close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY7720

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
BY (11) 7720
(13) C1
(19)
(46) 2006.02.28
(12)
7
(51) C 07K 5/04,
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
A 61P 43/00
ПЕПТИД, СПОСОБНЫЙ МОДУЛИРОВАТЬ
ПРОЛИФЕРАЦИЮ КЛЕТОК
(21) Номер заявки: a 19980006
(22) 1996.05.06
(31) 95108559 (32) 1995.06.07 (33) RU
(85) 1998.01.06
(86) PCT/RU96/00116, 1996.05.06
(87) WO 96/40740, 1996.12.19
(43) 1998.09.30
(71) Заявитель: ИММУНОТЕХ ДЕВЕЛОПМЕНТС ИНК. (US)
(72) Авторы: Дейгин Владислав Исакович; Коротков Андрей Марксович
(RU)
(73) Патентообладатель: ИММУНОТЕХ
ДЕВЕЛОПМЕНТС ИНК. (US)
(56) EP 0101929 A1, 1984.
WO 95/03067 A1.
GB 2109796 A, 1983.
WO 89/06134 A1.
GB 1526367, 1978.
US 3832337, 1974.
BY 7720 C1 2006.02.28
(57)
1. Пептид общей формулы I:
X-A-D-Trp-Y (I),
где Х представляет собой водород, глицин, аланин, лейцин, изолейцин, валин, N-валин,
пролин, тирозин, фенилаланин, триптофан, D-аланин, D-лейцин, D-изолейцин, D-валин,
D-N-валин, D-пролин, D-тирозин, D-фенилаланин, D-триптофан, γ-аминомасляную кислоту или ξ-аминокапроновую кислоту;
А представляет собой D-глутаминовую кислоту или iD-глутаминовую кислоту; и
Y представляет собой глицин, аланин, лейцин, изолейцин, валин, N-валин, пролин,
тирозин, фенилаланин, триптофан, D-аланин, D-лейцин, D-изолейцин, D-валин, D-Nвалин, D-пролин, D-тирозин, D-фенилаланин, D-триптофан, γ-аминомасляную кислоту,
ξ-аминокапроновую кислоту, гидроксил или амид, замещенный С1-С3-алкилом.
2. Пептид по п. 1, отличающийся тем, что
Х представляет собой водород, D-аланин, D-лейцин, D-изолейцин, D-валин, D-N-валин,
D-пролин, D-тирозин, D-фенилаланин или D-триптофан; и
Y представляет собой D-аланин, D-лейцин, D-изолейцин, D-валин, D-N-валин, Dпролин, D-тирозин, D-фенилаланин, D-триптофан, гидроксил или амид, замещенный С1С3-алкилом.
3. Пептид по п. 1, отличающийся тем, что
Х представляет собой водород;
А представляет собой iD-глутаминовую кислоту; и
Y представляет собой гидроксил или амид, замещенный С1-С3-алкилом.
4. Пептид по п. 1, отличающийся тем, что представляет собой последовательность HiD-Glu-D-Trp-OH.
5. Пептид по п. 1, отличающийся тем, что представляет собой последовательность HD-Glu-D-Trp-OH.
BY 7720 C1 2006.02.28
6. Пептид по п. 1, обладающий способностью модулировать пролиферацию клеток.
7. Пептид общей формулы I:
X-A-D-Trp-Y (I),
где Х представляет собой водород, глицин, аланин, лейцин, изолейцин, валин, N-валин,
пролин, тирозин, фенилаланин, триптофан, D-аланин, D-лейцин, D-изолейцин, D-валин,
D-N-валин, D-пролин, D-тирозин, D-фенилаланин, D-триптофан, γ-аминомасляную кислоту или ξ-аминокапроновую кислоту;
А представляет собой D-глутаминовую кислоту или iD-глутаминовую кислоту; и
Y представляет собой глицин, аланин, лейцин, изолейцин, валин, N-валин, пролин,
тирозин, фенилаланин, триптофан, D-аланин, D-лейцин, D-изолейцин, D-валин, D-Nвалин, D-пролин, D-тирозин, D-фенилаланин, D-триптофан, γ-аминомасляную кислоту,
ξ-аминокапроновую кислоту, гидроксил или амид, замещенный С1-С3-алкилом,
обладающий способностью ингибировать пролиферацию клеток.
Изобретение относится к медицине, а именно к способам получения биологически активных веществ, обладающих иммунорегулирующими свойствами, и может найти применение в медицине, ветеринарии, а также в экспериментальной биохимии.
Предшествующий уровень техники.
Актуальность разработки новых безвредных иммунорегулирующих пептидов, способных остановить прогрессирующий рост таких заболеваний, как злокачественные новообразования, сепсис, хронические и вялотекущие инфекции, развивающиеся на фоне
иммунодефицитных состояний, подтверждается большим количеством исследований,
проведенных в этой области.
Наиболее распространенным способом выявления новых пептидов является выделение активных пептидных фракций из суммарных тканевых экстрактов, фракционированию и очистке вплоть до выделения индивидуального вещества и его идентификации
[SU 1600047, SU 1638849, SU 1737798]. В практической медицине широко известны в качестве регуляторов иммунных процессов тимусные экстракты, в частности тимозин фракция 5 [Goldstein A.L., Guna A., Latz M.M., Hardy H.A., White A.], тималин [CH 659586].
Эти экстракты состоят из комплекса веществ полипептидной природы и получение их из
природных источников ограничено сложностью производства, малым выходом активных
веществ и значительной вариабельностью их физико-химических характеристик и биологических свойств. Кроме того, из-за присутствия в природных препаратах тимуса балластных компонентов при их использовании у больных иногда возникают побочные
явления. Последнее обстоятельство явилось стимулом для создания синтетических пептидных препаратов. В настоящее время осуществлен синтез ряда пептидов, обладающих
иммунорегуляторными свойствами: РСТ WO 089/06134, SU 1541821, SU 1518956, ЕР
230052, ЕР 406931, US 5021551, US 5013723. Каждый из полученных синтетических пептидов с ограниченным комплексом необходимых свойств обладает высокой активностью,
низкой токсичностью, отсутствием побочных эффектов, которые определяют их возможное применение в медицине.
Раскрытие изобретения.
В основу изобретения положена задача создания нового синтетического биологически
активного пептида, обладающего иммунорегулирующим свойством, формулы:
X-A-D-Trp-Y,
где А - представляет собой D-Glu или iD-Glu;
X - представляет собой водород, Gly, Ala, Leu, Ile, Val, NVal, Pro, Tyr, Phe, Trp, D-Ala,
D-Leu. D-Ile. D-Val, D-NVal, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, γ-аминомасляную кислоту или ξаминокапроновую кислоту;
2
BY 7720 C1 2006.02.28
Y - представляет собой Gly, Ala, Leu, Ile, Val, NVal, Pro, Тyr, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu,
D-Ile, D-Val. D-NVal, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, γ-аминомасляную кислоту, ξ-аминокапроновую кислоту, -OH или амид, замещенный С1-С3-алкилом.
Целью изобретения было также создание принципиально нового технологического процесса получения вещества пептидной природы, который позволил бы при минимальном количестве и простоте стадий получать с высоким выходом продукт вышеприведенной
формулы, что является определяющим при производстве фармацевтического препарата.
Сущность нового способа состоит в синтезе глутамилсодержащих пептидов в растворе
путем раскрытия внутреннего ангидрида третбутилокси-карбонил глутаминовой (D или L)
кислоты соответствующим производным D-Trp-Y с последующим хроматографическим
разделением α- и γ-изомеров. Дальнейший синтез проводили путем наращивания пептидной цепи с помощью активированных эфиров третбутилоксикарбониламинокислот.
Для ряда аналогов соединений пептида в табл. 1 приведены значения Rf1 в системе
(хлороформ-метанол-32 % уксусная кислота = 60:45:20) и Rf2 в системе (бутанол-пиридинвода-уксусная кислота = 5:5:4:1).
Таблица 1
Пептид
Abu-D-Glu-D-Trp-OH
Abu-iD-Glu-D-Trp-OH
Aca-D-Glu-D-Trp-OH
Aca-iD-Glu-D-Тrр-OH
Ala-D-Glu-D-Тrр-OH
Ala-iD-Glu-D-Trp-OH
D-Ala-D-Glu-D-Trp-D-Ala
D-Ala-D-Glu-D-Trp-OH
D-Ala-iD-Glu-D-Trp-D-Ala
D-Ala-iD-Glu-D-Trp-OH
D-Ile-D-Glu-D-Trp-D-Leu
D-Ile-D-Glu-D-Trp-OH
D-Ile-iD-Glu-D-Trp-D-Leu
D-Ile-iD-Glu-D-Trp-OH
D-Leu-D-Glu-D-Trp-OH
D-Leu-iD-Glu-D-Trp-OH
D-NVal-D-Glu-D-Trp-OH
D-NVal-iD-Glu-D-Trp-OH
D-Phe-D-Glu-D-Trp-Ala
D-Phe-iD-Glu-D-Trp-Ala
D-Pro-D-Glu-D-Trp-OH
D-Pro-iD-Glu-D-Trp-OH
D-Trp-D-Glu-D-Trp-OH
D-Trp-iD-Glu-D-Trp-OH
D-Tyr-D-Glu-D-Trp-D-Tyr
D-Tyr-iD-Glu-D-Trp-D-Tyr
D-Val-D-Glu-D-Trp-OH
D-Val-iD-Glu-D-Trp-OH
Gly-D-Glu-D-Trp-NVal
Gly-D-Glu-D-Trp-OH
Gly-iD-Glu-D-Trp-NVal
Rf1
0.32
0.29
0.31
0.28
0.34
0.32
0.22
0.26
0.25
0.25
0.35
0.36
0.34
0.27
0.36
0.35
0.33
0.32
0.37
0.36
0.38
0.37
0.41
0.40
0.39
0.38
0.34
0.33
0.29
0.30
0.32
3
Rf2
0.53
0.49
0.52
0.49
0.61
0.55
0.41
0.51
0.50
0.51
0.53
0.54
0.53
0.52
0.53
0.52
0.51
0.51
0.56
0.55
0.58
0.58
0.59
0.59
0.58
0.58
0.51
0.50
0.51
0.54
0.53
BY 7720 C1 2006.02.28
Gly-iD-Glu-D-Trp-OH
0.29
H-D-Glu-D-Trp-Аbu
0.33
H-D-Glu-D-Trp-Аса
0.30
Н-D-Glu-D-Trp-D-Ile
0.35
Н-D-Glu-D-Trp-D-Pro
0.37
H-D-Glu-D-Glv
0.29
H-D-Glu-D-Trp-Ilе
0.36
H-D-Glu-D-Trp-Leu
0.36
Н-D-Glu-D-Trp-Lvs
0.28
H-D-Glu-D-Trp-OH
0.36
H-D-Glu-D-Trp-Phe
0.39
H-D-Glu-D-Trp-Pro
0.38
H-D-Glu-D-Trp-Tyr
0.37
H-D-Glu-D-Trp-Val
0.38
H-iD-Glu-D-Trp-Abu
0.34
H-iD-Glu-D-Trp-Aca
0.33
H-iD-Glu-D-Trp-D-Ile
0.34
H-iD-Glu-D-Trp-D-Pro
0.36
H-iD-Glu-D-Trp-Gly
0.28
H-iD-Glu-D-Trp-Ile
0.34
H-iD-Glu-D-Trp-Leu
0.35
H-iD-Glu-D-Trp-Lys
0.27
H-iD-Glu-D-Тrp-OH
0.30
H-iD-Glu-D-Trp-Phe
0.38
H-iD-Glu-D-Trp-Pro
0.37
H-iD-Glu-D-Trp-Tyr
0.35
H-iD-Glu-D-Trp-Val
0.36
Ile-D-Glu-D-Trp-D-Phe
0.42
Ile-D-Glu-D-Trp-OH
0.38
Ile-iD-Glu-D-Trp-D-Phe
0.40
Ile-iD-Glu-D-Trp-OH
0.37
Leu-D-Glu-D-Trp-OH
0.35
Leu-iD-Glu-D-Trp-OH
0.27
NVal-D-Glu-D-Trp-OH
0.35
NVal-iD-Glu-D-Trp-OH
0.34
Phe-D-Glu-D-Trp-OH
0.41
Phe-iD-Glu-D-Trp-OH
0.40
Pro-D-Glu-D-Trp-OH
0.43
Pro-iD-Glu-D-Trp-OH
0.42
Trp-D-Glu-D-Trp-OH
0.45
Trp-iD-Glu-D-Trp-OH
0.44
Tyr-D-Glu-D-Trp-OH
0.42
Tyr-iD-Glu-D-Trp-OH
0.41
Val-D-Glu-D-Trp-D-Val
0.46
Val-D-Glu-D-Trp-OH
0.33
Val-iD-Glu-D-Trp-D-Val
0.44
Val-iD-Glu-D-Trp-OH
0.34
Лучшие варианты осуществления изобретения.
Изобретение иллюстрируется следующим примером.
4
0.53
0.52
0.53
0.58
0.61
0.54
0.58
0.59
0.47
0.56
0.61
0.59
0.58
0.61
0.51
0.50
0.55
0.58
0.52
0.57
0.58 .
0.45
0.52
0.61
0.60
0.58
0.60
0.68
0.56
0.67
0.55
0.62
0.57
0.61
0.60
0.63
0.62
0.63
0.62
0.68
0.67
0.64
0.63
0.68
0.50
0.66
0.52
BY 7720 C1 2006.02.28
Пример.
H-D-Glu-D-Trp-OH и H-iD-Glu-D-Trp-OH
1. Получение Boc-D-Glu-OH
14,7 (0.1 моля) H-D-Glu-OH растворяли 200 мм дистиллированной воды, одномолярным раствором КОН доводили рН до 10,2 и при интенсивном перемешивании добавляли
раствор 33,0 г (0,3 моля) ВОС2О в диоксане. Следили за величиной рН на рН-стате. После
окончания реакции смесь помещали в делительную воронку, экстрагировали из щелочной
среды 3x150 мм этилацетатом. Водную фазу медленно подкисляли 0,2 % раствором серной кислоты до рН = 3,0 и экстрагировали Boc-D-Glu-OH в органическую фазу (3х200 мм).
Органический слой промывали 3x200 мм насыщенным раствором Na2SO4 до нейтральной
среды, сушили над Na2SO4. Упаривали в вакууме до маслообразного состояния. Выход:
16,7 г (68 %).
2. Получение смеси Boc-D-Glu-D-Trp-OH и Boc-iD-Glu-D-Trp-OH
16,7 г (0,068 моль) Boc-D-Glu-OH растворяли в 200 мл диметилформамида, охлаждали
до 0° и при перемешивании добавляли раствор 20,6 г (0,1 моль) N,N'-дициклогексилкарбодиимида в 100 мл диметилформамида. Смесь перемешивали 4 ч при + 4 °С и оставляли на 8 ч при комнатной температуре. Выпавший осадок дициклогексилмочевины
отфильтровывали, осадок промывали 2x50 мм диметилформамидом, фильтрат упаривали
в вакууме до 1/2 объема и добавляли при охлаждении до + 4 °С и интенсивном перемешивании 24,3 (0,1 моль) H-D-Trp-OK. Раствор оставляли постепенно нагреваться до комнатной температуры. Об окончании реакции следили по ТСХ в системе (хлороформ:
этилацетат: метанол 6:3:1) до исчезновения пятна внутреннего ангидрида Boc-D-Glu кислоты. Остатки дициклогексил мочевины отфильтровывали, диметилформамид упаривали
в вакууме. К маслообразному остатку добавляли 200 мм этилацетата и 200 мл 0.2 % раствора серной кислоты. Органический слой отделяли, промывали до нейтральной среды
насыщенным раствором Na2SO4, сушили над Na2SO4, этилацетатный раствор упаривали в
вакууме. Полученный маслообразный осадок представлял собой смесь Boc-D-Glu-D-TrpOH и Boc-iD-Glu-D-Trp-OH. Общий выход масла составил 25.4 г (70 %).
3. Получение H-D-Glu-D-Trp-OH и H-iD-Glu-D-Trp-OH
25,4 г (0,048 моля) смеси растворяли в 200 мл муравьиной кислоты, перемешивали при
40 °С в течение 1 ч и упаривали в вакууме до маслообразного состояния. Разделение и
очистку пептидов проводили с помощью ионообменной хроматографии на колонке с Сефадексом в градиенте 0,01-0,2 М пиридинацетатного буфера. Выход: 5.7 г (35 %) H-D-GluD-Trp-OH и 5,7 г (35 %) H-iD-Glu-D-Trp-OH.
В результате изучения физико-химических свойств пептида были получены следующие его характеристики:
Первичная структура- H-D-Glu-D-Trp-OH и H-iD-Glu-D-Trp-OH
Брутто формула - C16H20N3O5
Молекулярный вес - 334.35
Внешний вид - белый с желтоватым оттенком или серый порошок.
Растворимость - легко растворим в воде, умеренно в спирте, практически не растворим в хлороформе.
У.Ф.- спектр в области 250-300 нм имеет максимум 280±2 мм, плечо 287±2нм.
Биологическая активность нового пептида изучалась на мышах линии Balb/c. Клетки
селезенки мышей суспендировали в среде RPMI 1640 с 2 мм глутамина и 5 % инактивированной фатальной сыворотки и вносили в плоскодонные планшеты в количестве 100 мкл.
соответственно, 200.000 клеток на лунку. Исследуемый препарат вносили в начале культивирования. В качестве митогена использовали конканавалин А в конечной концентрации 2 мкг на лунку. Планшеты инкубировали при 37 °С и 5 % СО в течение 48 ч. Пролиферацию клеток оценивали по включению 3Н-тимидина, вносимого за 24 ч до оконча5
BY 7720 C1 2006.02.28
ния культивирования в дозе 5 мкг/мл с помощью сцинтилляционного счетчика, и выражали
в количестве распадов в минуту (СРМ). Полученные результаты суммированы в табл. 2.
Таблица 2
Препарат
iD-Glu-D-Trp
Cyclosporin A
Control
1
68594
67649
СРМI*
Доза препарата (мкг/мл)
5
10
63428
20043
2698
574
61467
20
13222
569
* - среднее из трех определений.
Установлено, что новый пептид обладает способностью ингибировать пролиферацию
селезеночных клеток.
С целью изучения безопасности пептида проводили изучение его острой токсичности.
Изучение острой токсичности проводили в соответствии с Методическими рекомендациями Фармакологического комитета РФ "Требования к доклиническому изучению общетоксичного действия новых фармакологических веществ". - М., 1985.
Результаты исследований показали, что при внутрибрюшинном введении 1000 кратной дозы пептид не оказывал острого токсичного действия, и при этих дозах оказалось
невозможным достигнуть их LD50.
Тестирование синтезированных пептидов тимодепрессина.
Новую серию пептидов тестировали in vivo, ex vivo и в условиях, когда костный мозг
подвергался облучению (1 Gy) ex vivo. L-Leu-Тимодепрессин и D-Leu-Тимодепрессин
инъецировали мышам-донорам, 100 мкг/кг, в/в, за 48 ч до изъятия костного мозга. Костный мозг инкубировали в присутствии пептидов (0.02 мкг/мл суспензии) в течение 60 мин
при 37 °С, а затем, без предварительной промывки, инъецировали летально облученным
реципиентам. Суспензию костного мозга облучали (1 Gy), а затем инъецировали летально
облученным реципиентам.
Через двадцать-тридцать минут после инъецирования суспензии тем же самым реципиентам внутрибрюшинно инъецировали пептиды (100 мкг/кг). Колонии считали на 9-й
день. В табл. 3 представлены данные по влиянию новых пептидов на гемопоэтические
клетки-предшественники in vivo, при облучении (1 Gy) ex vivo и при инкубации ex vivo в
присутствии костного мозга.
Таблица 3
Влияние пептидов на колониеобразование (1) при облучении костного мозга ех vivo (1 Gy);
(2) при их инъецировании донору (in vivo); (3) при инкубации костного мозга ex vivo
Группа
Контроль
l Gy
Тимодепрессин
L-Val-Тимодепрессин
L-Ile-Тимодепрессин
L-Leu-Тимодепрессин
L-Ala-Тимодепрессин
D-Ala-Тимодепрессин
D-Leu-Тимодепрессин
Среднее число колоний
in vivo
ex vivo
ex vivo 1 Gy
12,4 ± 0,4*
10,8 ± 0,6*
10,1 ±0,4**
–
–
5,7 ± 0,4*р = 0,00001**
5,8 ±0,7
7,8±0,3 р = 0,003 5,9 ± 0,2 р = 0,0002
11,8 ±0,5
10,6 ± 0,6
10,2±0,6 р = 0,00006
10,0
±
0,9
9,5 ± 0,6
3,4 ± 0,4 р = 0,001
12,9 ± 0,6
11,0 ±1,0
7,6 ± 0,9
12,2 ± 0,7
10,5 ± 0,7
7,5 ± 0,7
18,8 ± 0,8 p<0,0001 6,8 ± 0,3 p = 0,0001
8,0 ± 0,5 p = 0,004
10,6 ± 1,1
5,4 ± 0,6
6,5 ± 0,9 p = 0,0002
Все пептиды тимодепрессина обладали иммунорегуляторными свойствами.
6
BY 7720 C1 2006.02.28
Как с очевидностью следует из данных, приведенных в табл. 3, все пептиды тимодепрессина обладают иммунорегуляторными свойствами. Действие пептидов из группы с
присоединенным L-аминокислотным остатком (Val, Leu, Ala) приводит к восстановлению
колониеобразующей способности костного мозга после его облучения (1 Gy) ex vivo. Исключение составляет трипептид Ilе-тимодепрессин: инъекция этого пептида способствовала уменьшению количества колоний, образуемых облученным костным мозгом.
Что касается пептидов с присоединенным D-аминокислотным остатком, было показано, что D-Ala-Тимодепрессин оказывает стимулирующее действие на популяцию коммитированных колониеобразующих клеток интактного костного мозга in vivo, также как и
облученных (1 Gy) клеток костного мозга. Инкубирование суспензии в присутствии пептида приводит к снижению числа колоний по сравнению с таковым при действии тимодепрессина. Тимодепрессин и D-Leu-Тимодепрессин обладают сходными свойствами (исключение составляет случай, когда костный мозг подвергают облучению ex vivo).
Результаты исследования.
По своему действию на популяцию колониеобразующих клеток селезенки (CFU-S)
пептиды были разделены на следующие группы:
1. d-дипептиды
2. d-трипептиды
Изучались следующие свойства:
какое действие оказывают пептиды, инъецированные интактным донорам за 2 дня до
извлечения костного мозга, на популяцию клеток CFU-S-8 (CFU-S-8);
влияние пре-инкубации костного мозга с пептидами на популяцию клеток CFU-S-8
(CFU-S-8-инкубация);
влияние пептидов на восстановление колониеобразующей способности костного мозга, облученного (1 Gy) ex vivo (CFU-S-8-1 Gy);
влияние пептидов на процент клеток CFU-S, находящихся в S-фазе клеточного цикла
в костном мозге интактных доноров (пептид инъецировали донору, и через 48 ч определяли процент клеток CFU-S, находящихся в S-фазе клеточного цикла (S-интакт.);
влияние пептидов на процент клеток CFU-S, находящихся в S-фазе клеточного цикла
в костном мозге облученных (4 Gy) доноров (пролиферирующие CFU-S) (S-4 Gy).
Обозначения: — отсутствие эффекта
↑ повышение
↓ снижение
Таблица 4
1.
2.
3.
4.
П
CFU-S-8
Пептид
d-Glu-d-Trp
↓
γ-d-Glu-d-Trp
↓
d-Ile-d-Trp
—
Boc-γ-dGlu-dTrp
↓
d-пептиды
CFU-S-8-инкуб. CFU-S-8-1 Gy S-интактн. S-4 Gy
↓
↓
—
—
—
—
↓
↓
↓
↓
Glu-содержащие d-дипептиды способствуют уменьшению популяции клеток CFU-S в костном мозге интактных доноров; ингибированию колониеобразующей способности костного мозга, преинкубированного с пептидами; снижению пролиферации CFU-S как в
быстро пролиферирующем, так и в интактном костном мозге. Замена d-Glu на d-Ile не изменяет характеристических свойств Glu-содержащих дипептидов.
7
BY 7720 C1 2006.02.28
Таблица 5
d-трипептиды
CFU-S-8 CFU-S-8-инкуб. CFU-S-8-1 Gy S-интактн. S-4 Gy
П
Пептид
1. dAla-dGlu-dTrp
↑
↓
↑
↑
↓
2. dAla-γ-dGlu-dTrp
↑
↓
↑
3. dIle-dGlu-dTrp
↓
4. dLeu-γ-dGlu-dTrp
—
↓
↓
Связывание dAla с d-дипептидами (dGlu-dTrp) способствует появлению новых свойств:
способности увеличивать популяцию клеток CFU-S-8 в интактном костном мозге и стимулировать их пролиферацию; в то же время трипептиды способствуют снижению процента CFU в S-фазе клеточного цикла в пролиферирующем костном мозге. Связывание
dIle или dLeu не изменяет характеристических свойств d-дипептидов (dGlu-dTrp).
Пояснения:
Свойства трипептида dAla-γ-dGlu-dTrp (dATd) проверяли по его способности ингибировать хронический GVHD (заболевание трансплантат против хозяина) в тесте на спленомегалию.
Гибридных мышей первого поколения (_ _ _57_1)F1 инъецировали мышиными селезеночными клетками _57_1, дважды, с 7-дневным интервалом. Инъекции пептидов iLD
(100 мкг/кг), dATd (100 мкг/кг) и преднизолона (5 мг/кг) начинали делать после первой
инъекции клеток селезенки и продолжали в течение 20 дней. На 21-й день мышей и их селезенки взвешивали и определяли степень спленомегалии (SR) и процент ингибирования
спленомегалии ( % SI).
Таблица 6
Влияние пептида на развитие хронического GVHD
(по степени ингибирования спленомегалии, % SI)
Группа
Мыши, n
SR
%SI
Контроль
7
7,45 + 0,8*
iLD
7
5,2 ± 0,3_ = 0,02
68
dATd
7
5,4 ± 0,4_ = 0,04
59
Преднизолон
7
5,4 ± 0,7
59
Интактн.
5
4,0 ± 0,2
Таким образом, как инъекции дипептида, так и инъекции трипептида вызывали значительное снижение степени спленомегалии, а следовательно, способствовали торможению
хронического GVHD.
Следует подчеркнуть, что оба пептида обладают весьма интересным свойством: они
повышают процент CFU-S в S-фазе клеточного цикла в интактном костном мозге, а в пролиферирующем костном мозге снижают его (табл. 6), т.е. они могут служить модуляторами пролиферации. Это предположение, однако, следует тщательно проверить на различных клеточных популяциях.
Таблица 7
Влияние пептидов на процент CFU-S в S-фазе клеточного цикла в интактном
и в пролиферирующем (последующее облучение, 4 Gy) костном мозге
Пептид
% CFU-S в S-фазе в интактном
% SFU-S в S-фазе в пролиферикостном мозге
рующем костном мозге
Контроль
9,1
4Gy
66,2
dATd
47,8
34,4
8
BY 7720 C1 2006.02.28
Как показано методом проточной цитофлуориметрии, в костном мозге мышей, предварительно обработанных пептидом dATd за 48 ч до анализа, процент клеток, несущих
маркер CD25 (показатель фактора роста IL-2), был увеличен (18.1 против 11.0 в контроле),
а процент клеток, несущих маркер CD69, являющийся показателем активации Т-лимфоцитов, был снижен (0.26 против 0.78 в контроле).
Это предполагает, что пептид стимулирует клеточную пролиферацию и в то же время
снижает число активированных Т-лимфоцитов.
Далее, проверяли способность новых пептидов В_-Td и dIle-dGlu-dTrp усиливать образование колоний в селезенке, когда их инъецируют донору костного мозга за 48 ч до
экстракции костного мозга. Было обнаружено, что оба пептида статистически значимо
снижают количество колоний в костном мозге.
Таблица 8
Пептид
Счет колоний
Контроль
10,4 + 0,5*
B_-Td
7,2 + 0,6_ = 0,0009
dIle-dGlu-dTrp
6,4 ± 0,5_ = 0,00006
Тестирование иммуносупрессивных свойств dATd на модели локального GVHD.
Мышам-реципиентам (BDF1) инъецировали 20 млн. клеток селезенки мышей СВА
под апоневротическую пластинку с тыльной стороны лапки (опытная задняя лапа); другую лапу (контрольная задняя лапа) инъецировали таким же количеством сингенных клеток. DATd вводили реципиентам в дозе 100 мкг/кг, в/б, 4 раза, причем первую инъекцию
производили через 1 ч после инъекции клеток селезенки, а затем ежедневно. Контрольные
мыши получали физиологический раствор. На 6-й день извлекали подколенные лимфатические узлы, получали суспензии и собирали нуклеированные клетки. О тяжести GVHD
судили по соотношению между счетом клеток в лимфатических узлах опытной задней конечности к таковому в лимфатических узлах контрольной задней конечности (увеличение
отношения (IR). Наличие GVHD достоверно определяли при IR > 1.2.
Как видно из данных, представленных в табл. 8, обработка реципиентов dATd способствует элиминации GVHD. Ни у одного из обработанных пептидом тестированных
животных IR не превысило 0.85, что указывает на отсутствие заболевания трансплантатпротив-хозяина
Таблица 9
Влияние dATd на манифестацию локального GVHD
Обработка реципиента
6Gy
Повышение соотношения между лимфатическими узлами (IR)
Контроль
dATd
1.96; 1.85; 1.6; 1.94; 1.8;
0.2; 0.3; 0.7; 0.5;
2.2; 1.6; 1.9
0.5; 0.85; 0.4
среднее: 1.87 ± 0,3
среднее: 0.4 ±0.1
< 0.000001
В этой тест-системе dATd вызывает супрессию развития GVHD в значительно большей степени, чем Td.
Комбинированное действие dATd и Неогена или Тимогена на образование колоний в
селезенке.
Постановка эксперимента была такой же, как и в предшествующем преднизолоновом
тесте. Мышей-доноров инъецировали пептидом dATd, 100 мкг/кг, в/б, за 48 ч до изъятия
костного мозга. Неоген или Тимоген (10 мкг/кг, в/б) инъецировали летально облученным
реципиентам за 30-40 мин до инъекции суспензии костного мозга.
9
BY 7720 C1 2006.02.28
Как видно из табл. 10, инъекции тимогена реципиентам статистически значимо снижали число колоний CFU-S доноров, обработанных пептидом dATd. Неоген на этот параметр никоим влиял.
Таким образом, при такой постановке эксперимента комбинированное действие пептида dATd и тимогена оказалось почти таким же, как и действие преднизолона + тимогена.
Таблица 10
Влияние комбинации dATd и Неогена или Тимогена
на образование колоний в селезенке
dATd
—
+
+
+
Пептид
—
—
Неоген
Тимоген
Средний счет колоний
10.2 + 0.6*
14,1 ±0.5**
*0.0001
14.2 ±0.7
*0.0001
11.9 ±0.5
**0.009
* - по сравнению с контролем; /значимость вычислена против контроля
** - по сравнению с dATd. / значимость вычислена против dATd
Промышленная применимость.
Пептид, обладающий биологической активностью, может найти широкое применение
в медицине и ветеринарии.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
146 Кб
Теги
by7720, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа