close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY8301

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
BY (11) 8301
(13) C1
(19)
(46) 2006.08.30
(12)
7
(51) C 12N 5/06
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НЕРВНОЙ ТКАНИ И НЕРВНЫХ
КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ
(21) Номер заявки: a 20031061
(22) 2003.11.19
(43) 2005.06.30
(71) Заявитель: Государственное научное
учреждение "Институт физиологии
Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Жук Ольга Николаевна; Никандров Виталий Николаевич (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт физиологии Национальной академии наук
Беларуси" (BY)
(56) Руководство по культивированию нервной ткани. - М.: Наука, 1988. - С. 37-42.
RU 2084523 С1, 1997.
RU 2164240 C2, 2001.
RU 2194753 C2, 2002.
RU 2126832 С1, 1999.
SU 1732516 A1, 1995.
WO 00/26353 A1.
BY 8301 C1 2006.08.30
(57)
Способ культивирования нервной ткани и нервных клеток млекопитающих, включающий использование синтетической питательной среды с добавлением фетальной телячьей сыворотки, отличающийся тем, что фетальную телячью сыворотку добавляют до
концентрации 0,05 % и дополнительно в среду добавляют плазминоген до концентрации
(10-8-10-7) М.
Изобретение относится к медицине и биологии, в частности к культивированию нервной ткани и нервных клеток млекопитающих. Известен способ культивирования нервной
ткани и нервных клеток млекопитающих как для общебиологических исследований, так и
для практического применения, в частности нейротрансплантации, заключающийся в том,
что в синтетическую питательную среду добавляют сыворотку крови и культивируют в
ней требуемую органотипическую или диссоциированную культуру [1].
Указанный способ является прототипом по отношению к заявляемому.
Общим признаком для заявляемого способа и прототипа является культивирование
нервной ткани и нервных клеток млекопитающих путем использования синтетической питательной среды и добавления к ней биологически активной субстанции. Однако, недостатком прототипа является то, что для успешного культивирования нервной ткани синтетические среды требуют добавки биологически активных веществ. Применяемые для
получения зрелых культур в качестве добавки сыворотка крови фетальных телят и сыворотка крови лошадей по отдельности или в комбинации позволяют получить зрелую,
дифференцированную культуру нервной ткани и ее клеточных компонентов только через
10-14 суток культивирования.
Задачей заявляемого способа является ускорение дифференциации и созревания культивируемых нервных клеток. Поставленная задача достигается следующим образом.
BY 8301 C1 2006.08.30
Предложен способ культивирования нервной ткани и нервных клеток млекопитающих,
включающий использование синтетической питательной среды с добавлением фетальной
телячьей сыворотки, при этом фетальную телячью сыворотку добавляют до концентрации
0,05 % и дополнительно в среду добавляют плазминоген до концентрации (10-8-10-7) M.
Плазминоген представляет собой гликопротеин массой 85 кДа. Наиболее известна его
функция в процессе фибринолиза. Кроме этого, плазминоген обнаружен в нервной ткани,
где показан его синтез клетками микроглии [2].
Введение его в питательную среду позволяет ускорить формирование зоны роста органотипической культуры нервной ткани.
Пример 1.
Органная культура.
Неокортекс и мозжечок новорожденных крыс освобождают от оболочек, разделяют на
фрагменты размером около 1 мм3, которые располагают на покровные стекла с коллагеновой подложкой и помещают в пластиковые чашки Петри диаметром 3,5 см. В контрольную питательную среду дополнительно вносят 25 % фетальной телячьей сыворотки, а в
экспериментальную - 0,05 % такой же сыворотки и Pg (10-8-10-7) M, полученного из плазмы крови человека. Все культуры помещают в инкубатор при 37 °С и 5 % содержанием
СО2. Рост и морфологию клеток учитывают на инвертированном микроскопе. С помощью
окуляр-микрометра определяют индекс площади (ИП), который рассчитывают в условных
единицах как соотношение площади всего эксплантата вместе с зоной роста, формируемой регенерирующими отростками и выселяющимися клетками, к исходной площади эксплантата [3-Чалисова, 2000]. Значения ИП выражают в процентах, ИП контрольных эксплантатов принимают за 100 %. Достоверность различий ИП контроля и эксперимента
оценивают с помощью t-критерия Стьюдента.
При добавлении 25 % сыворотки на первые сутки культивирования в органотипических культурах происходит прикрепление эксплантатов к коллагеновой подложке и их
распластывание, а на 2-3 сутки - вырост тонких немиелинизированных аксонов по периферии эксплантата, дающий начало формированию зоны роста. К концу 3-х суток культивирования в зоне роста происходит миграция фибробластов, клеток нейроглии. ИП контрольных эксплантатов неокортекса составил 1,62 ± 0,08 (n = 20), а мозжечка -1,52 ± 0,04
(n = 18).
При добавлении в питательную среду, содержащую 0,5 % указанной сыворотки, (10-810-7) M Pg к исходу 3-х суток отмечено значительное увеличение количества и длины отростков, а также их арборизации. Зона роста уплотнялась как в результате указанных процессов, так и за счет миграции из эксплантатов глиальных клеток, макрофагов и немногочисленных нейронов. ИП культур неокортекса равнялся 2,41 ± 0,08 (n = 16), a мозжечка 2,40 ± 0,1 (n = 19). Различия размеров формируемой зоны роста, выраженные через ИП,
составляют для органных культур неокортекса и мозжечка 49 % (Р < 0,001) и 57 %
(Р < 0,001), соответственно. Это указывает на стимуляцию плазминогеном генерации отростков и миграции клеток в исследуемых культурах.
Пример 2.
Диссоциированная культура.
Суспензию диссоциированных клеток неокортекса готовят по общепринятой методике
с использованием раствора трипсина в конечной концентрации 0,1 %. Посев производят в
пластиковые матрасики (3,5 млн клеток в 5 мл питательной среды). Культивирование проводят в питательной среде DMEM с добавлением гентамицина. В контрольную питательную среду дополнительно вносят 25 % фетальной телячьей сыворотки, а в экспериментальную - 0,05 % такой же сыворотки и Pg (10-8-10-7) M, полученного из плазмы крови
человека. Все культуры помещают в инкубатор с температурным режимом 37 °С и 5 %
содержанием СО2. Исследуют на инвертированном микроскопе. Определяют процентное
отношение прикрепленных клеток, а также клеток, генерирующих отростки.
2
BY 8301 C1 2006.08.30
3 сутки культивирования: прикрепляемость клеток культур с добавлением 25 % фетальной телячьей сыворотки - 80 %, отростки появляются у единичных клеток. В культурах, в питательную среду которых добавлен Pg (10-8-10-7) M, прикрепляемость составила
87 %, отростки появляются у большинства клеток. Это свидетельствует о повышении регенеративных процессов и созреваемости клеток.
Таким образом, по сравнению с прототипом, заявляемый способ обладает следующими преимуществами: позволяет на 2-3 суток ускорить дифференцировку и созревание клеток. С учетом того, что плазминоген не обладает выраженной видовой специфичностью и
его возможно получить из крови человека, данный способ может найти широкое применение в практической трансплантологии.
Источники информации:
1. Руководство по культивированию нервной ткани. - M., 1988. - С. 37-42 (прототип).
2. Чалисова Н.И., Мелькишев В.Ф., Акоев Г.Н., Людыно M.И., Куренкова Т.Ю. Стимулирующее влияние пролактина на рост нейритов чувствительных нейронов в органотипической культуре // Цитология. - 1991. - Т. 33. - № 2. - С. 29-31.
3. Nakajiama K., Tsuzaki K., Nagata K., Takemoto N., Kohsacka S. Production and secretion of plasminogen in cultuted rat brain microglia // FEBS Lett. - 1992. - Vol. 308. - P. 179-182.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
3
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
74 Кб
Теги
by8301, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа