close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY7537

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
BY (11) 7537
(13) C1
(19)
(46) 2005.12.30
(12)
7
(51) C 12N 15/63
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54) ЧЕЛНОЧНЫЙ ВЕКТОР ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНОГО КЛОНИРОВАНИЯ
В БАКТЕРИЯХ BACILLUS SUBTILIS И ESCHERICHIA COLI
(ВАРИАНТЫ) И СПОСОБ ЕГО КОНСТРУИРОВАНИЯ
(21) Номер заявки: a 20030886
(22) 2003.09.19
(43) 2004.03.30
(71) Заявитель: Белорусский государственный университет (BY)
(72) Авторы: Лагодич Алексей Викторович; Титок Марина Алексеевна (BY)
(73) Патентообладатель: Белорусский государственный университет (BY)
(56) JANNIERE L., et. al. Gene, 1990, v. 87,
№ 1, p. 53-61.
DE ROSSI E, et. al., Res. Microbiology,
1994, v. 145, № 8, p. 579-583.
JP 63198986 A, 1988.
JP 60027388 A, 1985.
JP 2000197491 A, 2000.
BY 7537 C1 2005.12.30
(57)
1. Челночный вектор для молекулярного клонирования в бактериях Bacillus subtilis
(5-6 копий) и Escherichia coli (20-30 копий), размером 5,6 kb, состоящий из колийного
Фиг. 1
Фиг. 2
BY 7537 C1 2005.12.30
репликона плазмиды pMTL21C размером 3,5 kb, несущего селектируемые маркеры устойчивости к ампициллину и хлорамфениколу, содержащего единичные сайты узнавания для
рестрикционных эндонуклеаз: SacI, Ecl 136, BanII, Kpn I, Asp 718, Xma I, Sma I, Bam HI,
XbaI, Sal I, HincII, AccI, AatII, MluI, BglII, Xho I, PstI, Sse 8387, SphI, HindIII, локализованные непосредственно перед lacZ геном, позволяющие осуществлять клонирование чужеродных молекул ДНК и вести прямую селекцию вставок в клетках Е. coli на селективной
среде, содержащей IPTG и X-Gal, и репликона криптической резидентной плазмиды
pBs72 природного штамма В. subtilis размером 2,1 kb, обеспечивающим емкость вектора
0,1-10 kb и репликацию по механизму тета-типа в бактериях В. subtilis, клонированного в
незначимый участок последовательности плазмиды pMTL21C.
2. Челночный вектор для молекулярного клонирования в бактериях Bacillus subtilis (56 копий) и Escherichia coli (20-30 копий), размером 5,6 kb, состоящий из колийного репликона плазмиды pMTL21C размером 3,5 kb, несущего селектируемые маркеры устойчивости к ампициллину и хлорамфениколу, содержащего единичные сайты узнавания для
рестрикционных эндонуклеаз: SacI, Ecl 136, BanII, Kpn I, Asp 718, Xma I, Sma I, Bam HI,
XbaI, Sal I, HincII, AccI, AatII, MluI, BglII, Xho I, Sse 8387, SphI, HindIII, локализованные
непосредственно перед lacZ геном, позволяющие осуществлять клонирование чужеродных молекул ДНК и вести прямую селекцию вставок в клетках Е. coli на селективной среде, содержащей IPTG и X-Gal, и репликона критической резидентной плазмиды pBs72
природного штамма В. subtilis размером 2,1 kb, обеспечивающим емкость вектора 0,1-10
kb и репликацию по механизму тета-типа в бактериях В. subtilis, клонированного обратно
ориентированным в незначимом участке последовательности плазмиды pMTL21C.
3. Способ конструирования вектора по пп. 1 и 2, заключающийся в том, что ДНК
плазмиды pMTL21C гидролизуют рестриктазой AflII, обрабатывают фрагментом Кленова
и соединяют ДНК-лигазой с фрагментом rep-области плазмиды pBs72, полученным в результате реакции амплификации, легированной смесью трансформируют клетки В. subtilis
168, и на среде с хлорамфениколом среди трансформантов отбирают варианты трансформантов, характеризующиеся структурной и сегрегационной стабильностью векторных молекул.
Предлагаемое техническое решение относится к химии, в частности к генной инженерии, и может быть использовано в биотехнологии для клонирования чужеродных молекул
ДНК в системе грамположительных-грамотрицательных бактерий В. subtilis - E. coli.
В качестве векторов для молекулярного клонирования в бактериях В. subtilis широко
известны плазмиды, реплицирующиеся по механизму разматывающегося рулона. На основе этих внехромосомных элементов создана серия моно- и бирепликонных векторов
общего и специального назначения [1, 2]. Недостатком указанных систем является их
структурная и сегрегационная нестабильность [3], что ограничивает их использование при
клонировании чужеродных фрагментов ДНК размером более 1,7 kb.
В клетках В. subtilis не было выявлено собственных плазмид тета-типа, пригодных для
создания векторных молекул, поэтому прототипом к предлагаемому техническому решению является создание и использование векторов на основе плазмиды тета-типа pAMβ1,
выделенной из бактерий Streptococcus faecalis, способных стабильно наследоваться в
клетках В. subtilis со вставками, превышающими размер в 1,7 kb [1]. Векторы, созданные
на основе плазмиды pAMβ1, представляют собой либо дериват исходной плазмиды, как в
случае pHV1301, либо конструкции, содержащие область репликации плазмиды рАМβ1,
обеспечивающую наследование в клетках В. subtilis, ген устойчивости к хлорамфениколу
плазмиды рС194 и репликон плазмиды pBR322, имеющий следующие сайты, пригодные
для молекулярного клонирования: AatII, AvaI, BamHI, EcoRI, EcoRV, NruI, PslI, SaII, SphI
(показано для вектора pHV1432). Способ конструирования вектора pHV1432 заключается
2
BY 7537 C1 2005.12.30
в клонировании по HindIII-сайту плазмиды pHV60, несущей ген устойчивости к хлорамфениколу плазмиды рС194, области репликации плазмиды рАМβ1, ограниченной сайтами
узнавания HindIII-рестриктазой, с последующей делецией фрагмента, ограниченного сайтами узнавания EcoRI рестриктазой [1].
Недостатками этой векторной системы являются: ограниченное число сайтов для клонирования, отсутствие системы, позволяющей осуществлять прямую селекцию клонированного фрагмента, а также отсутствие ColE репликона, что не позволяет осуществлять
промежуточные этапы клонирования в бактериях E. coli, необходимых на некоторых этапах создания гибридных молекул.
Задачей изобретения является создание челночного вектора для молекулярного клонирования в бактериях В. subtilis и E. coli, позволяющего клонировать в указанных организмах
фрагменты чужеродной ДНК, размером более 1,7 kb, а также содержащего систему, позволяющую вести прямую селекцию вставок чужеродных молекул ДНК в клетках E. coli.
Технический результат состоит в конструировании челночного вектора на основе repобласти новой плазмиды тета-типа pBs72 бактерий В. subtilis.
Указанная цель достигается тем, что с помощью генно-инженерных методов конструируют вектор для молекулярного клонирования в клетках бактерий В. subtilis и E. coli,
способный стабильно наследоваться в указанных хозяевах. Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается тем, что в незначимую область известного вектора, содержащего ColE-репликон, два маркера антибиотикорезистентности:
обеспечивающих устойчивость к ампициллину в клетках E. coli, и устойчивость к хлорамфениколу - в бактериях В. subtilis, а также полилинкер, содержащий единичные сайты,
по которым можно осуществлять клонирование чужеродной ДНК, была осуществлена
вставка области плазмиды тета-типа pBs72, выделенной из бактерий В. subtilis, обеспечивающая стабильное поддержание векторной молекулы в системе грамположительных бактерий. Сущность изобретения поясняется фиг. 1 и 2.
На фиг. 1 представлена схема молекулярно-генетической организации предлагаемого
вектора для молекулярного клонирования вариант 1.
На фиг. 2 представлена схема молекулярно-генетической организации предлагаемого
вектора для молекулярного клонирования вариант 2.
Предлагаемый вектор включает в себя репликон плазмиды pBs72 (RepA и oriV), позволяющий ему наследоваться в бактериях В. subtilis, ColE-репликон (oriEc), позволяющий ему наследоваться в бактериях E. coli, два маркера антибиотикорезистентности, один
их которых экспрессируется в клетках E. coli (устойчивость к ампициллину - Amp), а второй - в бактериях В. subtilis (устойчивость к хлорамфениколу - Cm), содержит расположенный непосредственно перед lacZ геном полилинкер (MCS) со следующими сайтами
для клонирования фрагментов ДНК: SacI, Ecl136, BanII, KpnI, Asp718, XmaI, SmaI,
BamHI, XbaI, SalI, HincII, AccI, AatII, MluI, BglII, XhoI, PstI, Sse8387, SphI, HindIII, что позволяет осуществлять клонирование чужеродных молекул ДНК размером более 5 kb, вызывая при этом инактивацию lacZ гена, которая обнаруживается в клетках E. coli по
возникновению неокрашенных колоний на селективной среде, содержащей IPTG и X-Gal.
Пример 1.
В качестве базовой конструкции, обеспечивающей поддержание вектора в системе E.
coli используют многокопийную плазмиду pMTL21C [4], несущую ColE-репликон, гены
антибиотикорезистентности, один из которых экспрессируется в бактериях E. coli (ампициллин), а второй - в бактериях В. subtilis - хлорамфеникол. Плазмида pMTL21C, кроме
вышеперечисленных детерминант, содержит полилинкер, расположенный непосредственно перед lacZ геном, что позволяет осуществлять клонирование фрагментов ДНК по ряду
сайтов, вызывая при этом инактивацию lacZ гена, что в свою очередь может обнаруживаться по возникновению неокрашенных колоний на селективной среде, содержащей
IPTG и X-Gal.
3
BY 7537 C1 2005.12.30
В качестве rep-области, обеспечивающей наследование в бактериях В. subtilis, используют фрагмент плазмиды pBs72 размером 2077 bp, содержащий rep-ген и ориджин вегетативной репликации [5].
В полимеразной цепной реакции с использованием Kit "Takara" (Япония) при следующих температурных режимах (94 °С - 5 мин (один цикл); 94 °С - 10 сек, 50 °С - 15 сек,
65 °С - 4 мин (30 циклов); 4 °С - ∞) получают фрагмент желаемого размера (2077 пар нуклеотидов), который легируют с плазмидой pMTL21C, предварительно линиализированной
рестриктазой AflII с последующей обработкой фрагментом Кленова. Легированную смесь
используют для трансформации бактерий В. subtilis 168 (trpC2) [6], отбор плазмидсодержащих клонов осуществляют прямой селекцией на среде, содержащей 5 µg/ml хлорамфеникола. Отобранные клоны проверяют на способность стабильно наследовать маркер
антибиотикорезистентности. Маркер стабильно наследуется в течение 20 генераций. Из
отобранных клонов методом щелочного лизиса [7] выделяют плазмидную ДНК, которой
трансформируют бактерии E.coli xl-1Blue (F' proAB lac lacZ ∆M15 Tn10(TcR), recA1,
endA1, gurA96(NalR), thil, hsd, R17 (r¯m+), supE44, relA1lac) по стандартной методике [8],
из которых также выделяют плазмидную ДНК и путем рестрикционного анализа проверяют их структурную организацию. По результатам последнего отбирают конструкции,
размер которых соответствует ожидаемому. Отобранные таким образом конструкции, отличающиеся ориентацией rep-области плазмиды pBs72, называют вариант 1 и вариант 2,
соответственно.
Размер векторов составляет 5,6 kb. B состав полученных конструкций входят: репликон плазмиды pMTL21C, включающий полилинкер размером 78 bр, несущий 16 (вариант
1) и 15 (вариант 2) единичных сайтов, пригодных для молекулярного клонирования и расположенный перед lacZ геном, что позволяет вести селекцию вставки на среде, содержащей IPTG и X-Gal, маркеры устойчивости к ампициллину и хлорамфениколу,
выражающиеся в бактериях E. coli и В. subtilis, соответственно; и rep-область плазмиды
pBs72, обеспечивающую наследование репликона в клетках В. subtilis. Полученные вектора пригодны для молекулярного клонирования в клетках E. coli (20-30 копий) и В. subtilis
(5-6 копий). Емкость вектора 0,1-10,0 kb. Спектр хозяев: E. coli и В. subtilis.
Пример 2.
Проверку полученных векторов на сегрегационную и структурную стабильность осуществляют путем изучения их наследования в гомогенных и гетерогенных системах [3].
Рестрикционный анализ плазмидной ДНК, выделяемой из клеток E. coli на каждом из этапов, свидетельствует о высоких показателях структурной и сегрегационной стабильности
векторов и соответствует 95-100 %. Изучение стабильности наследования векторов в
клетках В. subtilis свидетельствует, что после 20 генераций стабильность наследования
составляет 98-100 %, а после 60 - 95 %.
Пример 3.
При введении векторов в клетки E. coli и В. subtilis путем трансформации частота возникновения трансформантов составляла 106 и 104 клеток на 1 µg ДНК для E. coli и В. subtilis, соответственно.
Пример 4.
Клонирование фрагмента хромосомальной ДНК штамма Pseudomonas mendocina
BKMB 1299 в клетках E. coli и В. subtilis. Хромосомальную ДНК штамма Pseudomonas
mendocina BKMB 1299, обработанную мелкощепящей рестриктазой Sau3A, легируют с
вектором (вариант 1 и 2), предварительно рестрицированным по сайту BamHI. Легированной смесью трансформируют клетки E. coli. Селекцию ведут на среде, содержащей X-Gal,
IPTG, ампициллин в конечной концентрации 50 µg/ml. Выделенные векторы несут вставки
4
BY 7537 C1 2005.12.30
размером от 1,0 до 2,4 kb, и сохраняют сегрегационную и структурную стабильность при
наследовании в клетках E. coli и В. subtilis.
Пример 5.
Клонирование плазмиды pACYC184 в составе векторов 1 и 2 в клетках E. coli и В. subtilis. Плазмиду pACYC184 и ДНК вектора 1 и 2 расщепляют рестриктазой BamHI и легируют ДНК-лигазой. Легированной смесью трансформируют клетки E. coli. Селекцию
ведут на среде, содержащей X-Gal, IPTG, ампициллин в конечной концентрации 50 µg/ml.
Выделенные векторы несут вставку размером 4,24 kb и сохраняют сегрегационную и
структурную стабильность при наследовании в клетках E. coli и В. subtilis.
Пример 6.
Клонирование фрагмента хромосомальной ДНК штамма Pseudomonas mendocina
BKMB 1299 в клетках E. coli и В. subtilis. Хромосомальную ДНК штамма Pseudomonas
mendocina BKMB 1299, обработанную рестриктазой ВаmHI, легируют с вектором (вариант 1 и 2), предварительно порезанными по сайту ВаmHI. С использованием методов,
описанных в примере 4, получают векторы, несущие вставки размером от 4,5 до 10,0 kb,
которые обладают сегрегационной и структурной стабильность при наследовании в клетках E. coli и В. subtilis.
Таким образом, получен челночный вектор для молекулярного клонирования в бактериях В. subtilis и E. coli, позволяющий клонировать в указанных организмах фрагменты
чужеродной ДНК размером до 10 kb и вести прямую селекцию вставок чужеродных молекул ДНК в клетках E. coli.
Источники информации:
1. Janniere L., Bruand C., Ehrlich S.D. Structurally stable Basillus subtilis cloning vectors //
Gene. - 1990. - Vol. 87. - No. 1. - P. 53-61.
2. Renault P., Corthier G., Goupil N., Delorme Chr., Ehrlich S.D. Plasmids vector for Grampositive bacteria swithing from high to low copy number // Gene. - 1996. - Vol. 183. - No. 1.
- P. 175-182.
3. Janniere L., Gruss A., Ehrlich S.D. Plasmids // In: Basillus subtilis and other Grampositeve Bacteria: Biochemistry, Physiology and Molecular Genetics / A.L. Sonenshein, J.A.
Hoch, R. Losick, Washington D.C. (eds.), American Society for Microbiology. - 1993. - P. 625644.
4. Chambers S.P., Prior S.E., Barstow D.A., Minton N.P. The pMTL cloning vectors, I. Improved polylinker regions to facilitate the generation of sonicated DNA for nucleotide sequencing // Gene. - 1988. - Vol. 68. - P. 139-149.
5. Титок M.А., Лагодич А.В. Молекулярно-генетический анализ rep-области плазмиды
тета-типа pBs72 бактерий В. subtilis // Доклады HAH Беларуси. - 2003. - Т.47, в печати.
6. Anagnostopoulos C., Spizizen J. Requirements for transformation in B. subtilis // J. Bacteriol. - 1961. - Vol. 81. - No 2. - P. 741-746.
7. Birnboim H.C., Doly J.A. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant
plasmid DNA // Nucl. Acids Res. - 1979. - Vol. 7. - No. 3. - P. 1513-1523.
8. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. - M.: Мир, 1984. - 480 с.
5
BY 7537 C1 2005.12.30
Сиквенс клонированного участка rep-области плазмиды pBs72
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
802 Кб
Теги
by7537, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа