close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY7794

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
BY (11) 7794
(13) C1
(19)
(46) 2006.02.28
(12)
7
(51) A 61K 39/04,
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
G 01N 33/531
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНОВ MYCOBACTERIUM
TUBERCULOSIS, MYCOBACTERIUM BOVIS
(21) Номер заявки: a 20021129
(22) 2002.12.31
(43) 2004.06.30
(71) Заявитель: Государственное учреждение "Республиканский научнопрактический центр гигиены" (BY)
(72) Авторы: Яковлева Людмила Федоровна; Федорович Сергей Владимирович; Казакова Татьяна Михайловна;
Лысенко Александр Павлович; Богданович Сергей Владимирович
(BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
учреждение "Республиканский научнопрактический центр гигиены" (BY)
(56) FIFIS T. et al. Infection and Immunity,
1991. - Vol. 59. - No. 3. - P. 800-807.
RU 2118538 С1, 1998.
RU 2035914 С1, 1995.
RU 2131263 С1, 1999.
RU 2031656 С1, 1995.
RU 2045959 С1, 1995.
BY 7794 C1 2006.02.28
(57)
Способ получения антигенов из микобактерий, выбранных из группы Mycobacterium
tuberculosis и Mycobacterium bovis, включающий культивирование микобактерий, осаждение антигенов из стерилизованного культурального фильтрата и их фракционирование
гель-фильтрацией, отличающийся тем, что микобактерии после культивирования дополнительно инактивируют путем внесения фенола до концентрации 3 %, а осаждение антигенов проводят, выдерживая культуральный фильтрат, содержащий 3 % фенола, при
температуре +2 - +8 °С, затем осадок растворяют в веронал-мединаловом буфере, pH 8,6,
добавляя по каплям 25 % раствор аммиака, и антигены выделяют одноэтапной гельфильтрацией.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к медицинской и ветеринарной
иммунологии, а именно к лабораторной диагностике, и касается получения антигенов
Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, которые могут быть использованы для
иммунодиагностики туберкулеза.
Известно, что для получения микобактериальных антигенов применяют аффинную
хроматографию с использованием поликлональных и моноклональных антител, лектинов,
а также физико-химические методы, включающие осаждение сульфатом аммония, жидкостную и ионообменную хроматографию, изоэлектрофокусирование или электрофорез. При
этом получают микобактериальные антигены разной специфичности и степени очистки (антиген 5, БЦЖ60, МРТ 59, МРТ64, МРВ 70, ESAT6, Тb38, LAM, TB10, BCG65, ТВ70).
Известен способ получения антигена, характерного для возбудителей туберкулеза
бычьего и человеческого вида и не встречающегося у атипичных микобактерий, заключающийся в выделении из культурального фильтрата возбудителя туберкулеза антигена
путем осаждения белков сульфатом аммония в 75 % насыщении, диализа для удаления
солей, хроматофокусировании на MonoP колонке, аффинной хроматографии на сефарозе с
BY 7794 C1 2006.02.28
Конканавалином А и гель-фильтрации на Биогеле Р100 [2]. Указанный способ является
прототипом к заявляемому.
Общими признаками для заявляемого способа и прототипа являются использование
культурального фильтрата в качестве исходного материала, осаждение фракции, содержащей целевой продукт, и его очистку с помощью гель-фильтрации.
Однако способ-прототип обладает недостатками в силу своей сложности, для его осуществления необходимо выполнение 5-6 стадий очистки и целого ряда промежуточных
этапов (что требует затраты дополнительного времени), при осуществлении которых возникают проблемы с частичной денатурацией и снижением активности антигенов.
Задачей заявляемого способа является повышение активности и специфичности получаемых антигенов Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis.
Поставленная задача достигается путем того, что предложен способ получения антигенов из микобактерий, выбранных из группы Mycobacterium tuberculosis и Mycobacterium
bovis, включающий культивирование бактерий, осаждение антигенов из стерилизованного
культурального фильтрата и их фракционирование гель-фильтрацией, когда бактерии после культивирования дополнительно инактивируются путем внесения фенола до концентрации 3 %, а осаждение антигенов проводят, выдерживая культуральный фильтрат,
содержащий 3 % раствор фенола, при температуре +2 - +8 °С, затем осадок растворяют в
веронал-мединаловом буфере, pH 8,6, добавляя по каплям 25 % раствор аммиака, и антигены выделяют одноэтапной гель-фильтрацией.
Пример конкретного выполнения.
Штаммы Mycobacterium tuberculosis H37Rv, Mycobacterium bovis Vallee, Mycobacterium
bovis 8 выращивают на среде Сотона в течение 8 недель при 37 °С, инактивируют внесением в посевы фенола до конечной концентрации 3 %. Бактериальную массу удаляют
центрифугированием при 3000 g 20 мин, культуральную жидкость пропускают через
стерилизующий фильтр. По 500 мл культуральных фильтратов помещают в холодильник с
температурой +2…+8 °С до спонтанного выпадения легкого осадка, из других 500 мл
сульфатом аммония 75 % насыщения осаждают антигенсодержащую фракцию. В обоих
случаях осадок собирают центрифугированием при 3000 g 20 мин. Спонтанно выпавший
осадок растворяют в веронал-мединаловом буфере pH 8,6, добавляя по каплям 25 % раствор аммиака, и очищают одноэтапной гель-фильтрацией. Осадок, полученный преципитацией сульфатом аммония, растворяют в 0,9 % растворе хлорида натрия и диализируют
общепринятым способом.
В табл. 1 приведены данные по влиянию способа осаждения на активность и специфичность в иммуноферментном анализе (ИФА) антигенов Mycobacterium bovis Vallee.
Как видно из табл. 1, исходный культуральный фильтрат интенсивно реагирует с
антисыворотками во всех разведениях. После осаждения сульфатом аммония активность
антигенов возбудителя туберкулеза заметно снижается и положительная реакция (превышение ОП 2,0 и более) отмечается только до разведения 1:6400, специфичность существенно не меняется и индекс специфической активности (ИСА) возрастает с 1,2 до 1,5 (на
25 %). Осадок, выпадающий при выдерживании культурального фильтрата с 3 % фенола,
обладает достоверно более высокой активностью, давая с антисывороткой М. bovis, разведенной 1:12800, превышение ОП в 11,2 раза. При этом перекрестные реакции с антисывороткой к антигенам атипичных микобактерий наблюдаются только до разведения
антисыворотки 1:3200, а ИСА составляет 2,8 (рост на 133 %).
Осаждение сульфатом аммония существенно не увеличивает специфичность антигенов возбудителя туберкулеза и несколько снижает их активность, в то время как антигены,
спонтанно выпадающие в осадок при выдерживании культурального фильтрата с 3-5 %
фенола, обладают достоверно более высокой активностью и специфичностью.
Высокие показатели полученной фракции были характерны и для других штаммов
(табл. 2 и 3).
2
BY 7794 C1 2006.02.28
Таблица 1
Влияние способа осаждения на специфичность
и активность антигенов возбудителя туберкулеза
Исходный
Осадок,
Осадок, выпавший при
культуральный
преципитированный
выдерживании культуРазвефильтрат
сульфатом аммония
рального фильтрата
дения
М. bovis Vallee
75 % насыщения
с 3 % фенола
антиантисыворотка антисы- антисыворотка антисы- антисыворотка антисысывок антигенам воротка к к антигенам воротка к к антигенам воротка к
роток
атипичных
М. bovis
атипичных
М. bovis
атипичных
М. bovis
микобактерий Vallee
микобактерий
Vallee
микобактерий
Vallee
х
х
х
х
х
1:100
4,3
4,9
2,3
3,2
4,7
6,6х
1:200
3,5
4,9
2,1
4,1
5,8
11,5
1:400
6,1
8,1
2,0
4,3
6,2
14,8
1:800
3,7
5,2
2,9
5,4
3,6
11,3
1:1600
5,7
7,6
2,6
4,3
4,8
15,0
1:3200
10,3
12,1
3,1
4,0
3,7
15,5
1:6400
6,3
6,8
3,2
3,7
1,7
8,6
1:12800
4,6
4,8
1,8
1,9
1,8
6,0
M±m
5,6 ± 0,72
6,8 ± 0,83
3,9 ± 0,33
4,0 ± 0,55
11,2 ± 1,25
2,5 ± 0,17
ИСА
1,2
1,5
2,8
Примечание:
х
- отношение оптической плотности /ОП/ с антисыворотками к антигенам атипичных микобактерий или к возбудителю туберкулеза к ОП нормальной сыворотки крови;
ИСА - индекс специфической активности, показывающий отношение среднего превышения
ОП с антисывороткой М. bovis к среднему превышению ОП с антисывороткой к смеси антигенов
атипичных микобактерий;
курсивом показаны отрицательные реакции.
Таблица 2
Активность и специфичность в ИФА фракции
культурального фильтрата М. bovis 8, спонтанно выпадающей в осадок
Осадок, выпавший при выдерживании
Исходный культуральный фильтрат
культурального фильтрата М. bovis 8 с
Разведения
М. bovis 8
5 % фенола
антисывоантисыворотка к антисыворотка антисыворотка к анроток
антисыворотка к
антигенам атипичк М. bovis
тигенам атипичных
М. bovis Vallee
ных микобактерий
Vallee
микобактерий
1:200
2,3х
3,3х
1,0х
2,3х
1:800
2,1
2,6
1,1
2,0
1:1600
2,0
2,3
1,1
2,0
1:12800
2,0
2,3
1,1
1,5
M±m
2,1 ± 0,06
2,6 ± 0,2
1,9 ± 0,14
1,1 ± 0,02
ИСА
1,4
2,0
Примечание:
х
- отношение оптической плотности /ОП/ с антисыворотками к антигенам атипичных микобактерий или к возбудителю туберкулеза к ОП нормальной сыворотки крови;
ИСА - индекс специфической активности, показывающий отношение среднего превышения
ОП с антисывороткой М. bovis к среднему превышению ОП с антисывороткой к смеси антигенов
атипичных микобактерий;
курсивом показаны отрицательные реакции.
3
BY 7794 C1 2006.02.28
Таблица 3
Активность и специфичность в ИФА фракции культурального
фильтрата М. tuberculosis H37Rv, спонтанно выпадающей в осадок
Исходный культуральный Осадок, выпавший при выдерживании культуфильтрат Mycobacterium tu- рального фильтрата Mycobacterium tuberculosis
Разведения
berculosis H37Rv
H37Rv с 3 % фенола
антисыво- антисыворотка антисывоантисыворотка к
роток
к антигенам
ротка к М.
антисыворотка
антигенам атипичатипичных ми- tuberculosis
к М. tuberculosis H37Rv
ных микобактерий
кобактерий
H37Rv
1:200
2,3х
2,5х
1,7x
2,4х
1:400
2,3
2,6
1,8
2,3
1:800
2,0
2,2
1,5
2,8
1:1600
2,0
2,3
1,2
2,0
M±m
2,15 ± 0,07
2,38 ± 0,14
2,4 ± 0,07
1,55 ± 0,11
ИСА
1,12
1,3
Примечание:
х
- отношение оптической плотности /ОП/ с антисыворотками к антигенам атипичных микобактерий или к возбудителю туберкулеза к ОП нормальной сыворотки крови;
ИСА - индекс специфической активности, показывающий отношение среднего превышения
ОП с антисывороткой М. bovis к среднему превышению ОП с антисывороткой к смеси антигенов
атипичных микобактерий;
курсивом показаны отрицательные реакции.
Как видно из табл. 3, фракции культуральных фильтратов штаммов М. tuberculosis H37Rv
практически не дают в ИФА реакций с антисывороткой к смеси антигенов атипичных микобактерий (превышение ОП в сравнении с нормальной сывороткой менее 2,0) и достаточно интенсивно реагируют с гомологичными антисыворотками.
Таким образом, по сравнению с прототипом заявляемый "Способ получения антигенов"
обладает следующими преимуществами: позволяет получать активные и высокоспецифичные антигены Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, которые могут быть
использованы для иммунодиагностики микобактериальных заболеваний, существенно упростив при этом способ получения.
Источники информации:
1. Adams L.G. In vivo and in vitro diagnosis of Mycobacterium bovis infection // Rev. sci.
tech. Off. int. Epiz. - 2001. - 20 (1). - P. 304-324.
2. Fifis Т., Costopoulos C. Radford A., Bacic A., Wood P. Purification and characterisation
of major antigens from Mycobacterium bovis culture filtrate // Infect. Immun. - 1991.- 59. P. 800-807.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
100 Кб
Теги
by7794, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа