close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY7652

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2005.12.30
(12)
7
(51) C 12N 15/54, 9/10,
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
BY (11) 7652
(13) C1
(19)
C 07K 14/28, 14/435
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ШТАММА THYA¯ VIBRIO CHOLERAE
(21) Номер заявки: a 20001034
(22) 1999.05.21
(31) 9801852-6 (32) 1998.05.26 (33) SE
(85) 2000.11.22
(86) PCT/ЕР99/03509, 1999.05.21
(87) WO 99/61634, 1999.12.02
(43) 2001.06.30
(71) Заявитель: Актив Биотех АБ (SE)
(72) Авторы: КАРЛИН Нильс; ЛАБЕНС
Михаэль Р. (SE)
(73) Патентообладатель: Актив Биотех АБ
(SE)
(56) RU 2130970 C1, 1999.
SU 1523055 A3, 1989.
МАНИАТИС Т. и др. Молекулярное
клонирование. - М.: Мир, 1984. - С. 107117, 239-241, 359-361, 380-383.
BY 7652 C1 2005.12.30
(57)
1. Способ получения штамма thyA¯ Vibrio cholerae, включающий этап сайт-направленного мутагенеза в хромосоме Vibrio cholerae с целью делеции локуса гена thyA, имеющего преимущественно нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1; или инсерции
генных нуклеотидов в локус гена thyA; или инсерции генных нуклеотидов в локус гена
thyA и делеции части генных нуклеотидов и части локуса гена thyA.
2. Нуклеотидная последовательность гена thyA Vibrio cholerae, представляющая последовательность SEQ ID NO: 1.
3. Нуклеотидная последовательность 5' - фланкирующей области структурного гена
thyA Vibrio cholerae, представляющая последовательность SEQ ID NO: 2.
4. Нуклеотидная последовательность 3' - фланкирующей области структурного гена
thyA Vibrio cholerae, представляющая последовательность SEQ ID NO: 3.
Изобретение относится к способу получения штаммов thyA¯ Vibrio cholerae. B частности, изобретение касается штамма Vibrio cholerae, из хромосомы которого удален ген
thyA, т.е. штамма ∆thyA, в котором отсутствует функциональность гена thyA. Данный
штамм может содержать один или более эписомных автономно реплицирующихся элементов ДНК, таких как плазмиды, включающих факультативно чужеродный, например,
E.coli, функциональный ген thyA, обеспечивающий рост штамма в отсутствие тимина в
питательной среде, а также факультативно - структурный ген, кодирующий гомологичный
или гетерологичный белок. Кроме того, задачей изобретения являются нуклеотидные последовательности thyA.
Предшествующий уровень техники
Экспрессия рекомбинантных генов в бактериальных клетках-хозяевах чаще всего достигается путем интродукции эписомных самореплицирующихся элементов (например,
плазмид), кодирующих структурный ген интересующего белка под контролем подходящего промотора, в хозяйские бактерии. Такие плазмиды обычно закрепляются путем введения селективных маркерных генов, которые кодируют белки, реализующие устойчивость
BY 7652 C1 2005.12.30
к специфичным антибиотикам (таким как ампициллин, хлорамфеникол, канамицин, тетрациклин и т.п.). Таким образом, их удерживают в хозяине путем добавления подходящего антибиотика в культуральную среду.
Для стабильного закрепления плазмид в хозяйских штаммах часто требуется добавлять антибиотики определенной селекции, в отсутствие которых плазмиды могут расщепляться, образуя значительное число клеток такой культуры, в которой плазмиды отсутствуют, и которые, следовательно, не могут экспрессировать желаемый продукт.
Однако применение антибиотиков для продуцирования рекомбинантных белков нежелательно в силу ряда причин. Помимо очевидного роста затрат, связанных с необходимостью добавлять антибиотики в питательную среду, их применение считается проблематичным при продуцировании любого рекомбинантного белка, предназначаемого для
потребления человеком или животными. Это вызвано прежде всего тремя причинами. Вопервых, остаточные антибиотики могут вызывать у чувствительных людей серьезные аллергические реакции. Во-вторых, у тех, кто потребляет продукт, возможен отбор бактерий, устойчивых к антибиотикам, в естественной среде, и, наконец, ДНК, кодирующая устойчивость к антибиотикам, может также переноситься на бактерии, чувствительные к
антибиотикам, тех людей, которые потребляют продукт, тем самым распространяя нежелательную устойчивость к антибиотикам в популяции.
Уже заявлены изобретения, направленные на решение этой проблемы. Целью одного
из таких изобретений является par-ген, эффективно убивающий все клетки, которые не
сохраняют копию плазмиды после каждого деления клетки [1].
Еще одно изобретение [2], имеющее отношение к настоящему изобретению, основано
на определении последовательности ДНК thy A в E.coli. Авторы интродуцировали ген
thyA в плазмиду, используя при этом хозяйские штаммы, являющиеся спонтанными мутантами thyA¯, которые отбирали на основании устойчивости к триметоприму. Такие мутанты хорошо не определены (несут точковые мутации и небольшие делеции). Они могут
реверсировать к дикому типу (например, thyA+) с такой высокой частотой, которая нежелательна. Это может приводить к тому, что хозяйские бактерии будут элиминировать
плазмиду и тем самым прекращать продуцирование желаемого рекомбинантного продукта, или же это продуцирование будет непостоянным и ненадежным. Кроме того, селекция
в пользу триметоприма может приводить к тому, что в результате будет возникать тиминзависимость, как следствие мутации гена дигидрофолатредуктазы (folА) и, таким образом,
не будет комплементироваться геном thyA, рожденным в плазмиде [3]. Рассмотрение этого изобретения прекращено, по крайней мере, в Европе.
Установлено, что использование V.cholerae для экспрессии рекомбинантных генов
предпочтительнее использования других широко используемых прокариотических экспрессионных систем в силу того, что специфичные рекомбинантные продукты можно
продуцировать в значительных количествах и секретировать в культуральную среду, облегчая тем самым последующую процедуру очистки. Наоборот, в случае использования E.coli
продукт часто аккумулируется в периплазматическом пространстве [4]. Одним из важных
факторов, придающим V.cholerae такое свойство, являются erp-гены в V.cholerae [5].
Тимидилатсинтаза, кодируемая геном thyA Escherichia coli и других бактерий, катализирует метилирование дезоксиуридилата (dUMP) до дезокситимидилата (dTMP) и является основным ферментом биосинтеза дезоксириботимидинтрифосфата (dTTP) с целью инкорпорации в ДНК. В отсутствие этого фермента бактерии становятся зависимыми от
внешнего источника тимина, который инкорпорируется в dTTP через утилизационный
путь, кодируемый deo-генами [6].
Спонтанные мутанты - thyA¯ - могут быть легко изолированы на основании устойчивости к триметоприму. Этот антибиотик ингибирует регенерацию тетрагидрофолата из
дигидрофолата, продуцируемого в результате синтеза dTMP, катализируемого тимидилатсинтазой. Таким образом, если клетки - это thyA¯, то они становятся тимин-зависимыми,
но более не исчерпывают пул тетрагидрофолата в присутствии триметоприма.
2
BY 7652 C1 2005.12.30
Раскрытие заявленного изобретения
Данное изобретение, в его различных аспектах, основывается на новой нуклеотидной
последовательности гена thyA в Vibrio cholerae. Ген thyA может с успехом применяться,
например, для закрепления плазмид, участвующих в сверхпродукции рекомбинантных
белков в V.cholerae, а также в последовательности для селективной и сайт-специфической
инсерции чужеродных генов в хромосому V.cholerae.
Один из аспектов изобретения относится к способу получения штамма thyA¯ Vibrio
cholerae, который включает этап сайт-направленного мутагенеза в хромосоме Vibrio
cholerae с целью делеции локуса гена thyA, имеющего преимущественно нуклеотидную
последовательность SEQ ID NO: I; или инсерции генных нуклеотидов в локус гена thyA;
или инсерции генных нуклеотидов в локус гена thyA и делеции части генных нуклеотидов
и части локуса гена thyA.
Выражение "имеющий преимущественно нуклеотидную последовательность", употребляемое в данном описании и в формуле изобретения, означает нуклеотидные последовательности, содержащие естественные или искусственные удлинения, удаления, делеции
или добавления нуклеотидов, которые не препятствуют естественной функции интересующей нуклеотидной последовательности.
Другой аспект изобретения относится к нуклетидной последовательности гена thyA
Vibrio cholerae, представляющей последовательность SEQ ID NO: I, представленную на
фиг. 1.
Третий аспект изобретения относится к нуклеотидной последовательности 5'-фланкирующей области структурного гена thyA Vibrio cholerae, представляющей последовательность SEQ ID NO:2, представленную на фиг. 2.
Четвертый аспект изобретения относится к нуклеотидной последовательности 3'фланкирующей области структурного гена thyA Vibrio cholerae, представляющей последовательность SEQ ID NO:3, представленную на фиг. 3.
Нуклеотидная последовательность SEQ ID NO:1 пригодна для селективной или сайтспецифической инсерции чужеродных генов в хромосому V. cholerae, а также для сайтнаправленного мутагенеза с целью получения штаммов thy A¯ Vibrio cholerae.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлена нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: I thyA Vibrio
cholerae.
На фиг. 2 представлена нуклеотидная последовательность SEQ ID NO:2 5'-фланкирующей области структурного гена thyA Vibrio cholerae.
На фиг. 3 представлена нуклеотидная последовательность SEQ ID NO:3 3'-фланкирующей области структурного гена thyA Vibrio cholerae.
На фиг. 4 показано клонирование ЕсоRI/HindIII-фратиепта, содержащего ген thyA
V.cholerae в pUC19.
На фиг. 5 показано сравнение продуктов гена thyA из E.coli [16], V.cholerae и
H.influenze [17], свидетельствующее о высоком уровне гомологии между V.cholerae и
H.influenze в отличие от E.coli.
На фиг. 6 показана инсерция генного блока KanR-устойчивости в PstI-сайт гена thyA
V.cholerae в pUC19.
На фиг. 7 показана генерация методом ПЦР фрагмента thyA-Kan с XbaI-концами.
На фиг. 8 показано лигирование фрагмента thyA-Kan с XbaI-концами к плазмиде
pNQ705.
На фиг. 9 изображена частичная делеция гена thyA и старт Kan-гена в pNEB193.
На фиг. 10 показано XbaI-расщепление для эксцизии гена ∆thyA Kan из pNEB193, лигирование к pDM4, из которой выщеплен ХbаI.
На фиг. 11 показана схема стратегии полной делеции гена thyA из V.cholerae.
3
BY 7652 C1 2005.12.30
На фиг. 12 представлена инсерция 5'-участка вверх (апстрим) от гена thyA в рМТSUICIDE; генерация рМТ с 5 прайм.
На фиг. 13 представлена инсерция 3'-участка вниз (даунстрим) от thyA в рМТ с 5
прайм; генерация рМТ ∆thyA V.cholerae.
На фиг. 14 показан экспрессионный вектор pMT-eltB(thyA), используемый для экспрессии LTB в V.cholerae JS1569 ∆thyA.
На фиг. 15 показан экспрессионный вектор pMT-GST(thyA), используемый для экспрессии GST в V.cholerae JS1569 ∆thyA.
Описание экспериментов
Применяемая стратегия
Для получения мутантов thyA V.cholerae с заданными свойствами, которые можно
было бы использовать в качестве штаммов-продуцентов рекомбинантных белков, кодируемых на плазмидах, закрепляемых thyA-комплементацией, сначала было необходимо
провести клонирование и дать определение гена дикого типа и его 5'- и 3'-фланкирующих
областей. Стратегия заключалась в первоначальном клонировании гена thyA V.cholerae на
плазмиде на основании комплементации thyA-аутотрофа в штамме E.coli K12. Были проведены рестрикционный анализ и эксперименты по субклонированию с целью локализации структурного гена на первоначально полученном крупном фрагменте ДНК. Затем
проводили секвенирование соответствующего участка, содержащего ген thyA и его 5'-и 3'фланкирующие области.
Чтобы проверить, что один из секвенированных генов действительно является геном
thyA из V.cholerae, проводили сравнение уровня гомологии с последовательностями thyA
из других организмов. Клонированный ген был также способен комплементироваться с
фенотипом thyA мутантного штамма V.cholerae, выделенного на основании устойчивости
к триметоприму. Секвенционный анализ этого мутанта показал, что он действительно имел
единственную замену основания в гене, который был определен как ген thyA, в результате
чего образовался стоп-кодон, дающий продукт нефункционального урезанного гена.
Определение последовательности thyA, а также последовательности окружающего его
участка, позволило применить подходящие суицидальные векторы для сайт-направленного
мутагенеза. Были рассмотрены стратегии, состоящие в: а) инсерционной инактивации;
б) сочетании инсерционной инактивации и генной делеции; и в) полном исключении гена.
а) Инсерционную инактивацию гена thyA проводили путем инсерции генного блока
KanR (с суицидальным вектором pNQ705 [14]).
б) В штамме, несущем генный блок KanR, проводили делецию приблизительно 400
п.о., что приводило к утрате 200 п.о из гена thyA вверх(апстрим) от инсерционного сайта и
200 п.о. из гена устойчивости к канамицину, который таким образом инактивировался. В
результате получали делеционный ген thyA, в котором была утрачена центральная часть, а
затем осуществляли инсерцию некодирующего участка ДНК. Эту конструкцию вставляли
в хромосому V.cholerae с помощью суицидального вектора pDM4 и получали штамм, который был назван JS1569∆thyA∆Kan.
в) Полное удаление гена thyA осуществляли путем лигирования областей, фланкирующих структурный ген так, чтобы при этом не разорвать другие открытые рамки считывания (разрыв lgt-гена также является летальным). ДНК, несущую делецию, клонировали в новый суицидальный вектор (рМТ-SUICIDE-l), который использовали для инсерции
последовательности в хромосому V.cholerae. Полученный в результате штамм назвали
JS1569∆thyA.
Для экспрессии рекомбинантных генов в этих штаммах ∆thyA V.cholerae конструировали два экспрессионных вектора. Каждый включал ген thyA из E.coli, ориджин репликации
универсального высококопийного вектора pUC19, tac-промотор и rho-независимый trpAтерминатор транскрипции. В один из двух векторов вставляли lacIq-ген для регуляции экспрессии из tac-промотора, который также содержал последовательность lac-оператора.
4
BY 7652 C1 2005.12.30
Оба гена клонировали в этих плазмидах и экспрессировали во вновь генерированный
штамм V.cholerae – JS1569∆thyA, в котором утрачен ген thyA. Первый ген кодировал Всубъединицу термолабильного энтеротоксина человека из E.coli (LTB) (фиг. 14), второй
был 26 кД глутатион-S-трансфераза (GST) из Schistosoma ja-ponicum (фиг. 15).
LTB имеет структуру, сходную со структурой В-субъединицы холерного токсина,
продуцируемого естественным образом штаммом-хозяином. Его секретировали в питательную среду. Другой белок имеет эукариотическое происхождение от азиатского печеночного двуустка. Как известно, 26 кД GST экспрессирует в больших количествах в E.coli
и аккумулируется в цитоплазме. Экспрессию двух рекомбинантных белков оценивали на
основании GM1-ELISA иммунодетекции с применением связанной формы ферментов
культурального супернатанта в случае LTB и на основании коммерческих материалов для
исследования в случае GST. Оба белка также анализировали методами электрофореза в
полиакриламидном геле в присутствии ДСН и Вестерн-блоттинга.
Происхождение гена thyA
Ген thyA клонировали из штамма V.cholerae JS1569. Данный штамм происходит из
штамма 569В Инаба V.cholerae классического биотипа (American Type Culture Collection,
No. 25870). Штамм имеет делецию в гене ctxA [7] и обеспечен устойчивостью к рифампицину [8].
Клонирование 1,4 кб HindIII/EcoRI-фрагмента, содержащего ген thyA V.cholerae
Хромосомную ДНК, приготовленную методом ЦТАБ [9], полностью расщепляли посредством рестриктазы HindIII.
Расщепленную ДНК лигировали в универсальную векторную плазмиду pBR322 (New
England Biolabs Inc. Beverly, MA США), которую расщепили с помощью HindIII и обработали щелочной фосфатазой.
Смесь, полученную в результате лигирования, электропорировали [10] в штамм E.coli
HB101, фенотипически представляющий собой Thy A¯ (селекцию проводили на основании устойчивости к триметоприму), культуру рассевали на пластинках агара, содержащих
модифицированную синказу (MC) [11] с добавлением 50 µг/мл ампициллина, но не содержащие тимин. Трансформанты выделяли как на основании плазмидной восприимчивости, так и на основании присутствия функционального гена thyA.
Колонии засевали штрихом отдельными колониями на пластинки агара того же типа,
затем растили в питательном бульоне MC с добавлением ампициллина. Плазмидную ДНК
готовили, используя "Wizard miniprepps" (ProMega Corp. Madison Wis.), и расщепляли с помощью HindIII. Выделяли фрагмент размером около 10-12 кб. Этот клон был назван ThyA B2.
Чтобы сократить размер фрагмента, плазмиду разрезали посредством ЕсоRI и повторно
лигировали с помощью Т4-лигазы. Лигированную ДНК снова электропорировали в штамм
E.coli, описанный выше, используя те же селективные условия для роста трансформантов.
Колонии, получаемые в результате этого эксперимента, изолировали, как описано
выше, плазмидную ДНК очищали и анализировали методом двукратного расщепления с
помощью ЕсоRI и HindIII. Оставался фрагмент ДНК размером приблизительно 1,4кб, который сохранял способность комплементировать мутацию thyA в штамме-хозяине E.coli.
Этот фрагмент клонировали в плазмиду pUC19 (New England Biolabs), которую расщепляли теми же двумя ферментами и обрабатывали щелочной фосфатазой. После электропорации трансформанты, получаемые в ходе эксперимента, выделяли и характеризовали, как
описано выше. Этот клон был назван ThyA 1:2 (фиг. 4).
Проверка содержания гена thyA в 1,4 кб HindIII/EcoRI-фрагменте.
Анализ методом Саузерн блоттинга. Чтобы убедиться в том, что клонированный
фрагмент действительно имел V.cholerae хромосомное происхождение, ДНК штамма
JS1569 полностью расщепляли с помощью HindIII и ЕсоRI и HindIII. Фрагменты ДНК разделяли по размеру методом электрофореза в агарозном геле вместе с клоном ThyA B2, полученным при расщеплении с помощью HindIII, и клоном ThyA 1:2, полученным при
расщеплении с помощью ЕсоRI и HindIII.
5
BY 7652 C1 2005.12.30
После электрофореза ДНК переносили на нейлоновую мембрану, иммобилизировали
путем УФ облучения и гибридизировали (в жестких условиях) с фрагментом 1,5 кб, удаленным из клона ThyA 1:2, меченным 32P дСТФ из набора Amershams Multiprime.
Обсуждение результатов. Как в хромосомной ДНК, расщепленной с помощью
HindIII, так и в клоне ThyA В2, расщепленном с помощью HindIII, была выделена полоса
длиной прибл. 10кб. Полоса длиной 1,4кб была выявлена и в хромосомной ДНК и клоне
ThyA 1:2 плазмидной ДНК, расщепленных с помощью ЕсоRI и HindIII (данные не приводятся). Это свидетельствовало о том, что клонированный фрагмент был получен из ДНК
V.cholerae JS1569.
Трансформация JS1569 ThyA с участием плазмиды ThyA 1:2.
Чтобы проверить, что клонированный ЕсоRI/HindIII-фрагмент размером 1,4кб мог
поддерживать рост фенотипически ThyA¯ V.cholerae, тимин-зависимый мутант JS1569
(V.cholerae JS1569 4.4) электропорировали в плазмиду ThyA 1:2. Электропорация и селективные среды были такие же, как описано выше. JS1569 4.4 не рос на МС-среде без добавления тимина.
Обсуждение результатов. Изолировали колонии JS1569 4.4, выросшие в отсутствие
тимина. Было обнаружено, что все они заякорили плазмиду ThyA 1:2, что, таким образом,
подтверждало предположение о том, что клонированный фрагмент содержал ген thyA из
V.cholerae.
Секвенирование ДНК плазмиды ThyA 1:2. Плазмидную ДНК секвенировали методом терминации дидезокси цепочки [12] с использованием набора для секвенирования
ABI PRISM™ (Perkin Elmer). Использовали как коммерческие, так и изготовленные на заказ праймеры. Определение нуклеотидных последовательностей проводили на автоматическом секвенаторе марки "ABI PRISM 373" (Perkin Aimer). Данные анализировали с применением программного обеспечения AutoAssembler (Perkin Aimer). Гомологию с обнаруженной последовательностью ДНК устанавливали с помощью программы GCG [13].
Обсуждение результатов. Самая значительная гомология была проявлена с тимидилат синтетазами из различных видов. Следует отметить, что гомология с тимидилат синтетазой E.coli оказалась незначительной (фиг. 5).
Стратегия делеции гена thyA в V.cholerae JS1569.
Для получения определенных мутантов thyA V.cholerae JS1569 применяли две разные
стратегии. Первая состояла в инактивации гена thyA путем инсерции генного блока KanR
и последующей частичной делеции гена thyA и генного блока KanR. Вторая стратегия была основана на полной делеции гена thyA из хромосомы посредством нового суицидального вектора рМТ SUICIDE-I. Данный вектор содержит 5'- и 3'-фланкирующие области
гена thyA, а также R6K-ориджин репликации и RP4 mob-гены.
Для переноса гена thyA из штамма JS1569 было решено использовать уже тиминзависимый JS1569 4.4, так как предварительные эксперименты показали, что имеются
серьезные селективные недостатки в переходе от дикого типа к тимин-зависимости даже в
присутствии значительных количеств экзогенного тимина.
Инактивация гена thyA путем инсерции генного блока KanR
Стратегия состояла в инактивации гена thyA путем инсерции гена устойчивости к канамицину в уникальный PstI-сайт гена thyA в виде генного блока KanR (Pharmacia)
(фиг. 6). Эту конструкцию амплифицировали методом ПЦР (ПЦР система марки Expand™
High Fidelity, Boehringer Mannheim) с праймерами, содержащими XbaI-концы, таким образом, чтобы ее можно было перенести в суицидальную плазмиду pNQ705 [14], несущую
уникальный XbaI-сайт и ген устойчивости к хлорамфениколу.
Для инсерционно инактивированного гена использовали следующие праймеры:
ThyA-10:5'GCT СТА GAG CCT TAG AAG GCG TGG TTC3'
соответствующий основаниям 557-575 в SEQ ID NO:2 (фиг. 2) с добавлением XbaIсайта (выделен жирным шрифтом)
6
BY 7652 C1 2005.12.30
и
ThyA-11: 5'GCT СТА GAG СТА CGG TCT TGA TTT AGG GTA T3' соответствующий
основаниям 235-257 в SEQ ID NO:2 (фиг. 3) с добавлением XbaI-сайта (выделен жирным
шрифтом) (фиг. 7 + 9).
Полученную в результате плазмиду затем переносили в E.coli S-17, который применяли в экспериментах по конъюгации.
Поскольку штамм-реципиент JS1569 4.4 устойчив к рифампицину и чувствителен к
хлорамфениколу, а штамм-донор E.coli S-17 устойчив как к хлорамфениколу, так и к канамицину, трансконъюганты отбирали путем селекции на устойчивость как к рифампицину, так и к канамицину.
Однако получаемые в результате штаммы V.cholerae будут также устойчивыми и к
хлорамфениколу, так как изначально в хромосому будет включаться полная плазмида.
Затем можно было отбирать экзоконъюганты, инкорпорировавшие инактивированный
ген, несущий генный блок KanR в хромосому, и утратившие плазмиду pNQ705, из тех, что
были чувствительными к хлорамфениколу, но оставались устойчивыми к канамицину.
Чтобы проверить инсерцию гена канамицин-устойчивости в ген thyA, полный ген thyA
амплифицировали методом ПЦР с помощью праймеров thyA-10 и thyA-11. Размер полученного в результате фрагмента сравнивали с размером нативного гена thyA. Был обнаружен
предполагаемый фрагмент гена thyA размером 2,6 кб против 1,4 кб нативного гена thyA.
Обсуждение результатов. Экзоконъюганты проявляли устойчивость к канамицину,
чувствительность к хлорамфениколу, а после амплификации посредством ПЦР обнаруживали инкорпорацию в хромосому генного блока канамицин-устойчивости. Секвенирование амплифицированного фрагмента показало, что единственный дефект в гене был
вызван инсерцией гена устойчивости к канамицину. Это свидетельствовало о том, что
процесс рекомбинации вызвавший инкорпорацию инсерционно инактивированного гена в
хромосому, также вызывал элиминацию точковой мутации, которая делала штаммреципиент (JS1569 4.4) тимин-зависимым. Рост получаемого в результате штамма наблюдался только в том случае, если в питательную среду добавляли тимин (200 µг/мл).
Частичная делеция гена thyA и генного блока KanR
Для большего обеспечения нереверсивности мутации гена thyA инсерционно инактивированный thyA субклонировали как XbaI-фрагмент в pNEB 193 (New England Biolabs).
Конструировали ПЦР-праймеры, вызывающие утрату 209 пар оснований из гена thyA и
261 пару оснований из генного блока KanR.
Ген thyA еще раз дисруптировали и таким образом инактивировали ген устойчивости
к канамицину (путем устранения старта кодирующего участка). Общим результатом этого
был штамм, несущий делегированный ген thyA, содержащий также инсерцию некодирующей ДНК.
ThyA-14:5'GGG GGC TCG AGG GGC АСА TCA CAT GAA3'
ThyA-15:5CCC CCC TCG AGC GCC AGA GTT GTT TCT GAA3'
Выделенные жирным шрифтом буквы означают XhoI-сайты расщепления (фиг. 9).
После ПЦР-амплификации получали фрагмент ДНК, содержащий полную плазмиду,
за исключением делетированного участка. Амплифицированную ДНК расщепляли посредством XhoI, самолигировали и трансформировали в E.coli HB101. Отбирали колонии на
пластинках, содержащих ампициллин. Производили отбор отдельных колоний и делали
пересев штрихом. Анализ с помощью рестриктаз XbaI, XhoI, HindIII и RsaI показал, что небольшие плазмидные препараты из отдельных колоний давали ожидаемый тип рестрикций.
Неполный ген thyA, несущий инактивированный ген устойчивости к канамицину, вырезали из вектора расщеплением с помощью XbaI, очищали и лигировали в pDM4 [15]
(фиг. 10). pDM4 - это суицидальный вектор, полученный из pNQ705, содержащей SacBRген из Bacillus subtilis и модифицированный сайт множественного клонирования.
7
BY 7652 C1 2005.12.30
После переноса pDM4 (∆thyA∆Kan)-плазмиды в штамм E.coli S-17 проводили эксперимент по трансконъгации. В этот раз штамм V.cholerae JS1569 thyAKan, полученный как
указано выше, использовали в качестве штамма-реципиента.
Спаривание оснований проводили, как описано выше, с отбором по рифампицину и
хлорамфениколу. После роста в этой среде колонии выделяли на среде, содержащей 10 %ную сахарозу в отсутствие хлорамфеникола. Сахароза индуцирует sacBR-ген, кодирующий левансахарозу, которая преобразует сахарозу в леван. Это соединение является токсичным для многих грамотрицательных организмов. Поэтому клоны, все еще несущие
суицидальную плазмиду, убивали, оставляя экзоконъюганты, утратившие плазмиду.
Обсуждение результатов. Выделяли колонию, чувствительную к хлорамфениколу и
канамицину. ПЦР-амплификация thyA-участка с помощью праймеров thyA-10 и thyA-11
подтвердила, что thyAKan-фрагмент (2,6 кб) на хромосоме был замещен ∆thyA∆Kan-фрагментом (2,1 кб).
Рост получаемого в результате штамма наблюдался только в том случае, когда в питательную среду добавляли тимин (200 µг/мл). Этот штамм был назван V.cholerae
JS1569∆thyA∆Kan.
Прямая делеция гена thyA в V.cholerae.
Данный подход заключался в применении последовательностей 5'- и 3'-фланкирующих областей гена thyA. Конструировали новый суицидальный вектор - рМТ SUICIDE-1
(фиг. 12), содержавший R6K-ориджин репликации, mob-гены из RP4, ген устойчивости к
хлорамфениколу и сайт множественного клонирования из Litmus 28 (New England
Biolabs). Эффективно конструировали модифицированный фрагмент, в котором thyAкодирующий участок заменяли сайтом множественного клонирования (полученным из
Litmus 28), оставляя только 5'- и 3'-область thyA-локуса из V.cholerae. Полученную в результате плазмиду использовали для генерации штамма V.cholerae, в котором был утрачен
полный ген thyA.
В качестве исходного материала для такой конструкции использовали плазмиду рМТ
SUICIDE-1 (M. Lebens, неопубл.).
Из 5'- и 3'-областей thyA-локуса конструировали следующие ПЦР-праймеры:
ThyA-33: 5'GGA СТА GTG GGT TTC CTT TTT GCT AT3'
соответствующий основаниям 109-126 в SEQ ID NO:2 (фиг. 2) (5'-область thyAучастка) с Spe-сайтом (выделен жирным шрифтом) и
ThyA-34: 5'CCC CGC TCG AGA CCC TAT TTT GCT GCT AC3'
соответствующий комплементарной последовательности оснований 815-832 в SEQ ID
NO:2 с присоединенным к ней XhoI -сайтом (выделен жирным шрифтом).
Эта пара праймеров дает фрагмент ПЦР длиной 743 основания, соответствующий 5'фланкирующей области гена thyA.
ThyA-31: 5'CGG GGT ACC TGG CTT GAT GGG TTT TAT3'
соответствующий основаниям 22-39 в SEQ ID NO:3 (фиг. 3) (3'-область thyA-участка)
с KpnI-сайтом (выделен жирным шрифтом) и
ThyA-32: 5'GAA GGC CTT CGC CTC TGC TTG CGA CT3'
соответствующий комплементарной последовательности оснований 731-749 в SEQ ID
NO:3 с StuI-сайтом (выделен жирным шрифтом).
Эта пара оснований дает фрагмент ПЦР длиной 746 оснований, соответствующий 3'фланкирующей области гена thyA.
В качестве матрицы для реакций ПЦР использовали препарат хромосомной ДНК из
V.cholerae JS1569 (фиг. 11).
Амплифицированную ДНК расщепляли подходящими рестриктазами и клонировали в
вектор pMT-SUICIDE 1 (фиг. 12 и 13), получая pMT∆thyA-плазмиду V.cholerae, содержа8
BY 7652 C1 2005.12.30
щую приблизительно 700 пар оснований 5'-области вверх от гена thyA и такое же количество пар оснований 3'-области вниз от гена thyA.
Эту плазмиду переносили в E.coli S-17 и использовали в экспериментах по конъюгации, как описано выше. В качестве реципиента использовали штамм V.cholerae JS1569 4.4.
Спаривание оснований проводили на ЛБ-агаре с добавлением рифампицина, хлорамфеникола и тимина. Экзоконъюганты, утратившие суицидальную плазмиду в хромосоме, выделяли на основании чувствительности к хлорамфениколу.
Обсуждение результатов. Выделяли колонию, чувствительную к хлорамфениколу и
устойчивую к рифампицину. В результате ПЦР-амплификации thyA-участка с помощью
праймеров ThyA-10 и ThyA-11 получали фрагмент 1,4 кб из нативного гена thyA и фрагмент 0,6 кб из гена ∆thyA. Это подтверждало, что структурный ген thyA на хромосоме
был делетирован. Более того, бактерии могли расти только в среде с добавлением тимина.
Этот штамм назван V.cholerae JS1569∆thyA.
Экспрессия В-субъединицы термолабильного энтеротоксина из E.coli (LTB) и 26 кД
глутатион-S-трансферазы (GST) из Schistosoma japonicum в V.cholerae JS1569 thyA.
Конструировали два экспрессионных вектора, каждый из которых содержал ген thyA
из E.coli, ориджин репликации высококопийного вектора pUC19, tac-промотор и rhoнезависимый trpA-терминатор транскрипции. В один из двух векторов вставляли lacIq-ген
для регуляции экспрессии tac-промотора, который также содержал последовательность
Lac-оператора (фиг. 14 и 15).
Экспрессия белка LTB в штамме V.cholerae JS1569 ∆thyA
Экспрессионный вектор, представленный на фиг. 14, электропорировали в V.cholerae
JS1569∆thyA. Трансформанты выделяли на МС-агаре. Растили отдельные колонии для
продуцирования плазмидных минипрепаратов, которые исследовали посредством рестрикционного анализа. Для экспрессии растили трансформант на MC-среде при 37 °С с перемешиванием культуры. На культуральной среде собирали урожай и проводили анализ
на содержание LTB с помощью прибора марки GM1-ELISA.
Обсуждение результатов. Как показал анализ с помощью GM1-ELISA, культура продуцировала приблизительно 300 µг/мл LTB. Методами электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН и Вестерн блоттинга с использованием LTB-специфичного
моноклонального антитела затем подтверждали, что секретируемый белок был LTB.
Экспрессия белка GST в штамме V.cholerae JS1569 thyA
26 кД глутатион-S-трансферазу (GST) из Schistosoma japonicum клонировали в экспрессионный вектор, показанный на фиг. 15. Этот вектор идентичен первому вектору, за
исключением последовательности lacIq-гена. LacIq-ген обеспечивает контролируемую экспрессию рекомбинантных белков. Вектор электропорировали в V.cholerae JS1569∆thyA.
Трансформанты выделяли на МС-агаре. Растили отдельные колонии для продуцирования
плазмидных минипрепаратов, которые исследовали посредством рестрикционного
анализа. Для экспрессии растили трансформант на МС-среде при 37 °С с перемешиванием
культуры и добавлением ИПТГ.
Обсуждение результатов. В цитоплазме V.cholerae бактерий был обнаружен рекомбинантный белок. Методами электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН
и Вестерн блоттинга с использованием GST-специфичного моноклонального антитела
(Pharmacia BioTech, Упсала) подтверждали, что был экспрессирован GST. Уровень экспрессии GST было труднее определить, чем уровень LTB, поскольку белок экспрессировался межклеточно, но по предположению он должен быть в тех же пределах, что и LTB.
9
BY 7652 C1 2005.12.30
Источники информации:
1. Molin, S., К.A. Gerdes. 1984. Stabilized plasmids. US Patent 4,760,022.
2. Morona, R., and S. R. Attridge. 1987. Non-antibiotic marker system. EPC-A- 0251579.
3. Green, J.M., B.P. Nichols, and R.G. Matthews. 1996. Folate biosynthesis, reduction and
polyglutamylation. In: F. C. Neidhardt, R. Curtiss III, J.L. Ingraham, E. C. C. Lin, K. B. Low, B.
Magasanik, W. S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter and H. E. Umbarger (Eds.) Escherichia
coli and Salmonella cellular and molecular biology. ASM Press Washington D.C. pp. 665-673.
4. Neill, R.J., B.E. Ivins, and R.K. Holmes. 1983. Synthesis and secretion of the plasmidcoded heat-labile enterotoxin of Escherichia coli in Vibrio cholerae. Science. 221: 289-290.
5. Sandkvist, M., M. Bagdasarian, S.P. Howard, and V.J. DiRita. 1995. Interaction between
the autokinase EpsE and EpsL in the cytoplasmic membrane is required for extracellular secretion in Vibrio cholerae. EMBO J. 14:1664-1673.
6. Neuhard, J. and R.A. Kelln. 1996. Biosynthesis and conversions of pyrimidines. In: F.C.
Neidhardt, R. Curtiss III, J.L. Ingraham, E. C. C. Lin, K. B. Low, B. Magasanik, W. S.
Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter and H.E. Umbarger (Eds.) Escherichia coli and Salmonella
cellular and molecular biology. ASM Press Washington D.C. pp. 580-599.
7. Kaper, J.B., H. Lockman, M.M. Baldini, and M.M. Levine. 1984. A recombinant live oral
cholera vaccine. Biotechnology 2:345-349.
8. Sanchez, J., and J. Holmgren. 1989. Recombinant system for overexpression of cholera
toxin B subunit in Vibrio cholerae as a basis for vaccine development. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 86:481-485.
9. Wilson, K. 1994. Preparation of genomic DNA from Bacteria. In Current protocols in Molecular Biology (F.A. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.A. Smith,
and K. Struhl, eds.) pp. 2.4.1-2.4.2 John Wiley & Sons, New York.
10. Sheen, J. 1994. High-efficency transformation by electroporation. In Current protocols in
Molecular Biology (F.A. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.A.
Smith, and K. Struhl, eds.) pp. 1.8.4-1.8.5. John Wiley & Sons, New York.
11. Lebens, M., S. Johansson., J. Osek., M. Lindblad and J. Holmgren. 1993. Large-scale
production of Vibrio cholerae toxin B subunits for use in oral vaccines. Biotechnology. 11:15741578.
12. Sanger, F., S. Nicklen, and A.R. Coulson. 1977. DNA sequencing with chain-terminating
inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467.
13. Program Manual for the Wisconsin Package. Version 8. September 1994. Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison Wisconsin.
14. Milton, D.L., A. Nordqvist, and H. Wolf-Watz. 1992. Cloning a metalloprotease gene
involved in the virulence mechanism of Vibrio anguillarum J. Bacteriol. 174:7235-7244.
15. Milton, D.L., R. O'Toole, P. Hogstedt, and H. Wolf-Watz. 1996. Flagellin A is essential
for the virulence of Vibrio anguillarum J. Bacteriol. 176:1310-1319.
16. Belfort, M., G. Maley, J. Pedersen-Lane and F. Maley. 1983. Primary tructure of the Escherichia coli thyA gene and its thymidylate synthase product. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
80:4914-4918.
17. Fleischmann, R.D., Adams, M.D., White, O., Clayton, R. A., Kirkness, E.F., Kerlavage,
A.R., Bult, C.J., Tomb, J.-F., Dougherty, B.A., Merrick, J. M., McKenney, K., Sutton, G., FitzHugh, W., Fileds, C.A., Gocayne, J.D., Scott, J.D., Shirely, R.., Liu, L.-I., Glodek, A., Kelley,
J.M. Weidman, J.F., Phillips, C.A., Spriggs, T., Hedblom, E., Cotton, M.D., Utterback, T.R.,
Hanna, M.C, Nguyen, D.T., Saudek, D.M., Brandon, R..C, Fine, L.D., Fritchman, J.L., Fuhrmann, J.L., Geoghagen N.S.M., Gnehm, C.L., McDonald, L.A., Small, K.V., Fraser, C.M.,
Smith, H.O., and J. C. Venter. 1995. Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae RD. Science 269:496-512.
10
BY 7652 C1 2005.12.30
SEQUENCE LISTING
11
BY 7652 C1 2005.12.30
12
BY 7652 C1 2005.12.30
13
BY 7652 C1 2005.12.30
14
BY 7652 C1 2005.12.30
Фиг. 1
15
BY 7652 C1 2005.12.30
Фиг. 1 (продолжение)
16
BY 7652 C1 2005.12.30
Фиг. 2
17
BY 7652 C1 2005.12.30
Фиг. 3
18
BY 7652 C1 2005.12.30
Фиг. 4
19
BY 7652 C1 2005.12.30
Фиг. 5
20
BY 7652 C1 2005.12.30
Фиг. 6
21
BY 7652 C1 2005.12.30
Фиг. 7
22
BY 7652 C1 2005.12.30
Фиг. 8
23
BY 7652 C1 2005.12.30
Фиг. 9
24
BY 7652 C1 2005.12.30
Фиг. 10
25
BY 7652 C1 2005.12.30
Фиг. 11
26
BY 7652 C1 2005.12.30
Фиг. 12
27
BY 7652 C1 2005.12.30
Фиг. 13
28
BY 7652 C1 2005.12.30
Фиг. 14
Фиг. 15
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
1 770 Кб
Теги
by7652, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа