close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY8164

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
BY (11) 8164
(13) C1
(19)
(46) 2006.06.30
(12)
7
(51) C 12Q 1/04,
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ УРОГЕНИТАЛЬНЫХ
ИНФЕКЦИЙ CHLAMYDIA TRACHOMATIS, MICOPLASMA
HOMINIS И UREAPLASMA UREALYTICUM В ИССЛЕДУЕМОМ
МАТЕРИАЛЕ
(21) Номер заявки: a 20030984
(22) 2003.10.29
(43) 2005.06.30
(71) Заявитель: Государственное учреждение образования "Белорусская медицинская академия последипломного образования" (BY)
(72) Авторы: Костюк Светлана Андреевна; Хулуп Геннадий Яковлевич (BY)
BY 8164 C1 2006.06.30
G 01N 33/50
(73) Патентообладатель: Государственное
учреждение образования "Белорусская
медицинская академия последипломного образования" (BY)
(56) Барабанов Л.Г. и др. // Здравоохранение. - 1999. - № 2. - С. 5-8.
Козлова В.И. и др. Вирусные, хламидийные и микоплазменные заболевания гениталий. - Санкт-Петербург,
2000. - С. 122-123.
(57)
Способ определения возбудителей урогенитальных инфекций Chlamydia trachomatis,
Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum в исследуемом материале пациента путем
осуществления полимеразной цепной реакции, отличающийся тем, что к 5 мкл исследуемого материала добавляют амплификационную смесь, содержащую 11,9 мкл деионизованной воды, 7,5 мкл реакционной смеси для синтеза ДНК, по 6 пмоль видоспецифических для Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum реагентов и
0,6 мкл фермента Taq-полимеразы, проводят синтез ДНК, электрофоретически разделяют
фрагменты ДНК, сравнивают их с соответствующими контрольными ДНК Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum и при выявлении в исследуемом
материале фрагментов ДНК с молекулярной массой от 35000 до 40000 относительных
единиц, размером 465-475 пар нуклеотидов и интенсивностью свечения 70-90 относительных единиц судят о наличии Chlamydia trachomatis, с молекулярной массой от 75000 до
80000 относительных единиц, размером 950-960 пар нуклеотидов и интенсивностью свечения 110-130 относительных единиц - Mycoplasma hominis и с молекулярной массой от
52000 до 57000 относительных единиц, размером 650-660 пар нуклеотидов и интенсивностью свечения 60-80 относительных единиц - Ureaplasma urealyticum.
Изобретение относится к медицине, к разделу клинической лабораторной диагностики.
Известен способ последовательного определения Chlamydia trachomatis, Mycoplasma
hominis и Ureaplasma urealyticum в исследуемом материале путем осуществления полимеразной цепной реакции, при котором готовят три реакционные пробирки, содержащие исследуемый материал, в каждую из них вносят специфический реагент для синтеза одного
из возбудителей, затем по стандартной методике проводят синтез ДНК и после электро-
BY 8164 C1 2006.06.30
форетического разделения стандартно оценивают размеры фрагментов ДНК возбудителей
путем сравнения с контрольными образцами и судят о наличии или отсутствии возбудителей. Данный способ является прототипом по отношению к заявляемому способу [1].
Общим признаком для заявляемого способа и прототипа является определение Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum в исследуемом материале
путем осуществления полимеразной цепной реакции.
Однако указанный способ обладает следующим недостатком: при последовательном
определении Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum полимеразной цепной реакцией анализ необходимо проводить трехкратно, что увеличивает расход диагностических реагентов и удлиняет время проведения исследований.
Задачей заявляемого способа является одновременное определение всех видов возбудителей в одной биологической пробе.
Поставленная задача достигается следующим способом.
Предложен способ определения возбудителей урогенитальных инфекций Chlamydia
trachomatis, Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum в исследуемом материале пациента путем осуществления полимеразной цепной реакции, когда к 5 мкл исследуемого материала добавляют амплификационную смесь, содержащую 11,9 мкл деионизованной воды, 7,5 мкл реакционной смеси для синтеза ДНК, по 6 пмоль видоспецифических для
Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum реагентов и 0,6 мкл
фермента Taq-полимеразы, проводят синтез ДНК, электрофоретически разделяют фрагменты ДНК, сравнивают их с соответствующими контрольными ДНК Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum и при выявлении в исследуемом материале фрагментов ДНК с молекулярной массой от 35000 до 40000 относительных единиц,
размером 465-475 пар нуклеотидов и интенсивностью свечения 70-90 относительных единиц судят о наличии Chlamydia trachomatis, с молекулярной массой от 75000 до 80000 относительных единиц, размером 950-960 пар нуклеотидов и интенсивностью свечения
110-130 относительных единиц - Mycoplasma hominis и с молекулярной массой от 52000
до 57000 относительных единиц, размером 650-660 пар нуклеотидов и интенсивностью
свечения 60-80 относительных единиц - Ureaplasma urealyticum.
В табл. 1 представлена схема анализа по заявляемому способу.
Поскольку для синтеза ДНК Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis и Ureaplasma
urealyticum используется единая стандартная программа, то внесение в одну реакционную
пробирку компонентов для синтеза ДНК всех возбудителей, не изменяя объем смеси, дает
возможность одновременно определить наличие ДНК всех видов возбудителей, их ассоциаций в одной биологической пробе.
Пример 1
Необходимо установить этиологию инфекционного процесса урогенитального тракта
у пациента А. с клиническим диагнозом -"эндоцервицит, эрозия шейки матки".
Для этого в пробирку № 1 вносят 5 мкл контрольной ДНК Chlamydia trachomatis, в
пробирку № 2 - 5 мкл контрольной ДНК Mycoplasma hominis, в пробирку № 3 - 5 мкл контрольной ДНК Ureaplasma urealyticum, в пробирку № 4 - 5 мкл деионизованной воды,
№ 5 - 5 мкл исследуемого материала. В каждую из пробирок добавляют 20 мкл амплификационной смеси, состоящей из 11,9 мкл деионизованной воды, 7,5 мкл стандартной реакционной смеси для синтеза ДНК, состоящей из 16,6 мМ (NH4)2SO4, 67 mM Tris-HCl
(pH 8,4), 2,5 mМ MgCl2, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, по 2 мМ каждого dNTP (dATP, dGTP,
dCTP, dTTP, пo 6 пмоль видоспецифических реагентов для синтеза ДНК Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum) и 0,6 мкл Taq-полимеразы, после
чего пробирки закрывают и центрифугируют в течение 5 секунд при 4000 оборотах в минуту при + 18-25 °С, затем пробирки переносят в прогретый до + 94 °С программируемый
термостат и проводят синтез ДНК по следующей программе:
2
BY 8164 C1 2006.06.30
+ 93 °С…30 сек.
+ 93 °С…10 сек.
+ 60 °С…10 сек. - 30 циклов
+ 72 °С…10 сек.
+ 72 °С…60 сек.
После этого осуществляют электрофоретическое разделение фрагментов ДНК возбудителей и при получении ДНК по размерам, идентичным размерам ДНК возбудителей
контрольных проб, судят о наличии того или иного возбудителя, а при отсутствии фрагмента ДНК данного размера судят об отсутствии возбудителя.
В табл. 2 представлены молекулярные характеристики контрольных ДНК Chlamydia
trachomatis, Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum, где указаны их молекулярная
масса, размер - число пар нуклеотидов и интенсивность свечения, при этом фрагмент ДНК
Chlamydia trachomatis имеет молекулярную массу от 35000 до 40000 относительных единиц, размер 465-475 пар нуклеотидов и интенсивность свечения 70-90 относительных
единиц; фрагмент ДНК Mycoplasma hominis имеет молекулярную массу от 75000 до 80000,
размер 950-960 пар нуклеотидов и интенсивность свечения 110-130 относительных единиц; фрагмент ДНК Ureaplasma urealyticum имел молекулярную массу от 52000 до 57000
относительных единиц, размер 650-660 пар нуклеотидов и интенсивность свечения 60-80
относительных единиц.
В табл. 3 представлены молекулярные характеристики фрагментов ДНК по заявляемому способу в пробе № 5 от пациента А. с клиническим диагнозом - "эндоцервицит, эрозия шейки матки"; видно, что синтезированные фрагменты ДНК в пробирке № 4 имели
молекулярные характеристики ДНК Chlamydia trachomatis и Ureaplasma urealyticum - молекулярная масса составила 37430,0 о.е. и 54780,0 относительных единиц, размер 470 и
653 пар нуклеотидов и интенсивность свечения 80 и 79 относительных единиц, таким образом, у пациента А. в исследуемом материале выявлена ДНК Chlamydia trachomatis и
Ureaplasma urealyticum.
Пример 2
Необходимо установить этиологию инфекционного процесса урогенитального тракта
у пациента В. с клиническим диагнозом - "хронический неспецифический уретрит".
Аналогичным образом, как в примере 1, определяют молекулярные характеристики
фрагментов ДНК в исследуемом материале у пациента В. с клиническим диагнозом "хронический неспецифический уретрит".
В табл. 3 представлены молекулярные характеристики фрагментов ДНК по заявляемому способу в пробе от пациента В. с клиническим диагнозом - "хронический неспецифический уретрит"; видно, что синтезированные фрагменты ДНК имели молекулярные
характеристики ДНК Mycoplasma hominis; Ureaplasma urealyticum - молекулярная масса
составила 78430,0 относительных единиц и 53460,0 относительных единиц, размер 956 и
652 пар нуклеотидов и интенсивность свечения 126 относительных единиц и 72 относительных единиц, таким образом, у пациента В. в исследуемом материале выявлена ДНК
Mycoplasma hominis; Ureaplasma urealyticum.
Пример 3
Необходимо установить этиологию инфекционного процесса урогенитального тракта
у пациента С. с клиническим диагнозом "эндоцервицит".
Аналогичным образом, как в примере 1, определяют молекулярные характеристики
фрагментов ДНК в исследуемом материале у пациента С. с клиническим диагнозом "эндоцервицит".
В табл. 3 представлены молекулярные характеристики фрагмента молекулы ДНК по
заявляемому способу в пробе от пациента С. с клиническим диагнозом - "эндоцервицит";
видно, что синтезированные фрагменты ДНК имели молекулярные характеристики ДНК
3
BY 8164 C1 2006.06.30
Ureaplasma urealyticum - молекулярная масса составила 56216,0 относительных единиц,
размер 657 пар нуклеотидов и интенсивность свечения 76 относительных единиц, таким
образом, у пациента С. в исследуемом материале выявлена ДНК Ureaplasma urealyticum.
По сравнению с прототипом заявляемый способ позволяет получить следующие преимущества:
позволяет выявить одномоментно весь спектр возбудителей, их ассоциаций у одного
пациента;
сократить расход диагностических реагентов: агарозы, бромистого этидия, ТАЕ-буфера,
расходного материала;
сократить время проведения определения возбудителей в биологической пробе у одного пациента.
Источники информации:
1. Применение метода полимеразной цепной реакции для выявления хламидийной,
микоплазменной и уреаплазменной инфекций в акушерско-гинекологической практике:
Методические рекомендации. - М., 1996. - прототип.
Таблица 1
Способ определения возбудителей урогенитальных инфекций
Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum
и их ассоциаций в исследуемом материале полимеразной цепной реакции
(заявляемый способ)
Пробирки №
1-3
4, 5, 6
7
Реагенты
1. ДНК возбудителей
5 мкл
2. Вода деионизованная
11,9 мкл
11,9 мкл
16,9 мкл
3. Реакционной смеси
7,5 мкл
7,5 мкл
7,5 мкл
4. Taq-полимеразы
0,6 мкл
0,6 мкл
0,6 мкл
5. Пробирки закрыть и отцентрифугировать в течение 5 секунд при 4000 оборотах в минуту при температуре + 18-25 °С.
6. Перенести пробирки в прогретый до + 94 °С программируемый термостат и провести
синтез ДНК по специальной программе:
+ 93 °С…30 сек.
+ 93 °С…10 сек.
+ 60 °С…10 сек. - 30 циклов
+ 72 °С…10 сек.
+ 72 °С…60 сек.
7. Провести электрофоретическое разделение ПЦР-амплифицированной смеси на окрашенном бромистым этидием агарозном геле.
8. Наличие фрагментов специфических ДНК возбудителей визиолизировать с помощью
ультрафиолетового подсвечивания в транслюминаторе.
9. Определить молекулярную массу, число пар нуклеотидов и интенсивность свечения
исследуемых фрагментов молекулы ДНК в исследуемых пробах и сравнить с молекулярными характеристиками контрольных образцов ДНК Chlamydia trachomatis, Mycoplasma
hominis и Ureaplasma urealyticum.
4
BY 8164 C1 2006.06.30
Таблица 2
Молекулярные характеристики контрольных ДНК Chlamydia trachomatis,
Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum - молекулярная масса,
размер - число пар нуклеотидов и интенсивность свечения
Полосы фрагментов ДНК
микроор.
молекулярная масса
число пар нуклеотидов
интенсивность свечения
Интерпретация
ДНК
К+
КChlamydia trachomatis
от 35000 до
+
40000 о.е.
+
465-475
+
70-90 о.е.
Присутствие
Методика аналиChlamydia traза соблюдена
chomatis
ДНК
ДНК
Mycoplasma Ureaplasma
hominis
urealyticum
от 75000 до от 52000 до
80000 о.е.
57000 о.е.
950-960
650-660
110-130 о.е.
60-80 о.е.
Присутствие Присутствие
Mycoplasma Ureaplasma
hominis
urealyticum
Таблица 3
Молекулярные характеристики фрагментов ДНК в исследуемых пробах пациента
А., пациента В., пациента С. - молекулярная масса, размер - число пар нуклеотидов
и интенсивность свечения
Характеристики
фрагмента ДНК
Количество н.п.
Проба пациента А.
Проба 2 пациента В. Проба 3 пациента С.
470; 653
956; 652
37430,0 о.е.
78430,0 о. е.
Молекулярная масса
54780,0 о.е.
53460,0 о.е.
79 о.е.
126 о.е
Интенсивность свечения
80 о.е.
72 о.е.
Присутствие ChlaПрисутствие Mymydia trachomatis;
coplasma hominis;
Интерпретация
Ureaplasma urealyti- Ureaplasma urealyticum
cum
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
5
657
56216,0 о.е.
76 о.е.
Присутствие Ureaplasma urealyticum
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
104 Кб
Теги
by8164, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа