256 кД;
(з) оксигенирование полученного на стадии (ж) раствора;
2
BY 7250 C1 2005.09.30
(и) очистку раствора от тетрамеров гемоглобина и сбор очищенного раствора пиридоксилированного полимеризованного гемоглобина, содержащего менее 0,8 % тетрамеров
от массы общего гемоглобина;
(к) дезоксигенирование очищенного раствора пиридоксилированного полимеризованного гемоглобина; и
(л) доведение рН и уровней электролитов в очищенном растворе пиридоксилированного полимеризованного гемоглобина до физиологических уровней.
14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что гемоглобин пиридоксилируют пиридоксаль-5'-фосфатом при молярном соотношении пиридоксаль-5'-фосфата и гемоглобина (13):1.
15. Способ по п. 13, отличающийся тем, что гемоглобин пиридоксилируют пиридоксаль-5'-фосфатом при молярном соотношении пиридоксаль-5'-фосфата и гемоглобина
около 2:1.
16. Способ по п. 14, отличающийся тем, что гемоглобин пиридоксилируют в течение
около одного часа в присутствии боргидрида.
17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что пиридоксилированный гемоглобин полимеризуют глютаральдегидом при молярном соотношении глютаральдегида и гемоглобина около 24:1.
18. Способ по п. 17, отличающийся тем, что полимеризацию осуществляют в течение
около 18 ч, затем раствор пиридоксилированного полимеризованного гемоглобина охлаждают.
19. Способ лечения пациента при потере крови, включающий внутривенное введение
пациенту до 5,0 л водного раствора пиридоксилированного полимеризованного гемоглобина, отличающийся тем, что вводят раствор гемоглобина, содержащий около 16 % от
массы общего гемоглобина полимера гемоглобина с молекулярной массой около 128 кД,
около 26 % от массы общего гемоглобина полимера гемоглобина с молекулярной массой
около 192 кД и около 58 % от массы общего гемоглобина полимеров гемоглобина с молекулярной массой около 256 кД.
20. Водный раствор пиридоксилированного полимеризованного гемоглобина, включающий 10-24 % от массы общего гемоглобина полимера гемоглобина с молекулярной
массой 128 кД, 18-30 % от массы общего гемоглобина полимера гемоглобина с молекулярной массой 192 кД, 45-70 % от массы общего гемоглобина полимера гемоглобина с
молекулярной массой 256 кД, полученный способом, включающим:
(а) пропускание просроченной или свежей крови через подходящее аспирационное
устройство при пониженном давлении для получения аспирированной крови;
(б) удаление лейкоцитов из аспирированной крови ее фильтрацией через ряд фильтров, имеющих минимальный средний размер пор, достаточный для предотвращения прохождения лейкоцитов;
(в) введение монооксида углерода в резервуар, содержащий препарат, полученный на
стадии (б), причем рН полученного препарата составляет приблизительно 6,0-6,5;
(г) промывание полученного на стадии (в) препарата 1 % раствором хлорида натрия;
(д) разведение полученного на стадии (г) препарата водой и получение раствора гемоглобина из лизированных клеток;
(е) фильтрацию полученного на стадии (д) раствора и получение раствора гемоглобина, свободного от примесей стромы и материала клеточной стенки;
(ж) нагревание при температуре приблизительно 60-62 °С в течение около 10 ч полученного на стадии (е) раствора гемоглобина с последующей фильтрацией и получение
термически обработанного, свободного от стромы, раствора гемоглобина;
(з) концентрирование и диафильтрацию полученного на стадии (ж) раствора гемоглобина и получение раствора карбоксигемоглобина;
3
BY 7250 C1 2005.09.30
(и) дегазацию раствора карбоксигемоглобина путем барботирования кислорода и затем азота через указанный раствор при температуре около 10 °С для создания пены и получение дегазированного термически обработанного раствора гемоглобина;
(к) пиридоксилирование гемоглобина в дегазированном растворе пиридоксаль-5'фосфатом при молярном соотношении пиридоксаль-5'-фосфата и гемоглобин (1-3):1 и получение раствора пиридоксилированного гемоглобина;
(л) полимеризацию пиридоксилированного гемоглобина глютаральдегидом и получение раствора пиридоксилированного полимеризованного гемоглобина, содержащего около 65-75 мас. % полимеров и около 25-35 мас. % тетрамеров;
(м) оксигенирование и разбавление раствора пиридоксилированного полимеризованного гемоглобина до получения раствора, содержащего приблизительно 4 мас. % гемоглобина;
(н) очистку полученного на стадии (м) раствора и удаление тетрамерного гемоглобина
и сбор очищенного раствора пиридоксилированного полимеризованного гемоглобина, содержащего менее 0,8 % тетрамеров от общей массы гемоглобина;
(о) дезоксигенирование очищенного раствора пиридоксилированного полимеризованного гемоглобина барботированием азота через указанный раствор;
(п) доведение рН и уровней электролитов в очищенном растворе пиридоксилированного полимеризованного гемоглобина до 8,8-9,0; и
(р) концентрирование и стерилизацию полученного на стадии (п) раствора.
21. Способ получения водного раствора пиридоксилированного полимеризованного
гемоглобина, включающего 10-24 % от массы общего гемоглобина полимера гемоглобина
с молекулярной массой 128 кД, 18-30 % от массы общего гемоглобина полимера гемоглобина с молекулярным массой 192 кД, 45-70 % от массы общего гемоглобина полимера гемоглобина с молекулярной массой 256 кД, включающий следующие стадии:
(а) пропускание просроченной или свежей крови через подходящее аспирационное
устройство при пониженном давлении для получения аспирированной крови;
(б) удаление лейкоцитов из аспирированной крови ее фильтрацией через ряд фильтров, имеющих минимальный средний размер пор, достаточный для предотвращения прохождения лейкоцитов;
(в) введение монооксида углерода в резервуар, содержащий препарат, полученный на
стадии (б), причем рН полученного препарата составляет приблизительно 6,0-6,5;
(г) промывание полученного на стадии (в) препарата 1 % раствором хлорида натрия;
(д) разведение полученного на стадии (г) препарата водой и получение раствора гемоглобина из лизированных клеток;
(е) фильтрацию полученного на стадии (д) раствора и получение раствора гемоглобина, свободного от примесей стромы и материала клеточной стенки;
(ж) нагревание при температуре приблизительно 60-62 °С в течение около 10 ч полученного на стадии (е) раствора гемоглобина с последующей фильтрацией и получение
термически обработанного, свободного от стромы, раствора гемоглобина;
(з) концентрирование и диафильтрацию полученного на стадии (ж) раствора гемоглобина и получение раствора карбоксигемоглобина;
(и) дегазацию раствора карбоксигемоглобина путем барботирования кислорода и затем азота через указанный раствор при температуре около 10 °С для создания пены и получение дегазированного термически обработанного раствора гемоглобина;
(к) пиридоксилирование гемоглобина в дегазированном растворе пиридоксаль-5'фосфатом при молярном соотношении пиридоксаль-5'-фосфата и гемоглобин (1-3):1 и получение раствора пиридоксилированного гемоглобина;
(л) полимеризацию пиридоксилированного гемоглобина глютаральдегидом и получение раствора пиридоксилированного полимеризованного гемоглобина, содержащего около 65-75 мас. % полимеров и около 25-35 мас. % тетрамеров;
4
BY 7250 C1 2005.09.30
(м) оксигенирование и разбавление раствора пиридоксилированного полимеризованного
гемоглобина до получения раствора, содержащего приблизительно 4 мас. % гемоглобина;
(н) очистку полученного на стадии (м) раствора для удаления тетрамерного гемоглобина и сбор очищенного раствора пиридоксилированного полимеризованного гемоглобина, содержащего менее 0,8 % тетрамеров от общей массы гемоглобина;
(о) дезоксигенирование очищенного раствора пиридоксилированного полимеризованного гемоглобина барботированием азота через указанный раствор;
(п) доведение рН и уровней электролитов в очищенном растворе пиридоксилированного полимеризованного гемоглобина до 8,8-9,0; и
(р) концентрирование и стерилизацию полученного на стадии (п) раствора.
22. Водный раствор пиридоксилированного полимеризованного гемоглобина, имеющий следующие характеристики:
общий гемоглобин в количестве 9,5-12,0 г/дл;
метгемоглобин в количестве менее 8 % от общего гемоглобина;
карбоксигемоглобин в количестве менее 5 % от общего гемоглобина;
диссоциация окисленного гемоглобина в пределах 23-32 торр;
осмотическое давление в пределах 280-360 ммоль/кг;
концентрация натрия в пределах 135-155 ммоль/л;
концентрация калия в пределах 3,5-4,5 ммоль/л;
концентрация хлорида в пределах 85-110 ммоль/кг;
свободное железо в количестве менее 2,0 ч/млн.;
распределение максимальной молекулярной массы 128 кД в пределах 10-24 %;
распределение максимальной молекулярный массы 192 кД в пределах 18-30 %;
распределение максимальной молекулярный массы 256 кД в пределах 45-70 %;
количество тетрамеров менее 0,8 % от общего гемоглобина;
количество эндотоксина менее 0,03 EU/мл;
количество фосфолипидов менее 50 нг/Hb
количество гликолипидов менее 2 нг/Hb.
23. Водный раствор пиридоксилированного полимеризованного гемоглобина, включающий около 16 % от массы общего гемоглобина полимера гемоглобина с молекулярной
массой около 128 кД, около 26 % от массы общего гемоглобина полимера гемоглобина с
молекулярной массой около 192 кД и около 58 % от массы общего гемоглобина полимера
гемоглобина с молекулярной массой около 256 кД.
24. Водный раствор гемоглобина по п. 23, отличающийся тем, что не вызывает ощутимого снижения почечной активности при введении в организм человека в количестве до
1,5 л.
25. Способ лечения пациента при потере крови, включающий введение пациенту водного раствора гемоглобина по п. 1.
Настоящее изобретение касается способа и устройства для получения заменителей
эритроцитов, в частности препаратов гемоглобина. Кроме того, оно также касается бесклеточных заменителей эритроцитов, включающих по существу свободный от тетрамеров,
содержащий поперечные связи, полимеризованный, пиридоксилированный раствор гемоглобина, который не содержит стромальных примесей.
В течение ряда лет для переливания при хирургических операциях, при травмах или в
других ситуациях банки крови поставляли цельную кровь. Однако цельная кровь, полученная от доноров человека, непригодна для ряда применений. В частности, применение
цельной крови проблематично из-за требования донорского типирования, стабильности,
проблем срока годности и токсичности, обусловленных вирусами и другими примесями.
Эти проблемы, в частности, относятся к таким экстренным ситуациям как, например, ис5
BY 7250 C1 2005.09.30
пользование крови в войсках. Поэтому много усилий было направлено на разработку заменителей цельной крови, полученной от доноров человека. Разработки привели к различным модификациям в крови, полученной от человека или от других млекопитающих.
Известна способность бесстромального гемоглобина переносить кислород и способность
связывать реверсивный кислород (или лиганды). Так как проблемы токсичности препятствовали применению заменителей крови, получение бесстромального гемоглобина потребовало дальнейших модификаций для получения нетоксичного фармацевтического
препарата, пригодного для применения.
Эти модификации включают (1) получение гемоглобина, свободного или существенно
свободного от стромы и стромальных примесей; (2) пиридоксилирование; (3) полимеризацию или структурирование; (4) удаление тетрамеров и (5) модификацию с монооксидом
углерода или другими лигандами.
Однако, несмотря на способность к переносу достаточных количеств кислорода, необходимых для поддержания жизнедеятельности, растворы гемоглобина, полученные согласно этим методам, обладали многими нежелательными побочными эффектами и свойствами. Например, главным побочным эффектом является снижение активности в почках.
Считалось, что эти изменения происходили из-за наличия нежелательных примесей, например, бактериального эндотоксина или фрагментов мембран эритроцитов (стромы). В
то время как примеси такого типа действительно могут производить изменения в почках,
растворы гемоглобина без вышеупомянутых примесей все еще являются причиной дисфункции почек. Причину дисфункции почек объясняли наличием физиологически недопустимых количеств неполимеризованных тетрамеров гемоглобина. Другими нежелательными побочными эффектами инфузии тетрамеров гемоглобина являются вазоконстрикция, гемоглобинурия, снижение частоты сердечных сокращений, повышение среднего
значения внутриартериального кровяного давления и транссудация инфузата, в частности,
в брюшную полость.
Практически неизвестны такие заменители крови на основе гемоглобина, которые были бы полностью лишены токсичности. Кроме того, эти препараты также имеют неприемлемо низкий период полусуществования после введения человеку. При таком периоде полусуществования требуется повторная замена объема крови в течение коротких периодов
времени. Следовательно, существует реальная потребность в препаратах гемоглобина, которые являются нетоксичными для пациентов и имеют достаточный период полусуществования после введения. Конечно, такие препараты должны быть способны к реверсивной
транспортировке кислорода к тканям таким же образом, как и цельная кровь.
Задачей настоящего изобретения является получение заменителей гемоглобина, которые являются нетоксичными для человека и имеют при введении человеку достаточный
период полураспада, составляющий по меньшей мере 15 часов, не содержат стромы, пиридоксилированы и полимеризованы, а также не включают вирусных и других токсических примесей. Кроме того, эти препараты не содержат лейкоциты и тромбоциты.
Предметом изобретения является водный раствор пиридоксилированного полимеризованного гемоглобина, включающий 10-24 % от массы общего гемоглобина полимера
гемоглобина с молекулярной массой 128 кД, 18-30 % от массы общего гемоглобина полимера гемоглобина с молекулярной массой 192 кД и 45-70 % от массы общего гемоглобина
полимера гемоглобина с молекулярной массой 256 кД.
В предпочтительном варианте водный раствор гемоглобина содержит:
общий гемоглобин в количестве 9,5-12,0 г/дл;
метгемоглобин в количестве менее 8 % от общего гемоглобина,
карбоксигемоглобин в количестве менее 5 % от общего гемоглобина;
натрий в концентрации 135-155 ммоль/л;
калий в концентрации 3,5-4,5 ммоль/л;
хлорид в концентрации 85-110 ммоль/кг.
6
BY 7250 C1 2005.09.30
Предпочтительно водный раствор гемоглобина содержит
свободное железо в количестве менее 2,0 ч/млн.;
тетрамеры в количестве менее 0,8 % от общего гемоглобина;
эндоксин в количестве менее 0,03 EU/мл.
Предпочтительно водный раствор гемоглобина содержит
фосфолипиды в количестве менее 50 нг/Hb;
гликолипиды в количестве менее 2 нг/Hb.
В предпочтительном варианте водный раствор гемоглобина имеет осмотическое давление в пределах 280-360 ммоль/кг, а диссоциация окисленного гемоглобина находится в
пределах 23-32 торр. Период полураспада водного раствора гемоглобина в организме человека составляет, по меньшей мере, около 15 ч, предпочтительно около 24 ч. Водный
раствор гемоглобина не вызывает ощутимого снижения почечной активности при введении в организм человека в количестве до 5 л, при этом период его полураспада в организме человека составляет 24 ч. В предпочтительном варианте пиридоксилированный полимеризованный гемоглобин представляет собой полимеризованный глютаральдегидом гемоглобин.
В одном из вариантов водный раствор гемоглобина включает около 16 % полимера
гемоглобина с молекулярной массой около 128 кД, около 26 % полимера гемоглобина с
молекулярной массой около 192 кД и около 58 % полимера гемоглобина с молекулярной
массой около 256 кД.
Предметом изобретения является также способ получения водного раствора пиридоксилированного полимеризованного гемоглобина, включающий следующие стадии:
(а) удаление лейкоцитов путем фильтрации смеси, содержащей эритроциты, через
фильтр, имеющий минимальный средний размер пор, достаточный для предотвращения
прохождения лейкоцитов.
(б) лизис эритроцитов;
(в) введение монооксида углерода в резервуар, содержащий препарат, полученный на
стадии (б), нагревание до температуры около 60-62 °С в течение 10 ч и получение термически обработанного раствора гемоглобина;
(г) фильтрацию термически обработанного раствора гемоглобина для удаления стромы и примесей стромы, осаждаемых при нагревании;
(д) дегазацию полученного на стадии (г) раствора путем барботирования кислорода и
затем азота через указанный раствор при температуре около 10 °С для создания пены и
получение дегазированного термически обработанного раствора гемоглобина;
(е) пиридоксилирование гемоглобина в дегазированном растворе и получение раствора пиридоксилированного гемоглобина;
(ж) полимеризацию пиридоксилированного гемоглобина с помощью агента полимеризации в течение времени, достаточного для получения раствора пиридоксилированного
полимеризованного гемоглобина, содержащего 10-24 % от массы общего гемоглобина полимера гемоглобина с молекулярной массой 128 кД, 18-30 % от массы общего гемоглобина полимера гемоглобина с молекулярной массой 192 кД и 45-70 % от массы общего гемоглобина полимера гемоглобина с молекулярной массой 256 кД;
(з) оксигенирование полученного на стадии (ж) раствора;
(и) очистку раствора от тетрамеров гемоглобина и сбор очищенного раствора пиридоксилированного полимеризованного гемоглобина, содержащего менее 0,8 % тетрамеров
от массы общего гемоглобина;
(к) дезоксигенирование очищенного раствора пиридоксилированного полимеризованного гемоглобина; и
(л) доведение рН и уровней электролитов в очищенном растворе пиридоксилированного полимеризованного гемоглобина до физиологических уровней.
7
BY 7250 C1 2005.09.30
В предпочтительном варианте гемоглобин пиридоксилируют пиридоксаль-5'фосфатом при молярном соотношении пиридоксаль-5'-фосфата и гемоглобина (1-3):1,
предпочтительно около 2:1. Гемоглобин пиридоксилируют в течение около одного часа в
присутствии боргидрида, затем пиридоксилированный гемоглобин полимеризуют глютаральдегидом при молярном соотношении глютаральдегида и гемоглобина около 24:1 в течение около 18 ч, затем раствор пиридоксилированного полимеризованного гемоглобина
охлаждают.
Еще одним предметом изобретения является способ лечения пациента при потере крови, включающий внутривенное введение пациенту до 5,0 л водного раствора пиридоксилированного полимеризованного гемоглобина. Вводят раствор гемоглобина, содержащий
около 16 % от массы общего гемоглобина полимера гемоглобина с молекулярной массой
около 128 кД около 26 % от массы общего гемоглобина полимера гемоглобина с молекулярной массой около 192 кД и около 58 % от массы общего гемоглобина полимеров гемоглобина с молекулярной массой около 256 кД.
Предметом изобретения является также водный раствор и способ получения водного
раствора пиридоксилированного полимеризованного гемоглобина, включающий 10-24 %
от массы общего гемоглобина полимера гемоглобина с молекулярной массой 128 кД, 1830 % от массы общего гемоглобина полимера гемоглобина с молекулярной массой 192 кД,
45-70 % от массы общего гемоглобина полимера гемоглобина с молекулярной массой 256 кД,
полученный способом, включающим
(а) пропускание просроченной или свежей крови через подходящее аспирационное
устройство при пониженном давлении для получения аспирированной крови,
(б) удаление лейкоцитов из аспирированной крови ее фильтрацией через ряд фильтров, имеющих минимальный средний размер пор, достаточный для предотвращения прохождения лейкоцитов;
(в) введение монооксида углерода в резервуар, содержащий препарат, полученный на
стадии (б), причем рН полученного препарата составляет приблизительно 6,0-6,5;
(г) промывание полученного на стадии (в) препарата 1 % раствором хлорида натрия;
(д) разведение полученного на стадии (г) препарата водой и получение раствора гемоглобина из лизированных клеток;
(е) фильтрацию полученного на стадии (д) раствора и получение раствора гемоглобина, свободного от примесей стромы и материала клеточной стенки;
(ж) нагревание при температуре приблизительно 60-62 °С в течение около 10 ч полученного на стадии (е) раствора гемоглобина с последующей фильтрацией и получение
термически обработанного, свободного от стромы, раствора гемоглобина;
(з) концентрирование и диафильтрацию полученного на стадии (ж) раствора гемоглобина и получение раствора карбоксигемоглобина;
(и) дегазацию раствора карбоксигемоглобина путем барботирования кислорода и затем азота через указанный раствор при температуре около 10 °С для создания пены и получение дегазированного термически обработанного раствора гемоглобина;
(к) пиридоксилирование гемоглобина в дегазированном растворе пиридоксаль-5'фосфатом при молярном соотношении пиридоксаль-5'-фосфата и гемоглобин (1-3):1 и получение раствора пиридоксилированного гемоглобина;
(л) полимеризацию пиридоксилированного гемоглобина глютаральдегидом и получение раствора пиридоксилированного полимеризованного гемоглобина, содержащего около 65-75 мас. % полимеров и около 25-35 мас. % тетрамеров;
(м) оксигенирование и разбавление раствора пиридоксилированного полимеризованного
гемоглобина до получения раствора, содержащего приблизительно 4 мас. % гемоглобина;
(н) очистку полученного на стадии (м) раствора и удаление тетрамерного гемоглобина
и сбор очищенного раствора пиридоксилированного полимеризованного гемоглобина, содержащего менее 0,8 % тетрамеров от общей массы гемоглобина;
8
BY 7250 C1 2005.09.30
(о) дезоксигенирование очищенного раствора пиридоксилированного полимеризованного гемоглобина барботированием азота через указанный раствор;
(п) доведение рН и уровней электролитов в очищенном растворе пиридоксилированного полимеризованного гемоглобина до 8,8-9,0, и
(р) концентрирование и стерилизацию полученного на стадии (п) раствора.
Предметом изобретения является также конкретный вариант водного раствора пиридоксилированного полимеризованного гемоглобина, имеющий следующие характеристики:
общий гемоглобин в количестве 9,5-12,0 г/дл;
метгемоглобин в количестве менее 8 % от общего гемоглобина;
карбоксигемоглобин в количестве менее 5 % от общего гемоглобина;
диссоциация окисленного гемоглобина в пределах 23-32 торр;
осмотическое давление в пределах 280-360 ммоль/кг;
концентрация натрия в пределах 135-155 ммоль/л;
концентрация калия в пределах 3,5 - 4,5 ммоль/л;
концентрация хлорида в пределах 85-110 ммоль/кг;
свободное железо в количестве менее 2,0 ч/млн.;
распределение максимальной молекулярной массы 128 кД в пределах 10-24 %;
распределение максимальной молекулярный массы 192 кД в пределах 18-30 %;
распределение максимальной молекулярный массы 256 кД в пределах 45-70 %,
количество тетрамеров менее 0,8 % от общего гемоглобина;
количество эндотоксина менее 0,03 EU/мл; количество фосфолипидов менее 50 нг/Hb;
количество гликолипидов менее 2 нг/Hb.
Предметом изобретения является также водный раствор пиридоксилированного полимеризованного гемоглобина, включающий около 16 % от массы общего гемоглобина полимера гемоглобина с молекулярной массой около 128 кД, около 26 % от массы общего
гемоглобина полимера гемоглобина с молекулярной массой около 192 кД и около 58 % от
массы общего гемоглобина полимера гемоглобина с молекулярной массой около 256 кД,
который предпочтительно не вызывает ощутимого снижения почечной активности при
введении в организм человека в количестве до 1,5 л.
Изобретение включает также способ лечения пациента при потере крови, заключающийся во введении пациенту водного раствора гемоглобина по изобретению.
Изобретение проиллюстрировано на чертежах.
На фиг. 1 представлена принципиальная схема, иллюстрирующая часть способа и оборудования, используемого для получения деоксигенированного раствора гемоглобина,
подготовленного для пиридоксилирования и полимеризации.
На фиг. 2 изображена принципиальная схема, описывающая часть способа и устройства, начиная с пиридоксилирования и полимеризации и заканчивая деоксигенированным,
очищенным, пиридоксилированным, полимеризованным препаратом гемоглобина, и часть
способа и устройства, используемого для получения окончательного препарата гемоглобина, имеющего физиологические уровни электролитов.
На фиг. 3 изображена картина жидкостной хроматографии полимеризированного материала после обработки глицином до очистки. Полимеризованный препарат обозначен пиками
во время удержания (RT) 15.57, 16.08, 17.00 и 18.19. Тетрамический материал обозначен пиками во время удержания 19.88 и 20.51. Полимер составляет 76,2 % этого материала.
На фиг. 4 изображена картина жидкостной хроматографии препарата гемоглобина согласно изобретению. Полимеризация гемоглобина обозначена пиками во время удержания
15.7, 16.33, 17.32 и 18.56. Тетрамер обозначен пиком во время удержания 21.18.
На фиг. 5 представлена принципиальная схема, иллюстрирующая способ очистки с
помощью колоночной хроматографии, использованный в изобретении.
На фиг. 6 изображена принципиальная схема, описывающая способ очистки мембранной фильтрацией, используемый в изобретении.
9
BY 7250 C1 2005.09.30
Настоящее изобретение касается бесклеточных заменителей эритроцитов, включающих существенно-свободный от тетрамеров, полимеризованный, пиридоксилированный
гемоглобин с поперечными связями, который существенно свободен от стромы, стромальных и других примесей.
Термин "поперечные связи" означает химическое местоположение молекулярных
"мостов" на молекуле или в молекуле, или между молекулами с целью изменения формы,
размеров, функций или физических свойств молекулы. Молекулы с поперечными связями
могут быть полимеризованы или неполимеризованы, то есть молекулы с поперечными
связями могут быть тетрамерными.
Термин "тетрамер" относится к молекулам гемоглобина, имеющим молекулярный вес
около 64 кДа; то есть термин относится к нативным и внутримолекулярным молекулам
гемоглобина с поперечными связями.
Термин "существенно свободный от тетрамеров" обозначает уровень чистоты по отношению к примесям тетрамеров, при котором не наблюдаются определенные биологические ответы на введение тетрамеров млекопитающим. Главный критерий - отсутствие изменений в функции почек при введении фармацевтически эффективных количеств, то
есть на уровне чистоты приблизительно 99 % или выше (при наличии менее 1 % тетрамеров). Предпочтительный препарат, полученный по способу согласно изобретению, содержит не более 0,8 % тетрамеров от общего веса гемоглобина (THb). Другими словами, существенно свободный от тетрамеров препарат, согласно изобретению, содержит не более,
чем физиологически допустимые количества неполимеризованных тетрамеров гемоглобина. Предпочтительные препараты, согласно изобретению, содержат менее 0,5 % тетрамеров, а наиболее предпочтительные препараты, согласно изобретению, содержат приблизительно 0,3-0,4 % тетрамеров. Обнаружено, что такие количества тетрамеров являются физиологически допустимыми.
Термины "сверхочищенный препарат" или "очищенный препарат" имеют то же самое
значение, что и термин "существенно свободный от тетрамеров".
Как указано, % общего гемоглобина (THb) определен как вес гемоглобина в граммах
на 100 мл раствора.
Термин "полимеризация раствора" обозначает раствор, содержащий "структурирующий" или полимеризирующий агент, например глютаральдегид, имидоэфиры, диаспирин
или другие агенты, в биохимически подходящем носителе.
Термин "полимеризованный" обозначает размещение молекулярных мостов между
молекулами или указывает на тетрамеры, если размер и вес полученной в результате полимеризованной молекулы увеличивается по отношению к нативному или тетрамерному
гемоглобину. Полимеризованный гемоглобин не является тетрамерным гемоглобином.
Под раствором гемоглобина следует понимать раствор тетрамерного гемоглобина или
полимеризованных молекул гемоглобина, в котором молекулы не находятся внутри эритроцита. Такому раствору не нужна существенная очистка от стромы эритроцитов или
стромальных примесей. Однако предпочтительными являются полимеризованные растворы гемоглобина, которые свободны от стромы эритроцитов и стромальных примесей.
Термин "полупроницаемая мембрана" означает мембрану, проницаемую только для
некоторых видов молекул, то есть мембрану, которая работает как селективный фильтр,
исключающий некоторые молекулярные веса.
Препарат, полученный по способу согласно настоящему изобретению, полимеризованный, пиридоксилированный раствор гемоглобина, существенно свободный от тетрамеров (нативный или с внутримолекулярными поперечными связями) гемоглобин со стромальными и другими различными примесями, полученный из термически обработанного,
инактивируемого от вирусов тетрамерного гемоглобина, является физиологически приемлемым, а также удобным для терапевтического и клинического применения. Препарат
способен связывать реверсивный кислород, что необходимо для транспортировки кисло10
BY 7250 C1 2005.09.30
рода. Наиболее важным является то, что препарат имеет хорошие характеристики при
введении и выведении, что соответствует кривой диссоциации (Р50) аналогично цельной
крови. Препарат связывает кислород с высокой афинностью в капиллярах через легкие и
затем соответственно высвобождает кислород в тканях организма. Препарат также не требует исследований на совместимость с реципиентом.
Кроме того, при введении человеку препарат также имеет период полусуществования
по меньшей мере 15 ч и более предпочтительно 24 ч. Этот препарат гемоглобина может
быть введен пациентам в количествах приблизительно до 3,0 л и даже до 5,0 л. Иначе говоря, изобретенный препарат гемоглобина можно использовать для существенного пополнения всего объема крови пациента, не вызывая при этом вазоконстрикции, почечной
токсичности, гемоглобинурии или других нарушений, связанных с внутривенным введением синтетического или полусинтетического носителя кислорода и заменителей крови.
Таким образом, изобретение включает способ переливания пациенту, предпочтительно
человеку, определенного количества бесстромального, свободного от тетрамеров, полимеризованного, пиридоксилированного препарата гемоглобина, который является нетоксичным по отношению к пациенту, в количестве по меньшей мере приблизительно 5,0 л.
Такой способ включает присоединение к пациенту или субъекту устройства для инфузии
или другого подобного оборудования для инфузии или переливания.
Способ, согласно изобретению, характеризуется тем, что согласно ему получают препарат, имеющий уровень тетрамеров не более 1 % и предпочтительнее не более 0,8 % от общего
веса гемоглобина в растворе. Преимущество способа, согласно изобретению, заключается в
том, что можно получать конечный продукт, существенно очищенный от микробных и вирусных антигенов и патогенов. То есть уровни таких микробных и вирусных антигенов и патогенов снижены до необнаруживаемых. Препарат стерилен, что определено анализом, установленным в Фармакопеи США, глава XXIII <71>. Примерами таких антигенов и патогенов
являются, например, бактерии, риккетсии, грибы, простейшие, вирусы и другие организмы.
Наиболее важным является то, что благодаря способу получают биологический препарат, в
котором отсутствуют вирусы, вызывающие гепатит и синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД).
Что касается физиологических свойств, то биологический препарат, согласно данному
изобретению, при вливании в количествах по меньшей мере 5,0 л не вызывает вазоконстрикции, почечной токсичности, гемоглобинурии и других нарушений, связанных с внутривенным введением известных растворов гемоглобина, содержащих физиологически нежелательные количества тетрамерного гемоглобина. Внутривенное введение препарата, полученного согласно данному способу, не вызывает значительного уменьшения образования
мочи, значительного снижения скорости клубочковой фильтрации, значительной транссудации в брюшную полость и значительного изменения цвета образовавшейся мочи.
Следовательно, способ, согласно изобретению, обеспечивает получение бесклеточных
заменителей эритроцитов, которые используют при лечении травм, инфаркта миокарда,
ушибов, острой анемии и заболеваний, связанных с кислородной недостаточностью, например, гипоксинемии, гипоксии или конечной стадии гипоксии из-за недостаточной
функции или отсутствия функций легких, связанных с полным насыщением крови кислородом. Препарат также можно применять при лечении любого заболевания или состояния,
требующего восстановления содержания жидкости (например, травмы, в частности, геморрагический шок), введения внутрисосудистого расширителя объема или переливания
крови. В дополнение к терапевтическому лечению препарат можно использовать для сохранения органов для трансплантатов.
Способ, согласно изобретению, включает следующие процедуры:
1) отсасывание и фильтрацию эритроцитов;
2) промывание/лизис клеток;
3) термическую обработку;
11
BY 7250 C1 2005.09.30
4) концентрацию ультрафильтрацией;
5) дегазификацию;
6) химическую модификацию;
7) очистку;
8) поликонцентрацию ненасыщенных сложных полиэфиров (UP);
9) деоксигенацию;
10) композицию.
Предпочтительный исходный материал для осуществления способа, согласно настоящему изобретению, представляет собой цельную кровь человека с истекшим сроком действия или эритроцитарную массу. Кроме того, можно использовать также свежую кровь.
Предпочтительно, цельная кровь не используется по этому способу, если она хранится более 2 недель с даты истечения срока, обозначенной на пакете. Применение цельной крови,
которая хранилась более 2 недель, приводит к дополнительной трудности при экстракции
гемоглобина и удалении остатков клеток, например, стромальных белков и примесей.
Все описанные здесь способы можно применять для крови других млекопитающих с
возможными незначительными изменениями в пределах знаний специалистов. Большинство способов можно осуществлять при температуре от 2 °С до 8 °С, предпочтительно
около 4 °С.
Во время отсасывания и фильтрации эритроцитов их асептически экстрагируют из пакетов с донорской кровью без контакта воздуха с кровью и пропускают через ряд последовательных фильтров для получения суспензии эритроцитов с пониженным содержанием лейкоцитов и тромбоцитов. В полученной суспензии затем промывают и лизируют клетки.
Суспензию промывают под атмосферой монооксида углерода с 1 % раствором NaCl для
устранения остаточных белков плазмы. Затем промытые эритроциты обрабатывают водой
для инъекции для проведения лизиса клеток, а полученную смесь очищают, используя устройство фильтрации поперечного потока. Очищенный препарат подвергают термической обработке для осаждения дополнительного стромального материала, который удаляют фильтрацией. Препаратом, полученным в результате этой процедуры, является бесстромальный
раствор гемоглобина с содержанием THb приблизительно 3 % (в отношении веса к объему).
Термически обработанный бесстромальный раствор гемоглобина, содержащий карбоксигемоглобин, концентрируют и дегазируют для получения бесстромального раствора гемоглобина, содержащего деоксигемоглобин. Дегазификация включает вначале насыщение раствора
карбоксигемоглобина кислородом на 16 ч для получения раствора оксигенированного гемоглобина и карбоксигемоглобина, составляющего приблизительно 7 % от общего веса гемоглобина. Затем кислород удаляют с азотом, аргоном или гелием для получения раствора, содержащего свободный гемоглобин, то есть некомплексный гемоглобин и оксигемоглобин,
составляющий приблизительно 7 % от общего веса гемоглобина. Полученный в результате
дегазированный раствор фильтруют и помещают в сосуд для химической модификации.
После дегазификации бесстромальный раствор гемоглобина пиридоксилируют, используя пиридоксаль-5'-фосфат в молярном соотношении пиридоксаль-5'-фосфата к гемоглобину приблизительно от 1:1 до 3:1. Кроме того, бесстромальный гемоглобин можно
пиридоксилировать при использовании 2-Nor-2 формил пиридоксаль-5'-фосфата. К пиридоксилированной смеси добавляют предпочтительно восстановитель, например, цианоборгидрид натрия или боргидрид натрия. Избыточные реагенты и соли удаляют диализом
на безводном пирогене или, предпочтительно, диафильтрацией с водой для инъекции. Затем пиридоксилированный гемоглобин полимеризуют с раствором глютаральдегида.
Бесстромальный пиридоксилированный раствор гемоглобина полимеризуют при использовании водного раствора глютаральдегида. Продолжительность полимеризации и
количество добавленного глютаральдегида зависит от объема раствора гемоглобина, желаемого выхода полимеров и желаемого распределения по молекулярному весу. Как правило, более длительная по времени полимеризация увеличивает выход и распределение
12
BY 7250 C1 2005.09.30
полимеров по молекулярному весу. Приблизительно через 16-18 ч получают выход полимеров, составляющий приблизительно 75 % от общего веса гемоглобина. Предпочтительная конечная точка полимеризации определяется как точка, в которой раствор содержит
приблизительно 75 % полимеров от общего веса гемоглобина, что определяется с помощью масштабной эксклюзионной жидкостной хроматографии. Кроме того, конечную точку определяют как точку, в которой раствор содержит приблизительно 65 % полимеров от
общего веса гемоглобина, то есть приблизительно 2,5 ч.
Реакцию полимеризации подавляют добавлением водного глицина. Буфер необходимо
добавлять по возможности быстро. Затем поперечные связи стабилизируют при быстром
добавлении раствора водного боргидрида натрия. Этот полимеризованный раствор затем
концентрируют и диафильтруют под атмосферой кислорода для оксигенирования раствора. Затем к раствору добавляют воду до получения раствора, содержащего приблизительно 4 % по весу гемоглобина.
В результате полимеризации, согласно изобретению, получают высокий выход полимеров, имеющих узкую молекулярную амплитуду по весу, как показано ниже на фиг. 3 и в
примере 1.
Затем полимеризованный, пиридоксилированный раствор гемоглобина очищают методом
колоночной хроматографии или фильтрации, например мембранной фильтрации, или обоими
методами, удаляют остаточный неполимеризованный (тетрамерный) гемоглобин из раствора.
Затем очищенный полимеризованный раствор гемоглобина концентрируют приблизительно
до 6 %-го раствора посредством аппарата ультрафильтрации в препарате для газового обмена.
Затем концентрированный раствор деоксигенируют азотом. Деоксигенацию производят при 10-12 °С до получения раствора, содержащего оксигемоглобин в количестве менее
16 % от общего веса гемоглобина.
Затем полученный деоксигенированный очищенный и полимеризованный раствор гемоглобина концентрируют ультрафильтрацией под атмосферой азота в охлажденном сосуде, рН устанавливают приблизительно 8,8-9,0, и количество электролитов может быть
установлено по мере необходимости до уровней, характерных для нормальной плазмы.
Кроме того, можно также произвольно добавлять обычные антиоксиданты, например
глютатион, аскорбат или глюкозу.
Затем раствор концентрируют до желательного уровня, предпочтительно полимеризуют 10 % по весу, пиридоксилируют, очищают гемоглобин, освобождают от тетрамеров
и от стромы, раствор стерилизуют фильтрацией и помещают с помощью стерильного пропускного устройства в подходящие фармацевтически приемлемые контейнеры.
Ниже представлены характеристики полученного раствора гемоглобина:
Общий гемоглобин (г/дл)1
Метгемоглобин ( % от общего количества Hb)1
Карбоксигемоглобин ( % от общего количества Hb)
P50 (торр)1
Осмотическое давление (ммоль/кг)2
Натрий (ммоль/л)3
Калий (ммоль/л)3
Хлорид (ммоль/л)3
Свободное железо (млн-1) 4
Распределение молекулярного веса - 128 кд пик ( %)5
Распределение молекулярного веса - 192 кд пик ( %)5
Распределение молекулярного веса - 256 кд пик ( %)5
Тетрамер (64 К) ( %)5
13
Полимеризованный гемоглобин
9,5-12,0
<8,0
<5,0
23-32
280-360
135-155
3,5-4,5
85-110
<2,0
10-24
18-30
45-70
<0,8
BY 7250 C1 2005.09.30
Эндотоксин (ЕU) /мл)6
<0,03
7
Фосфолипиды нг/Hb
<50
7
Гликолипиды (нг/Hb)
<2
1
определен спектрофотометрически.
2
определен осмометрией.
3
определен ион-специфическим электродом.
4
определен атомной абсорбцией.
5
определен масштабной эксклюзионной жидкостной хроматографией высокого давления.
6
определен LAL с помощью анализа, поставляемого от Associates of Cape Cod, компоненты анализа имеют в каталоге номера 100-5, 800-1 и 3100-5. Определен масштабной
эксклюзионной жидкостной хроматографией высокого давления.
Следующие примеры иллюстрируют некоторые аспекты настоящего изобретения. Однако следует понимать, что эти примеры предназначены только для иллюстративных целей и не охватывают все аспекты и объем настоящего изобретения. Все температуры выражены в градусах по Цельсию, если не указано иначе. Если не указано иначе, все проценты, например, общего гемоглобина (THb) выражены как соотношение вес/объем (w/v).
Также необходимо отметить, что если указаны типичные условия реакции (например,
температура, время реакции), можно использовать условия, которые находятся выше или
ниже этих определенных диапазонов, хотя это, как правило, менее удобно.
Если не указано иначе, все сосуды и резервуары, используемые в способе согласно
изобретению, изготовлены из нержавеющей стали марки 316-L, предпочтительно из фармацевтического сорта такой нержавеющей стали, которую можно отполировать до зеркального блеска и, следовательно, можно легко и быстро очистить. Различные штуцеры и
трубки сделаны из той же самой нержавеющей стали или же стали фармацевтического
сорта Тефлон или силиконового тюбинга. Фильтры и мембраны, используемые в способе,
могут быть приобретены от Millpore Inc., Pall-Filtron или Cuno Inc.
Период полусуществования полученного препарата, согласно изобретению, определен
in vivo для млекопитающих, например человека. Обычно берут пробу крови у млекопитающего через какой-то промежуток времени после введения препарата млекопитающему. Затем определяют центрифугированием пробы крови количество препарата, экспрессируют плазменную часть, определяют спектрофотометрически уровень плазменного гемоглобина и затем соотносят количество препарата, оставшегося в млекопитающем, с
периодом полусуществования препарата.
Масштабную эксклюзионную жидкостную хроматографию высокого давления, согласно изобретению, проводят следующим образом.
Образец, разбавленный 0,2 M, рН 6,9 буфера фосфата калия до 0,2 г/дл, фильтруют
через 0,2 мкм фильтр и вводят в систему жидкостной хроматографии высокого давления,
включающую следующие компоненты (по направлению движения потока системы):
1. Насос модели Pharmacia 2248:
- подвижная фаза - 0,2 M, рН 6,9 фосфата калия
- скорость потока 1,0 мл/мин.
2. Титановую трубку РЕЕК длиной 45 см, 0,010 дюйма для внутрикожного введения.
3. Модель инжектора Rheodyne 7725i с типовой петлей РЕЕК 200 мкл.
4. Титановую трубку РЕЕК длиной 18 см, 0,010 дюйма для внутрикожного введения.
5. Модель фильтра Upchurch A43 10,5 мкм.
6. Титановую трубку РЕЕК длиной 9 см, 0,010 дюйма для внутрикожного введения.
7. Phenomenex Biosep SEC S-3000 75×7,8 мм с защитной колонкой.
8. Титановую трубку РЕЕК длиной 24 см, 0,010 дюйма для внутрикожного введения.
9. Phenomenex Biosep SEC S-3000 600×7,8 мм с аналитической колонкой.
10. Титановую трубку РЕЕК длиной 23 см, 0,010 дюйма для внутрикожного введения.
14
BY 7250 C1 2005.09.30
11. Датчик ультрафиолетовых лучей Pharmacia Uvicord SD.
длина волны:
280 нм
поток клеток:
объем - 8 мкл, длина пути - 2,5 мм
амплитуда:
2 AUFS
постоянное время:
10 с
Пиковую спектральную поглощательную способность при длине волны 280 нм регистрируют интегратором LKB 2221, который интегрирует индивидуальные пиковые области и вычисляет общую область гемоглобина для разновидности каждого полимера.
Следующие примеры поясняют изобретение, однако не ограничивают его.
Пример 1.
Как видно из Фиг. 1, пакеты 20 с донорской кровью, имеющей истекший срок действия (цельной кровью или эритроцитарной массой), помещают в подходящее асептическое
отсасывающее устройство 22. Примером подходящего отсасывающего устройства служит
система, имеющая два отсасывающих блока. Один пакет с донорской кровью помещают в
отсасывающий блок, иглой отсасывающего аппарата прокалывают пакет с донорской кровью, вводят приблизительно 150 мл 1 % (w/v) водного раствора хлорида натрия и отсасывают кровь с истекшим сроком действия из донорского пакета под пониженным давлением или вакуумом. Аспирационную кровь пропускают через фильтр 24 толщиной 100 мкм,
а затем - через два последовательных фильтра 26 толщиной 5 мкм. Когда кровь проходит
через фильтры толщиной 5 мкм, из нее удаляются лейкоциты. Обычно отсасывают приблизительно 170 единиц цельной крови с истекшим сроком действия, фильтруют и затем
помещают в резервуар 1, как показано на фиг. 1. Затем фильтры промывают приблизительно 75 л 1 % (w/v) водного раствора хлорида натрия.
До введения крови в резервуар 1 его наполняют приблизительно 70 л 1 % водного раствора хлорида натрия. После отсасывания 170 единиц цельной крови с истекшим сроком
действия ее фильтруют, фильтры промывают. Резервуар содержит приблизительно 250
литров 4 % раствора общего гемоглобина. В течение этапов отсасывания и фильтрации в
резервуаре 1 поддерживается пониженное давление, то есть вакуум 508-711,2 мм ртутного
столба (20-28 дюймов ртутного столба). После помещения всей крови с истекшим сроком
действия в резервуар 1 вакуум отключают и в резервуар подают оксид углерода таким образом, чтобы он содержал атмосферу монооксида углерода.
Резервуар 1 соединен с тангенциальным проточным фильтром 0,65 мкм 28, как показано на фиг. 1. Начальную загрузку 250 л 4 % раствора общего гемоглобина концентрируют приблизительно до 125 л 8 % раствора общего гемоглобина микрофильтрацией через тангенциальный проточный фильтр. рН раствора гемоглобина в этой точке составляет
приблизительно от 6 до 6,5. Раствор концентрацией 8 % общего гемоглобина промывают,
добавляя 1 % (w/v) раствор хлорида натрия, диафильтруют и удаляют фильтрат с той же
самой скоростью, с какой добавляли раствор хлорида натрия. Как правило, 125 л раствора
гемоглобина промывают приблизительно 8 объемами 1 % раствора хлорида натрия (приблизительно 1,000 л). После промывания раствор концентрируют приблизительно до 70 л,
в частности, приблизительно до 14 % общего гемоглобина, и добавляют "воду для инъекции" для получения раствора объемом приблизительно 180 л. После добавления воды для
инъекции клетки разбухают и разрываются, высвобождая гемоглобин в раствор. Концентрация полученного раствора гемоглобина составляет приблизительно 5 % от общего гемоглобина (THb).
Полученный раствор очищают в резервуаре 1. Раствор вначале концентрируют приблизительно до 50 л, и фильтрат помещают в резервуар 2. Поскольку раствор нагнетают
через фильтр, то фильтром собирают и удаляют материал клеточных стенок и примеси
стромы эритроцитов. Оставшиеся 50 л раствора в резервуаре 1 промывают (диафильтруют) приблизительно 2,5 объемами воды для инъекции. Эти 2,5 объема после промывания
15
BY 7250 C1 2005.09.30
добавляют в резервуар 2. Затем остающийся в резервуаре 1 материал концентрируют приблизительно до 20 л, а фильтрат добавляют в резервуар 2. Полученный объем в резервуаре
2 составляет приблизительно 280 л 3,3 % раствора общего гемоглобина.
Полученный раствор бесстромального гемоглобина нагревают в резервуаре 2 при
температуре около 60-62 °С в течение приблизительно 10 ч. В течение этого времени раствор медленно перемешивают. Поскольку раствор пропускают через систему и нагревают
до температуры 55 °С, образуется осадок.
Полученный бесстромальный 3,3 % THb (w/v), нагретый раствор гемоглобина фильтруют через 0,2 мкм фильтр 30, затем через 0,1 мкм фильтр 32 и помещают в резервуар 3.
Отфильтрованный раствор гемоглобина концентрируют до 18 % THb и затем промывают
и диафильтруют с 4 объемами воды для инъекции (180 л). Концентрирование и диафильтрацию осуществляют при использовании молекулярного ультрафильтра 34 весом 10 килодальтон (кД). Фильтрат собирает дренаж 35, связанный с ультрафильтром 34. В этой точке
45 л 18 % раствора общего гемоглобина содержит менее 50 нг фосфолипидов на грамм
гемоглобина, менее 2 нг гликолипидов на грамм гемоглобина, менее 1 % метгемоглобина,
менее 0,03 единиц эндотоксина на миллилитр эндотоксина при рН приблизительно от 6 до
6,5. Этот гемоглобин в растворе называется карбоксигемоглобин.
Затем полученный раствор карбоксигемоглобина помещают в резервуар 4, где карбоксигемоглобин вначале оксигенируют, а затем деоксигенируют. Резервуар 4 оборудован
кольцом для распрыскивания газа, соединенным с линиями подачи газов кислорода и азота, подача осуществляется от основания резервуара до измерительного устройства распыления, расположенного наверху резервуара 4, а коллектор обильного выделения пены связан с пеносборником 1 таким образом, что пену, полученную в резервуаре 4, подают в пеносборник 36, где пена конденсируется в жидкость и подается обратно в резервуар 4.
Резервуар 4 также включает набор колец Полла, заполняющих приблизительно одну треть
объема резервуара. Пеносборник 36 включает газовую вентиляционную трубку для удаления газа. Раствор в резервуаре 4 представляет собой 13 % раствор общего гемоглобина.
Во время первой стадии оксигенации кислород распыляется через раствор со скоростью, достаточной для получения однородной дисперсии газа в сосуде. В сосуд объемом
200 л распыляют газ со скоростью приблизительно 25 л/мин. Оксигенация карбоксигемоглобина проводится приблизительно в течение 16 ч таким образом, что полученный раствор
содержит менее 5 % карбоксигемоглобина на общий вес гемоглобина. Оксигенация проводится при температуре около 10 °С. Пену, полученную в резервуаре 4, собирают в пеносборник 36 и после ее осаждения полученный раствор помещают обратно в резервуар 4.
После оксигенации в раствор подобным потоком распыляют азот в течение приблизительно 6 ч или до тех пор, пока в растворе содержится менее 10 % оксигемоглобина от
общего веса остатков гемоглобина. Азот распыляют при температуре около 10 °С, рН составляет от 6 до 6,5. Кроме того, карбоксигемоглобин можно преобразовать в деоксигемоглобин с помощью мембранного обменника. Отмечено отсутствие денатурации гемоглобина, которая обычно происходит на стадии пенообразования. Теперь полученный деоксигенированный раствор готов для химической модификации.
Из фиг. 2 видно, что раствор деоксигемоглобина помещают в резервуар 5 для химической модификации. В резервуар 5, содержащий раствор деоксигемоглобина при температуре раствора около 4 °С, затем добавляют водный раствор пиридоксил-5-фосфата (Р5Р)
(93,75 г/л) при молярном соотношении Р5Р к гемоглобину от 1:1 до 3:1. Предпочтительным является молярное соотношение Р5Р к гемоглобину 2:1. Пиридоксилирование проводится при температуре около 4 °С. Раствор Р5Р обычно добавляют в течение 1 мин и перемешивают 15 мин, после чего к раствору гемоглобина добавляют раствор боргидрида
натрия/гидроксида натрия при молярном соотношении боргидрида натрия к гемоглобину
около 20:1. Подходящий водный раствор боргидрида натрия/гидроксида натрия содержит
0,8 г гидрохлорида натрия на 2 л и 90,8 г боргидрида натрия на 2 л. Раствор боргидрида
16
BY 7250 C1 2005.09.30
добавляют как можно быстрее в течение 1 мин и затем перемешивают в течение одного
часа. Полученный 50 л раствор пиридоксилированного гемоглобина диафильтруют при
использовании ультрафильтра 38 10 К Дальтон для удаления избытка реагентов в 4 объемах воды для инъекции. Дренаж 40, связанный с ультрафильтром 38, собирает фильтрат
из фильтра 38.
После диафильтрации в 4 объемах, то есть в 200 л воды для инъекции, происходит полимеризация гемоглобина. В резервуар 5, содержащий пиридоксилированный гемоглобин,
добавляют достаточное количество воды для инъекции для получения 4,5 % раствора общего гемоглобина (приблизительно 175 л раствора гемоглобина). Раствор глютаральдегида
добавляют к пиридоксилированному раствору при молярном соотношении глютаральдегида к гемоглобину около 24:1. Раствор глютаральдегида обычно добавляют к раствору гемоглобина дозирующим насосом в течение 2,5 ч. Реакция полимеризации длится приблизительно 18 ч. Целевое распределение молекулярного веса составляет примерно 75 % полимеров и 25 % тетрамеров. Целевые полимеры имеют молекулярные веса менее 600,000 с
преобладанием фракции с молекулярными весами в диапазоне 100,000-350,000.
Когда реакция полимеризации достигает целевого распределения молекулярного веса
(через 18 ч), добавляют водный глицин (около 166 г/л) (как охладитель) к раствору гемоглобина при молярном соотношении глицина к гемоглобину 140:1. См. Фиг. 3, на котором
представлена траектория жидкостной хроматографии высокого давления полученного полимеризованного препарата гемоглобина, охлажденного глицином. Затем полученный
раствор перемешивают в течение 10 мин после добавления раствора боргидрида натрия/гидроксида натрия (с указанной выше концентрацией) к раствору гемоглобина при
молярном соотношении боргидрида натрия к гемоглобину 28:1.
Полученную смесь перемешивают около 1 ч. Затем раствор концентрируют до 50 л
(ультрафильтром 38) и промывают 4 объемами (200 л) воды для инъекции. К концентрированному раствору добавляют дополнительную аликвоту боргидрида натрия в том же
самом молярном соотношении, как указано выше, и снова перемешивают в течение 1 ч.
Полученный раствор промывают 4 объемами воды для инъекции (200 л) для получения
полимеризованного, пиридоксилированного, бесстромального гемоглобина, который затем нагревают.
Полученный раствор оксигенируют, выдерживают раствор под атмосферой кислорода
и затем помещают в систему очистки 42. Очистку осуществляют с помощью колоночной
хроматографии или фильтрации, предпочтительно мембранной фильтрации (диафильтрации), или путем комбинирования фильтрации и колоночной хроматографии.
Согласно изобретению, раствор помещают в сосуд для подачи раствора хроматографии, т.е. резервуар 6, как показано на фиг. 5. В этом примере осуществления изобретения
полученный раствор оксигемоглобина разбавляют приблизительно до 200 л (4 % общего
гемоглобина) в резервуаре 6, и устанавливают концентрацию хлорида до 22 мМ с помощью раствора хлорида натрия. Не требуется регулирования концентрации натрия.
Затем пять 40 л аликвот полученного раствора гемоглобина хроматографируют, используя колонку 44. Колонка 44 содержит афинный гель, который представляет собой
гель агарозы, модифицированный желтым красителем (поставляемый Affinity Chromatography, Ltd. как миметический желтый № 1), и имеет большую аффинность к полимеру, чем
тетрамер.
Хроматографию осуществляют следующим образом. 40 л оксигенированного, полимеризованного, пиридоксилированного, бесстромального раствора гемоглобина помещают в Колонку 44. Колонку промывают 15 объемами колонки (приблизительно 750 л) 30 мМ
водного буфера NaCl для удаления тетрамеров. Затем колонку промывают приблизительно 250 л из 300 мМ буфера хлорида натрия для промывания полимера. Фракции полимеров собирают в резервуаре 7. Нежелательные фракции направляют на дренаж 46. После
удаления каждой аликвоты колонку восстанавливают 15 мМ раствором HCl (150 л), по17
BY 7250 C1 2005.09.30
вторно уравновешивают 30 мМ водного NaCl (250 л), и в колонку помещают другую аликвоту из поданного раствора (40 л). Колонку снова промывают 30 мМ NaCl, затем - 300
мМ NaCl. К колонке добавляют 40 л аликвот раствора гемоглобина и хроматографируют
до тех пор, пока резервуар 6 не будет пустым.
Собранные в резервуаре 7 фракции подвергают ультрафильтрации (концентрированию), используя фильтр 48, связанный с дренажом 50 до объема около 40 л (6 % общего
гемоглобина). Затем концентрированный раствор гемоглобина помещают в газообменник
резервуара 8 для деоксигенации.
Кроме того, раствор помещают в сосуд 10 для рециркуляции фильтрации, как показано на фиг. 6. Затем гемоглобин разбавляют до 4 % THb в резервуаре 10. Затем 4 % раствор
THb диафильтруют, используя 10 мМ NaCl и фильтр 52 молекулярного веса 300,000, поставляемого Pall-Filtron. Фильтрацию продолжают до прохождения через фильтр 97 % материала гемоглобина в резервуар 11. (Около 3 % материала, т.е. полимеры с большим молекулярным весом остаются в резервуаре 10). Количество гемоглобина определяется
спектрофотометрически с помощью кооксиметра.
Полученный материал в резервуаре 11 имеет около 2 - 4 % THb и содержит 7-10 %
тетрамеров, основанных на THb. Затем 2 - 4 % THb диафильтруют при использовании 10 мМ
NaCl и фильтра 54 молекулярных весов 100,000, поставляемого Pall-Filtron, связанного с
дренажом или ловушкой 56. Фильтрацию продолжают до достижения уровня тетрамеров,
определяемого масштабной эксклюзионной хроматографией BioSep SEC-S3000 600×7,8 мм
не менее 0,8 % массы гемоглобина по весу. Полученные очищенные остатки раствора гемоглобина вначале содержат в резервуаре и затем помещают в газообменный резервуар 8
для деоксигенации.
Газообменный резервуар 8 может быть таким же, как резервуар 4 или, предпочтительно, другим резервуаром. Газообменный резервуар 8 оборудован по существу так же, как и
газообменный резервуар 4 на фиг. 1, и присоединен к пеносборнику 58, аналогично резервуару 4, и пеносборнику 36. Деоксигенацию осуществляют в течение 2,5 ч с распылением
азота при 10 °С и раствора с рН около 7,5. Распыление азота продолжают до тех пор, пока
в растворе не останется менее чем 16 % оксигемоглобина на общий вес остатков гемоглобина в растворе. Полученный раствор деоксигемоглобина помещают в резервуар 9 для
получения композиции.
В резервуаре 9 с композицией раствор вначале концентрируют до 7 % общего гемоглобина, величину рН устанавливают от 8,8 до 9,0 при 4 °С. рН устанавливают, используя
0,2 M NaOH. Затем в растворы гемоглобина, имеющие рН от 8,8 до 9,0, добавляют растворы
электролитов. Глюкозу и глицин добавляют для получения конечных концентраций около 5 г/л и 1,75 г/л соответственно. Хлорид калия добавляют к раствору для получения концентрации калия от 3,5 до 4,5 мМ. Затем добавляют 3 M хлорида натрия для получения
концентрации хлорида 85-110 мМ. Далее добавляют лактат натрия для получения концентрации 135-155 мМ ионов натрия. В заключение добавляют 0,45 молярного раствора аскорбиновой кислоты для получения концентрации аскорбиновой кислоты до 1000 мг/л. Аскорбиновую кислоту добавляют как консервант/антиокислитель для хранения. Полученный
раствор гемоглобина имеет конечное осмотическое давление около 280-360 ммоль на кг.
Затем полученный раствор гемоглобина концентрируют до 10 % раствора общего гемоглобина, используя фильтр 60, связанный с ловушкой 62, раствор гемоглобина стерилизуют фильтрацией через фильтр 64 и асептически заполняют в предварительно стерилизованные пакеты.
Характеристики препарата, полученного в этом примере, комплект А, представлены в
таблице. Кроме того, в таблице представлены характеристики комплектов В и С, полученных согласно процедуре, изложенной выше для комплекта А.
18
BY 7250 C1 2005.09.30
ТЕСТ
Комплект А Комплект В
10,4
10,2
4,6
6,0
0,2
1,4
28,5
26,8
318
320
142
144
4,0
4,0
98
99
0,7
1,2
128:16
128:11
192:26
192:23
8
256 :58
2568:66
0,4
0,3
<0,03
<0,03
Гемоглобин, г/дл
Метгемоглобин, %
Карбоксигемоглобин, %
Р50 (Торр, рН 7,35-7,45, рСО2 35-40 торр)
Осмотическое давление, ммоль/кг
Натрий, ммоль/л
Калий, ммоль/л
Хлорид, ммоль/л
Свободное железо, млн-1
Молекулярный вес
Распределение, % в каждом
Молекулярный вес (кД)
Тетрамер, %
Эндотоксин, EU/мл
Комплект С
10,2
5,6
1,5
27,0
317
142
4,0
94
1,0
128:16
192:26
2568:58
0,4
<0,03
8
Материал также включает небольшое количество материала с высоким молекулярным весом.
Приведенное подробное описание предпочтительных вариантов настоящего изобретения иллюстрирует изобретение, никоим образом не ограничивая его. Следует понимать,
что все модификации, разновидности и эквивалентные решения, очевидные для специалистов в данной области техники, входят в объем заявляемого изобретения.
Фиг. 2
Фиг. 3
19
BY 7250 C1 2005.09.30
Фиг. 4
Фиг. 5
Фиг. 6
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
20
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
5
Размер файла
261 Кб
Теги
by7250, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа