close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY7351

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
BY (11) 7351
(13) C1
(19)
(46) 2005.09.30
(12)
7
(51) A 61K 39/108, 35/74,
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
ПЕРОРАЛЬНАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ ДИАРЕИ
(21) Номер заявки: a 20010529
(22) 1999.12.09
(31) 9804415-9 (32) 1998.12.18 (33) SE
(85) 2001.06.14
(86) PCT/SE99/02306, 1999.12.09
(87) WO 00/37106, 2000.06.29
(43) 2001.12.30
(71) Заявитель: СБЛ ВАКЦИН АБ (SE)
BY 7351 C1 2005.09.30
A 61P 1/00
(72) Авторы: КАРЛИН Нильс; АСКЕЛЁФ
Пер; БЬЯРЕ Ульф (SE)
(73) Патентообладатель: СБЛ ВАКЦИН АБ
(SE)
(56) WO 92/14487 A1.
WO 95/33825 A1.
RU 2043771 C1, 1995.
RU 2070819 C1, 1996.
(57)
1. Пероральная вакцина против диареи у людей, вызываемой энтеротоксигенной E.
coli, содержащая, по крайней мере, 100 µг каждого, по крайней мере, из трех различных
видов антигенов колониеобразующего фактора (CFAs), выбираемых из группы, включающей CFA I, CFA II (CS1, CS2 и CS3) и CFA IV (CS4, CS5 и CS6), на основе инактивированных бактерий E. coli, у которых отсутствует ген, кодирующий термолабильный
энтеротоксин (LT), эффективное количество B-субъединиц холерного токсина (CTB) и
фармацевтически приемлемый носитель, при этом она очищена от видимого присутствия
термостабильного энтеротоксина (ST).
2. Пероральная вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что количество CTB составляет,
по крайней мере, 0,5 мг, а носителем является физиологически приемлемый буферный
раствор.
3. Пероральная вакцина по п. 2, отличающаяся тем, что количество различных видов
CFAs составляет для каждого вида CFA 100-300 µг, а количество CTB составляет 0,5-2,0 мг.
4. Пероральная вакцина по п. 3, отличающаяся тем, что содержит 200 µг CFA I,
200 µг CS1, 150 µг CS2, 200 µг CS4, 150 µг CS5 и 1,0 мг CTB, а физиологически приемлемым буферным раствором является солевой раствор фосфатного буфера.
Настоящее изобретение относится к пероральной вакцине против диареи. В частности,
настоящее изобретение касается композиции пероральной вакцины против диареи у людей, вызываемой E. coli.
Бактерии и вирусы часто экспрессируются внутри или на поверхности их мембранных
белков, которые в определенной среде действуют в качестве опоры, позволяющей организмам специфически ассоциироваться или прикрепляться к поверхности. Такой поверхностью может быть внутренняя стенка желудочно-кишечного тракта, пищевод или любая
другая биологическая поверхность или мембрана, входящая в состав тела человека или
животного, на которой организм может находить оптимальные условия для роста. Микробные мембранные белки такого рода часто называются антигенами колониеобразующего фактора (CFA) или фимбриями. В литературе для такого рода веществ используются
другие слова, такие как пили, гемагглютинины, волокнистые или фибриллярные белки.
BY 7351 C1 2005.09.30
Для удобства далее будет использоваться термин "CFA", охватывающий все виды мембранных белков, которые могут также обладать антигенными свойствами. У большинства
организмов продуцирование их CFA контролируется различными факторами окружающей
среды, которые в свою очередь могут активировать регуляторные гены в плазмиде ДНК.
Известен ряд бактерий, представляющих интерес для медицины, которые способны продуцировать CFA, ассоциированные с их мембраной. К таким бактериям, имеющим наиболее
важное значение для людей, относятся организмы, формирующие колонии в желудочнокишечном тракте и дыхательных путях человека. Примерами организмов, которые образуют колонии в желудочно-кишечном тракте, являются энтеротоксигенные Escherichia
coli, Vibrio cholerae, Helicobacter pylori, Campylobacter, Shigellae, Salmonellae и Yersinia.
Особый интерес с медицинской точки зрения представляет энтеротоксигенная Escherichia coli (ETEC), так как она является одной из главных причин диареи путешественников и детской диареи в развивающихся странах. По подсчетам она вызывает 1 миллиард
случаев заболевания диареей и приводит к по крайней мере 1 миллиону летальных случаев в год, прежде всего летальных случаев среди детей.
Энтеротоксигенные E. coli характеризуются тем, что они продуцируют термолабильный энтеротоксин (LT) и/или термостабильный энтеротоксин (ST).
В международной заявке WO 92/14487, раскрыт способ получения и применения
пероральной вакцины на основе ETEC. Бактерии ETEC с CFAs и их субкомпоненты
(CS-антигены) выращивают в специфичных условиях. После инактивации формалином
бактерии могут затем использоваться в качестве пероральной вакцины против бактерии
ETEC. CFA и СS-антигены будут таким образом действовать в качестве антигенов в иммунологическом процессинге, который будет происходить в кишечнике.
Имелись трудности с увеличением количества продуцируемых бактерий ETEC, включающих CFAs. Решение этих трудностей раскрыто в международной заявке WO 95/33825.
Показано, что составы вакцин на основе ETEC, содержащие В-субъединицу холерного
токсина, обладающего антигенным сходством с термолабильным энтеротоксином ETEC, а
также антигены колониеобразующего фактора ETEC, стимулировали соответствующие
иммунные ответы слизистой оболочки у добровольцев из Швеции (Jertborn M. et al. Vaccine, 1997; 16:255-260).
Для надежности и эффективности продукта композиция вакцины должна быть нетоксична и содержать определенные количества активных ингредиентов, остающихся неизменными от серии к серии.
Целью настоящего изобретения является композиция новой вакцины на основе LTотрицательных инактивированных энтеротоксигенных бактерий E. coli, состоящая из эффективных количеств по крайней мере трех различных видов антигенов колониеобразующего
фактора, а также В-субъединицы холерного токсина (CTB), обладающего антигенным
сходством с термостабильным энтеротоксином ETEC. В последующем композицию вакцины очищают от видимо присутствующего термостабильного энтеротоксина (ST).
LT-отрицательные бактерии ETEC отбирают либо в лаборатории из естественным образом генетически модифицированных штаммов, либо продуцируют с помощью рекомбинантных механизмов.
Видимо присутствующий термостабильный энтеротоксин, представляющий собой
сравнительно небольшой белок длиной в 19 аминокислотных остатков, отмывают во время даунстрим процессинга вакцинной композиции.
Элиминация видимо присутствующих бактерий для продуцирования термолабильного
энтеротоксина и удаление видимо присутствующего термостабильного энтеротоксина
способствует еще большей надежности продукта.
Инактивацию бактерий следует осуществлять таким образом, чтобы антигены колониеобразующего фактора в значительной степени сохранялись, т.е. с помощью мягкой
инактивации формалином.
2
BY 7351 C1 2005.09.30
Таким образом, задачей настоящего изобретения является композиция пероральной
вакцины против диареи у людей, вызываемой энтеротоксигенной E. coli, содержащая, по
крайней мере, 100 µг каждого, по крайней мере, из трех различных видов антигенов колониеобразующего фактора (СFАs), выбираемых из группы, содержащей CFA I, CFA II
(CS1, CS2 и CS3) и CFA IV (CS4, CS5 и CS6), на основе инактивированных бактерий E.
coli, у которых отсутствует ген, кодирующий термолабильный энтеротоксин (LT), эффективное количество В-субъединиц холерного токсина (CTB) и фармацевтически приемлемый
носитель, при этом она очищена от видимого присутствия термостабильного энтеротоксина (ST), при этом количество CTB составляет, по крайней мере, 0,5 мг, а носителем является физиологически приемлемый буферный раствор, а также количество различных
видов CFAs составляет для каждого вида CFA 100-300 µг, a CTB составляет от 0,5 до 2,0 мг,
при этом пероральная вакцина содержит 200 µг CFA1, 200 µг CS1, 150 µг CS2, 200 µг CS4,
150 µг CS5 и 1,0 мг CTB, а физиологически приемлемым буферным раствором является
солевой раствор фосфатного буфера.
Одна доза вакцинной композиции будет содержать приблизительно 1011 бактерий.
Вакцинную композицию назначают человеку в форме питья в стакане воды, содержащей карбонатный буфер, такой как бикарбонат натрия.
Количественное определение различных антигенов колониеобразующего фактора.
Антигены фимбрий E. coli выявляют методом ингибиторного иммуноферментного
анализа (ELISA), в основном, так, как описано Lopez-Vidal Y. Et al. Клиническая микробиология. - Том 26, 1988. - С. 1967-1972. Кратко, анализируемую бактериальную пробу
инкубируют вместе с фиксированным количеством моноклональных антител, направленных против CFA. После инкубации смесь переносят на пластинку, предварительно покрытую CFA, на которой остаточные моноклональные антитела могут связываться с CFA.
Связанные антитела наблюдают визуально с добавлением антимышиного иммуноглобулина, конъюгированного с пероксидазой хрена. В качестве питательной среды используют
о-фенилендиаминдигидрохлорид в цитратном буфере. Оптическую плотность измеряют
при 450 нм на спектрофотометре, подсоединенном к компьютеру с предварительной обработкой данных. Наблюдаемая оптическая плотность обратно пропорциональна концентрации антитела в пробе.
Состав вакцинной композиции.
Серию пероральной ЕТЕС-вакцины получали из моновалентных объемов инактивированных формалином штаммов 101 CFA/I SBL, 106 CS1 SBL, 107 CS2 SBL, 104 CS4 SBL и
105 CS5 SBL соответственно и моновалентного объема очищенного гСГВ.
Композиция
Наименование ингредиентов
Единица
Функция
Активные вещества:
1. Моновалентный объем: E. coli, CFА/I SBL-101,
2,0×102 µг
инактивированная формалином
фимбрий
2. Моновалентный объем: E. coli, CS1 SBL-106,
2,0×102 µг
инактивированная формалином
фимбрий
3. Моновалентный объем: E. coli, CS2 SBL-107,
1,5×102 µг Для усиления иммунинактивированная формалином
фимбрий ного ответа против
бактерий ETEC
2
4. Моновалентный объем: E. coli, CS4 SBL-104,
2,0×10 µг
инактивированная формалином
фимбрий
5. Моновалентный объем: E. coli, CS5 SBL-105,
1,5×102 µг
инактивированная формалином
фимбрий
6. Моновалентный объем: rСТВ, очищенный
1,0 мг
Транспорт:
q.s. ad 6,0 мл Буфер
7. PBS(WHO) буфер, рН 7,2-7,4
3
BY 7351 C1 2005.09.30
Штаммы SBL-104 и SBL-105 также продуцировали CS6, но его количество не установлено. Штамм SBL-107 также продуцировал CS3, но его количество не установлено.
Опытное исследование для оценки эффективности и реактогенности пероральной цельноклеточной ЕТЕС-вакцины с инактивированной В-субъединицей против диареи у путешественников согласно изобретению.
Проводили двукратную иммунизацию в шифрованном исследовании с применением
препарата плацебо в качестве контроля. Лиц для обследования отбирали методом случайной
выборки. Были сформированы три группы путешественников из Австрии. Кроме ЕТЕСвакцины, в исследования была также включена цельноклеточная холерная вакцина с Всубъединицей, которая, как показали исследования в Бангладеш (Clemens J. et al. J Infect
Dis, 1988, 158:372-377) и в Марокко с финскими путешественниками (Peltola H. et al. Lancet,
1991, 338:1285-89), обеспечивала значительную защиту против LT-диареи, вызываемой E. coli.
В состав указанных групп вошли 250 добровольцев, взрослых и детей, направлявшихся
в путешествие по тропическим и субтропическим регионам (44 страны в Африке, Азии и
Латинской Америке) с предполагаемым сроком пребывания от 7 до 23 дней. Двенадцать
человек из них были отстранены от участия в исследовании вследствие нарушения протокола. Таким образом, численность путешественников, намеревавшихся пройти курс лечения,
составила 238 человек, а численность следовавших протоколу, т.е. полностью выполнивших все требования, составила 187 человек. Были введены две последовательных дозы
вакцины или плацебо с интервалом от 7 до 21 дня, однако не ранее, чем за 7 дней до, и не
позднее, чем за 30 дней после отъезда. Поствакцинационные реакции и осложнения отмечены после введения обеих доз. Все добровольцы, принимавшие участие в исследовании,
вели ежедневный дневник с записью случаев заболевания диареей во время пребывания за
границей и были оснащены средствами для транспортировки забираемых проб стула в
случае диареи (пробирки Portagerm и Сагу Blair).
Путешественники получили инструкции сдать их дневники и пробирки с пробами сразу
же по возвращении. Пробы крови для определения иммуногенности брали у 73 добровольцев до и после введения первой и второй дозы вакцины или плацебо. Пробу после
первой дозы брали сразу же перед введением второй дозы, а пробу после второй дозы
брали после возвращения.
Составы, введенные путешественникам трех групп, отобранных методом случайной
выборки, были следующими: ЕТЕС-вакцина, содержащая 1 мг рекомбинантной В-субъединицы холерного токсина плюс 1011 инактивированных формалином бактерий ETEC из пяти штаммов ETEC, экспрессирующих наиболее типовые антигены колониеобразующего
фактора (CFAs), такие как CFA I, CFA II (CS1, CS2 и CS3) и CFA IV (CS4, CS5 и CS6);
цельноклеточная холерная вакцина с В-субъединицей (зарегистрирована в Швеции с 1992 г.),
содержащая 1 мг рекомбинантной В-субъединицы холерного токсина и 10 инактивированных
цельных клеток (Инаба, Огава, классических и Эль-Тор); препарат плацебо, содержащий 1011
инактивированного E. coli K12. Составы суспендировали в 4 мл буфера. Каждую дозу
вакцины или плацебо вводили в форме питья в 150 см3 раствора бикарбоната натрия. Выделение и характеристику бактерий ETEC и анти-СТВ IgA ELISA осуществляли, как описано (Jetborn M. et al. ibid).
250 добровольцам вводили одну дозу вакцины или плацебо, из них 246 добровольцам
вводили вторую дозу. До начала исследования протокол его проведения был одобрен местной Комиссией по этике. До случайной выборки было получено письменное согласие
добровольцев.
Результаты реактогенности следующие. В целом у 43 добровольцев (17 %) отмечены
слабые или средние желудочно-кишечные или общие реакции после первой дозы: 13
(16 %) в группе, получавшей плацебо, 13 (16 %) в группе, получавшей холерную вакцину,
и 17 (20 %) в группе, получавшей ЕТЕС-вакцину. После второй дозы реакции отмечены у
20 (8 %) добровольцев: 6 (7 %) в группе, получавшей плацебо, 7 (9 %) в группе, получавшей
4
BY 7351 C1 2005.09.30
холерную вакцину, и 7 (8 %) в группе, получавшей ЕТЕС-вакцину. Частота реакций в исследуемых группах статистически не различалась.
При оценке эффективности вакцин проявление диареи, вызываемой ETEC, определяли
по жидкому стулу в трех и более случаях и по обнаружению ETEC (без других патогенов)
в пробах стула до вакцинации. У добровольцев, следовавших протоколу, ETEC обнаружены в 5 случаях (8 %) в группе, принимавшей плацебо, в 6 случаях (10 %) в группе, принимавшей холерную вакцину, и в 1 случае (2 %) в группе, принимавшей ЕТЕС-вакцину.
Эффективность вакцины, что касается ЕТЕС-вакцины по отношению к препарату плацебо,
составила 79 % (р = 0,119), а по отношению к холерной вакцине - 84 % (р = 0,0496). Сравнение интенсивности случаев диареи, вызываемых ETEC, осуществляли пробой Фишера.
Все изоляты ETEC у добровольцев, следовавших протоколу, экспрессировали колониеобразующие факторы, включенные в вакцину.
Холерная вакцина не давала достоверной защиты против ETEC по сравнению с группой, получавшей препарат плацебо, но следует отметить, что в группе, принимавшей холерную вакцину, только два случая ETEC были вызваны бактериями, продуцирующими
только термолабильный энтеротоксин (LT), против которого холерная вакцина может
теоретически действовать (через свою В-субъединицу).
Таким образом, вследствие того, что в этой группе присутствовали исключительно LTотрицательные штаммы, холерная вакцина предположительно не дает никакого эффекта.
Несмотря на эти результаты, следует иметь в виду, что описанная обработка проб стула
может быть источником ошибки. При использовании средств транспортировки существует риск утраты чувствительных патогенов, в то время как менее чувствительные, такие как
бактерии E. coli, выживают, в результате чего наблюдаются недостоверные положительные случаи ETEC-диареи (см. определение ЕТЕС-диареи). Поэтому число случаев ЕТЕСдиареи, возможно, преувеличено. Маловероятно, однако, чтобы возможно недостоверные
положительные случаи были неравномерно распределены по исследуемым группам.
Что касается иммуногенности, в группе, получавшей ETEC-вакцину, методом антиСТВ IgA ELISA показан значительный рост антител к В-субъединице холерного токсина
(CTB) (геометрически средние титры до вакцинации против после вакцинации: 7,8 против
58,7 после первой и 62,6 после второй дозы; сероконверсия после второй дозы: 91 %), в
группе, получавшей холерную вакцину (7,6 против 54,6 после первой и 60,1 после второй
дозы; сероконверсия 100 %). В группе, получавшей плацебо, значительного роста в антиСТВ ответе не отмечено (7,9 против 8,3 после первой и 11,8 после второй дозы; сероконверсия 29 %).
Таким образом, хотя СТВ-холерная цельноклеточная вакцина индуцировала очень хороший ответ к В-субъединице, значительного влияния на ЕТЕС-диарею эта вакцина не
оказала. Это могло быть преимущественно вызвано тем фактом, что большинство штаммов ETEC, выделенных у добровольцев, продуцировали только ST (9 из 12) и поэтому не
могли ингибироваться холерной вакциной. Очевидно анти-CFA антитела очень важны для
защиты против, в частности, диареи, вызываемой ST-только ETEC.
Данные результаты являются самыми первыми в пользу рабочей гипотезы, что антиCFA/CS иммунитет, индуцируемый пероральной ЕТЕС-вакциной, способен обеспечить
защиту против диареи, вызываемой ETEC, продуцирующей только ST.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
98 Кб
Теги
патент, by7351
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа