close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY8050

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
BY (11) 8050
(13) C1
(19)
(46) 2006.04.30
(12)
7
(51) G 01N 33/49
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОЛИГОПЕПТИДОВ В ПЛАЗМЕ КРОВИ
(21) Номер заявки: a 20020283
(22) 2002.04.09
(43) 2003.12.30
(71) Заявитель: Государственное научное
учреждение "Институт биофизики и
клеточной инженерии Национальной
академии наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Гаврилов Виктор Борисович; Лобко Наталья Федоровна;
Конев Сергей Васильевич (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси"
(BY)
(56) US 5459322 A, 1995.
GB 2293986 A, 1996.
RU 2099693 C1, 1997.
BY 8050 C1 2006.04.30
(57)
Способ определения олигопептидов в плазме крови, включающий осаждение белков с
помощью трихлоруксусной или хлорной кислот с последующим центрифугированием и
измерение оптической плотности супернатанта плазмы крови в ультрафиолетовой области
спектра, отличающийся тем, что перед измерением в супернатант плазмы крови добавляют 0,7 М NаОН до рН 13,0-13,1, оптическую плотность полученной пробы измеряют
при длине волны 290 нм в кювете 1 см, а содержание олигопептидов определяют в пробе
по формуле:
Д2 = Д1-Д0,
где Д2 - содержание олигопептидов в пробе;
Д1 – оптическая плотность пробы, содержащей супернатант плазмы крови;
Д0 - оптическая плотность пробы, не содержащей супернатант.
BY 8050 C1 2006.04.30
Изобретение относится к клинической биохимии, а именно к биохимическому анализу
крови, и может быть использовано для диагностики синдрома эндогенной интоксикации
при инфекционных, онкологических, эндокринных и травматических заболеваниях.
Эндогенная интоксикация (ЭИ) является одним из ведущих патогенетических синдромов в развитии широкого спектра заболеваний. Усиление катаболических процессов в
первичном очаге заболевания приводит к эндогенному образованию токсических продуктов распада тканей. Выход этих продуктов в кровь и распространение по организму вызывает генерализацию патологического процесса и общую интоксикацию организма.
В настоящее время основным критерием выраженности токсемии считают содержание
в крови среднемолекулярных пептидов - продуктов протеолиза белков с молекулярной
массой 500 - 5000 Да, которые называют молекулами средней массы (МСМ) или олигопептидами (ОП).
Наиболее точным методом определения ОП в плазме крови является метод гельфильтрации депротеинизированного образца на колонке с сефадексом G-25 и количественное определение элюируемых пептидных фракций с молекулярной массой 500-5000 Да
по поглощению при 210 нм [1]. К сожалению, этот метод является очень трудоемким и
длительным и используется только в научных исследованиях.
Известен метод определения ОП, по которому их суммарное содержание определяют
в депротеинизированной плазме с помощью реакции Лоури [2]. Депротеинизацию плазмы
проводят путем добавления к 1мл плазмы 0,5 мл 15 % трихлоруксусной кислоты (ТХУ)
или 1,2 М хлорной кислоты (ХК) и осаждения белков с помощью центрифугирования. К
недостаткам метода относятся его большая длительность и трудоемкость, а также чувствительность реакции Лоури к присутствию целого ряда небелковых соединений. По этим
причинам указанный метод не получил распространения в клинических исследованиях.
С целью быстрого и простого определения ОП предложен скрининг-метод, по которому их концентрацию оценивают непосредственно по величине ультрафиолетового (УФ)
поглощения супернатанта (при длине волны 254 нм), полученного после осаждения белков 10 % ТХУ и разведенного в 10 раз дистиллированной водой [3]. Основным недостатком указанного метода является его низкая специфичность, так как в УФ-области помимо
пептидов поглощают многие другие органические соединения, содержащиеся в плазме
(мочевина, мочевая кислота, креатинин, нуклеотиды и др.). Поэтому величину УФпоглощения Д254 разные авторы оценивают не как концентрацию ОП, а как интегральный
показатель содержания молекул средней массы (МСМ) или всех веществ низкой и средней молекулярной массы (ВНСММ).
Прототипом предлагаемого изобретения является способ определения содержания
ОП, основанный на осаждении белков хлорной кислотой (НСlO4), разведении супернатанта дистиллированной водой и измерении его УФ-поглощения при 210 нм или 280 нм (прототип 1) [1]. Длина волны 210 нм соответствует максимуму поглощения пептидной связи,
а 280 нм - максимуму поглощения ароматических аминокислот (тирозина и триптофана).
В отличие от ТХУ хлорная кислота не поглощает в ультрафиолетовой области и не влияет
на УФ-поглощение измеряемых проб в области 210-260 нм. Установлено, что значение
показателей Д210 и Д280 прямо коррелирует с содержанием ОП, измеряемым методом гельфильтрации. С другой стороны, поглощение Д254 не может служить индикатором содержания ОП из-за отсутствия корреляции между двумя этими показателями. Однако специфичность определения концентрации ОП по показателям Д210 и Д280 остается
недостаточно высокой, о чем свидетельствуют средние значения коэффициентов корреляции между оптическими показателями и концентрацией ОП (коэффициенты корреляции
составляли 0,58 и 0,45 соответственно). Исходя из сравнения величин оптического поглощения, коротковолновый вариант измерения ОП по 210 более чем в 5 раз превосходит по
чувствительности длинноволновый вариант (измерение Д280). Поэтому в клинических исследованиях в основном измеряют показатель Д210. Кроме того, как показали наши иссле2
BY 8050 C1 2006.04.30
дования, измерение ОП по поглощению Д280 указанным способом характеризует содержание только триптофановых остатков в пептидах.
Для повышения специфичности определения ОП в плазме крови предложен метод, по
которому после первичного осаждения белков с помощью хлорной кислоты проводят досаждение высокомолекулярных соединений 80 % этанолом и измеряют содержание ОП по
поглощению супернатанта при 210 нм (прототип 2) [4]. Недостатком метода является увеличение трудоемкости и длительности анализа из-за необходимости проведения дополнительной операции осаждения.
Отличительной сущностью предлагаемого способа определения ОП в плазме крови
путем осаждения белков с помощью трихлоруксусной или хлорной кислот и измерения
оптической плотности супернатанта плазмы крови является регистрация оптической
плотности пробы при длине волны 290 нм и рН 13,0-13,1.
По сравнению с известными прототипами предлагаемый способ более прост, имеет в
1,3 раза большую чувствительность и более точно измеряет суммарное содержание триптофановых и тирозиновых остатков в пептидах.
Существенность предлагаемых условий для определения содержания ОП подтверждается следующими исследованиями и примерами.
Установлено, что обработка 80 % этанолом супернатанта плазмы крови, полученного
после осаждения белков 0,6 М хлорной кислоты, и отделение осадка действительно резко
снижает величину поглощения при 210 нм (Д210) на 43 %, но практически не влияет на величину поглощения при 280 нм (Д280) (снижение на 5 %) (табл. 1).
Очевидно, что при осаждении белков снижение оптической плотности должно происходить в одинаковой степени как при 210 нм, так и при 280 нм. Так как уменьшение оптической плотности после обработки образца 80 % этанолом наблюдалось только при
210 нм, то этот эффект можно объяснить не осаждением белков, а удалением других органических соединений, которые имеют максимум поглощения в области 210 нм и не поглощают в области 280 нм. К таким соединениям относится широкий ряд веществ,
содержащих бензольные кольца, карбонильные и карбоксильные группы, в частности жирные кислоты, некоторые углеводы и липиды. Практическим следствием обнаруженного эффекта является возможность измерения ОП по поглощению Д280 без дополнительного осаждения УФ-поглощающих веществ этанолом, что значительно упрощает анализ.
Таблица 1
Показатели оптической плотности супернатанта плазмы крови Д210 и Д280
после обработки плазмы 0,6 М хлорной кислоты (ХК) и 80 % этанолом
(конечное разведение плазмы - 15 раз)
Оптический показатель
Д210
Д280
После обработки 0,6 После обработки 80 %
М ХК (Д1)
этанолом (Д2)
0,387±0,019
0,221±0,010
0,060±0,005
0,057±0,005
Д2/Д1, %
57,1
95,0
Впервые обнаружено, что при щелочном сдвиге рН супернатанта плазмы крови происходит увеличение оптической плотности и длинноволновое смещение максимума поглощения в области 280 нм. Изменение этих показателей достигало максимальных
значений при рН = 13,0-13,1, при котором интенсивность поглощения возрастала на 20 %
по сравнению с нейтральным рН, а максимум поглощения сдвигался с 280 нм до 290 нм
(рисунок).
Анализ поглощения ароматических аминокислот и основных небелковых компонентов плазмы крови в концентрациях, соответствующих верхней границе нормы [5, 6], показал, что при измерении их поглощения предлагаемым методом по сравнению с известным
поглощение тирозина (Дтир) возрастает в 1,7 раза, поглощение триптофана (Дтрп) снижа3
BY 8050 C1 2006.04.30
ется на 30 %, а суммарное поглощение небелковых компонентов (глюкозы, мочевины и
АТФ - Днб) падает почти в 2 раза (табл. 2).
Таблица 2
Оптическое поглощение плазмы крови и ее компонентов в условиях
определения олигопептидов по известному методу (280 нм и рН 6,5)
и предлагаемому методу (290 нм, рН 13,0)
Показатели оптического поглощения компонентов плазмы
Супернатант плазмы
(Дпл/мл)
Тирозин (Дтир)
Триптофан (Дтрп)
Глюкоза (Дг)
Мочевина (Дм)
АТФ (Да)
Дак = Дтир + Дтрп
Dнб
Доп = Дпл-Дак-Днб
Верхняя
граница
нормы,
мг/мл
18,1
15,3
1100
500
0,76
Известный метод (Д1)
Предлагаемый
метод (Д2)
Отношение
Д2/Д1, %
1,815
2,175
119,8
0,079
0,352
0,009
0,010
0,014
0,431
0,033
1,351
0,133
0,246
0,005
0,003
0,011
0,379
0,019
1,777
168,4
69,9
55,6
30,0
78,6
87,9
57,6
131,9
При этом собственное поглощение ОП (Доп) возрастает в 1,32 раза. Рост Доп обусловлен двумя причинами: 1) резким рН-зависимым усилением поглощения тирозина и
2) существенным снижением поглощения небелковых примесей за счет сдвига волны измерения в длинноволновую сторону.
Изменение вклада тирозина и триптофана в суммарное поглощение супернатанта
плазмы крови в предлагаемом способе существенно улучшает точность определения
ОП. Очевидно, что максимальная точность определения ОП должна соответствовать условиям, когда каждая аминокислота вносит равный вклад в измеряемый оптический сигнал. Измерение поглощения Д280 заведомо снижает точность определения ОП, так как
характеризует содержание только ароматических аминокислот и не чувствительно к содержанию других аминокислотных остатков. Более того, в известном способе чувствительность сигнала к триптофану более чем в 5 раз выше, чем к тирозину (табл. 3).
Таблица 3
Удельное поглощение тирозина и триптофана и вклад этих аминокислот
в УФ-поглощение плазмы крови при измерении по известному методу (280 нм,
рН 6,5) и предлагаемому методу (290 нм, рН 13,0)
Показатели оптического
поглощения
Триптофан (Трп)
Тирозин (Тир)
Трп/Тир
Удельное поглощение
(опт.ед./мл)
280 нм
290 нм
рН6,5
рН 13,0
23,0*10
16,1*10
4,36*10
7,35*10
5,28
2,19
Поглощение в плазме
(верхняя граница нормы)
280 нм
290 нм
рН 6,5
рН 13,0
0,352
0,246
0,079
0,133
4,46
1,85
В результате поглощение ароматических аминокислот в плазме крови в норме на 82 %
состоит из поглощения триптофана (Трп) и лишь на 18 % - из поглощения тирозина (Тир),
то есть известный метод фактически моноспецифичен к содержанию триптофана и триптофановых остатков в пептидах. В предлагаемом способе удельное поглощение Трп и Тир
4
BY 8050 C1 2006.04.30
значительно выравнивается и относительная чувствительность Трп/Тир = 2,19. В плазме
крови вклад Трп в поглощение ароматических аминокислот в предлагаемом способе снижается до 65 %, а вклад Тир повышается до 35 %. Таким образом, в отличие от известного
предлагаемый способ более точно характеризует суммарное содержание ароматических
аминокислотных остатков в пептидах.
Предлагаемый способ осуществляется следующим способом: в пластиковую пробирку
на 1,5 мл последовательно добавляют 0,2 мл плазмы крови и 0,1 мл 24 % трихлоруксусной
кислоты или 1,8 М хлорной кислоты, перемешивают, инкубируют 5 мин и центрифугируют 10-15 мин при 3000 об/мин на центрифуге ОПН-8. Отбирают 0,2 мл супернатанта, добавляют 1,8 мл 0,7 М NaOH (pH смеси = 13,0-13,1) и измеряют оптическую плотность
пробы при 290 нм в 1 см кювете на стандартном спектрофотометре.
Пример 1. Определение олигопептидов в плазме крови здорового донора.
В пластиковую пробирку на 1,5 мл добавляют 0,2 мл плазмы крови здорового донора
и 0,1 мл 24 % трихлоруксусной кислоты или 1,8 М хлорной кислоты, перемешивают, инкубируют 5 мин и центрифугируют 10-15 мин при 3000 об/мин на центрифуге ОПН-8. Отбирают 0,2 мл супернатанта в пластиковую пробирку на 4 мл, добавляют к нему 1,8 мл
0,7 М NaOH, перемешивают и измеряют оптическую плотность пробы (Д1 = 0,120) при
290 нм в 1 см кювете на стандартном спектрофотометре. В контрольной пробе 0,1 мл
24 % трихлоруксусной кислоты или 1,8 М хлорной кислоты добавляют к 1,9 мл 0,7 М
NaOH и измеряют оптическую плотность (Д0 = 0,014) в тех же условиях. Содержание олигопептидов оценивают по разности оптических плотностей Д2 = Д1-Д0 = 0,1200,014 = 0,106.
Пример 2. Определение концентрации олигопептидов в плазме крови больного с синдромом эндогенной интоксикации.
В пластиковую пробирку вносят 0,2 мл плазмы крови больного туберкулезом легких с
синдромом эндогенной интоксикации и осаждают белки с помощью хлорной кислоты
описанным выше способом. В опытной пробе к 0,2 мл супернатанта к 0,2 мл супернатанта
добавляют 1,8 мл 0,7 М NaOH, перемешивают и измеряют оптическую плотность пробы
(Д1 = 0,186) при 290 нм в 1 см кювете на стандартном спектрофотометре. Содержание
олигопептидов оценивают по разности оптических плотностей опытной и контрольной
проб Д2 = Д1-Д0 = 0,186-0,014 = 0,172.
Сопоставление предлагаемого способа со способом-прототипом показало следующие
преимущества.
1. Упрощение анализа.
По сравнению с известным способом (прототип 1 и 2) установлено, что при измерении
показателя Д280, но не показателя Д210, можно исключить операцию второго осаждения
непептидных компонентов с помощью этанола без существенного изменения специфичности анализа.
2. Увеличение чувствительности определения ОП в 1,3 раза.
Для сравнительного анализа чувствительности двух методов определения ОП было
проведено обследование плазмы крови здоровых доноров и больных туберкулезом легких
со 2-3-й степенью эндогенной интоксикации (табл. 4).
Установлено, что при измерении ОП предлагаемым методом УФ-поглощение проб
возрастает в среднем на 20 % по сравнению со способом-прототипом как для здоровых
доноров, так и для больных. Относительное увеличение содержания ОП, или уровень токсемии, совпадал при измерении обоими методами. Собственное поглощение ОП при этом
возрастает на 30 % по сравнению с известным методом за счет снижения вклада непептидных компонентов в суммарное поглощение (табл. 2).
5
BY 8050 C1 2006.04.30
Таблица 4
Показатели оптического поглощения плазмы крови доноров и больных
с эндогенной интоксикацией при измерении известным методом (280 нм, рН 6,5)
и предлагаемым методом (290 нм, рН 13,0)
Обследованная группа
Доноры (n = 5)
Больные (n = 5)
Повышение показателя поглощения по отношению к норме, %
Известный
метод Д1
0,121 ±0,030
0,158 ±0,017
Предлагаемый
метод Д2
0,145 ± 0,034
0,190 ±0,009
130,5
131,0
Отношение
Д2/Д1, %
119,8
120,3
3. Повышение точности измерения ОП.
Точность измерения суммарного содержания ароматических аминокислот характеризовали по отношению удельного поглощения триптофана и тирозина. В известном способе отношение удельного поглощения Трп/Тир = 5,28, то есть практически регистрируется
только поглощение триптофанилов в пептидах. В предлагаемом способе показатель
Трп/Тир = 2,19 и снижается в 2,4 раза, что существенно увеличивает точность измерения
суммарного содержания ароматических аминокислотных остатков в пептидах.
Разработанный способ может быть использован в медицинской диагностике для оценки выраженности токсемии у больных с синдромом эндогенной интоксикации.
Перечень фигур чертежей:
Рисунок. Спектры поглощения супернатанта плазмы крови, полученного после осаждения белков 0,6 М хлорной кислотой, при разных рН (1- рН 7,4; 2 - рН 11,0; 3 - рН 13,0).
Источники информации:
1. Осипович В.К., Туликова З.А., Маркелов И.М. // Лаб. дело. - 1987. - № 3. - С.221-224
(прототип 1).
2. Медицинские лабораторные технологии / Под. ред. А.И.Карпищенко. Т.2. - СПб:
Интермедика, 1999.
3. Габриэлян Н.И., Дмитриев А.А., Кулаков Г.П. // Клин. Медицина. - 1981. № 10. С.38-42.
4. Николайчик В.В., Моин В.М., Кирковский В.В. и др. // Лаб. дело. - 1991. - № 10.
С.13-18 (прототип 2).
5. Лабораторные методы исследования в клинике // Под ред. В.В. Меньшикова. М.:
Медицина, 1987.
6. Шарабчиев Ю.Т., Дубина Т.В. Показатели здоровья в цифрах и фактах. - Минск: УП
"Юпоком", 2001.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
115 Кб
Теги
by8050, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа