close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY8416

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
BY (11) 8416
(13) C1
(19)
(46) 2006.08.30
(12)
7
(51) C 12N 9/16
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ФОСФОЛИПАЗЫ А2
BY 8416 C1 2006.08.30
(21) Номер заявки: a 20001171
(22) 2000.12.27
(43) 2002.06.30
(71) Заявитель: Государственное научное
учреждение "Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(72) Автор: Литвинко Наталья Михайловна (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(56) Литвинко Н.М. и др. Прикладная биохимия и микробиология. - 1996. - Т. 32. № 6. - С. 650-655.
WO 89/09818 A1.
JP 2-286081 A, 1990.
JP 8-298986 A, 1996.
EP 0476849 B1, 1997.
US 5045462, 1991.
SU 1188948 A1, 1990.
(57)
1. Способ выделения фосфолипазы А2 из поджелудочной железы свиньи, включающий первичную обработку исходного сырья путем гомогенизации, автолиза и центрифугирования гомогената с последующими обработкой надосадочной жидкости сульфатом
аммония, отделением осадка, растворением его в воде при нагревании, смешивание полученного водного раствора с раствором лецитина в толуоле при pH 4,6-4,8, экстракцию целевого продукта из органической фазы слабощелочным водным раствором и его хроматографию на биогеле, а затем на карбоксиметилцеллюлозе.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что экстракцию проводят раствором бикарбоната аммония при pH 7,8-8,0.
Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу
выделения фермента фосфолипазы А2, который находит применение для получения биоактивных продуктов гидролиза - лизофосфолипидов и жирных кислот.
Фосфолипаза А2 (далее ФЛ А2) осуществляет гидролиз сложноэфирной связи во втором положении глицеринового скелета молекулы фосфоглицеридов, и благодаря этому
изменение активности ФЛ А2 может служить критерием при диагностике таких болезней
человека, как ишемия миокарда, гипоксия, воспалительные процессы, аллергия, тромбообразование, отеки при радиационном поражении и др.
Процесс выделения ФЛ А2 в активном состоянии из биологических объектов, которыми являются ткани и биологические жидкости человека и животных, весьма трудоемок и
многостадиен [1].
Известен (прототип) способ выделения фосфолипазы А2 из поджелудочной железы
свиньи, включающий предварительную обработку поджелудочной железы свиньи с по-
BY 8416 C1 2006.08.30
следующим промыванием после центрифугирования осадка насыщенным раствором
сульфата аммония [2].
Однако целевой продукт выделяется в виде трудноразделимого комплекса фермента с
фрагментами денатурированной ДНК, который обладает несвойственными для гомогенного белка характеристиками.
Задачей настоящего изобретения является разработка препаративного способа выделения фермента фосфолипазы А2 из биологического сырья с сохранением его каталитических свойств.
Поставленная задача решается предлагаемым способом выделения фосфолипазы А2 из
поджелудочной железы свиньи путем аффинной сорбции ФЛ А2 на летицине, находящемся в растворе толуола.
Заявляемый способ заключается в первичной обработке поджелудочной железы свиньи путем гомогенизации, автолиза и центрифугирования гомогената с последующими
обработкой надосадочной жидкости сульфатом аммония, отделением осадка, растворением его в воде при нагревании, смешивании полученного водного раствора с раствором лецитина в толуоле при pH 4,6-4,8, экстракции целевого продукта из органической фазы слабощелочным водным раствором и его хроматографии на биогеле, а затем на карбоксиметилцеллюлозе, экстракцию проводят раствором бикарбоната аммония при pH 7,8-8,0.
Лецитин является специфическим субстратом ФЛ А2, активность которой проявляется
только в присутствии ионов кальция. Однако в связи с тем, что образование ферментсубстратного комплекса происходит и в отсутствие этого кофактора, появляется возможность использовать субстрат, помещенный в не смешивающийся с водой органический
растворитель, в качестве жидкофазного сорбента для экстракции ФЛ А2 из смесей. Чтобы
исключить взаимодействие между ФЛ А2 и нуклеиновой кислотой, сорбцию фермента на
субстрате проводили предпочтительно при pH 4,7.
Таким образом, разработан метод выделения ФЛ А2 из гомогената поджелудочной
железы путем сорбции на лецитине в отсутствие кофактора с использованием сродства
фермента к субстрату и гидрофобных свойств субстрата, благодаря которым, будучи помещенным в не смешивающийся с водой органический растворитель, он может выступать
в качестве жидкофазного сорбента.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения, не
ограничивающими объема изобретения.
Пример 1
1. Первичная обработка исходного материала.
Поджелудочную железу свиньи хранят 2 недели при температуре -15 °С для увеличения исходной активности фермента, затем обезжиривают механическим способом. 1000 г
железы измельчают при помощи мясорубки и гомогенизируют по частям с 3000 мл раствора 0,15 М хлористого натрия, предварительно охлажденного до температуры +4 °С в
микроразмельчителе тканей типа РТ-2. Гомогенат подвергают автолизу в присутствии 30 мг
трипсина в течение 18 час при температуре +4 °С. Гомогенат центрифугируют 30 мин при
4000 об/мин при температуре 0 °С на центрифуге Janetzki K-70 с использованием углового
ротора. Надосадочную жидкость обрабатывают порошком сухого сульфата аммония до
тех пор, пока не достигалось 40 % насыщения. Смесь взбалтывают на качалке в течение
1 час с последующим центрифугированием 30 мин при 4000 об/мин и температуре 0 °С на
центрифуге Janetzki K-70. Надосадочную жидкость обрабатывают порошком сухого сульфата аммония до тех пор, пока не достигалось 70 % насыщения, после чего смесь снова
взбалтывают на качалке в течение 1 час с последующим центрифугированием на центрифуге Janetzki К-23 в течение 50 мин при 6000 об/мин, температуре 0 °С. Полученный осадок (УФ-спектр растворенного в 0,75 М NaCl осадка имел максимум при λ = 270 нм и ми2
BY 8416 C1 2006.08.30
нимум при λ = 253 нм, Емакс/Емин = 1,05) промывают насыщенным раствором сульфата аммония. При этом УФ-спектр промывной жидкости после трех промываний имел максимум
при λ = 260 нм и минимум при λ = 235 нм, а осадок, растворенный в 0,75 М NaCl, имел
УФ-спектр с максимумом при λ = 278 нм и минимумом при λ = 253 нм. Осадок, полученный после промывания тремя литрами насыщенного раствора сульфата аммония (70 %),
растворяют в 1 л дистиллированной воды (УФ-спектр имел максимум при λ = 278 нм и
минимум при λ = 253 нм, Емакс/Емин = 1,6) и проводят термообработку в течение 10 мин в
термостате после достижения t = 70 °С, pH 4,0. Далее раствор охлаждают и хранят при
t = +4 °С в течение 20 час, полученный осадок отделяют на бумажном фильтре, а надосадочную жидкость помещают упариваться над щелочью, после чего подвергают лиофилизации.
2. Сорбция ФЛ А2 на лецитине, находящемся в толуоле.
Раствор лиофилизованного порошка, полученного из поджелудочной железы после
первичной обработки (300 мг на 30 мл, pH 4,7), смешивают с толуольным раствором лецитина (100 мг в 15 мл толуола), затем смесь взбалтывают в течение 60 мин, помещают в
делительную воронку и оставляют для разделения на ночь при t = + 4 °С. После разделения образовалось три слоя: верхний - толуольный (содержал 20 % от начальной активности), средний (содержал 50 % от начальной активности), нижний - водный (содержал 30 %
от начальной активности). Слои разделяют и проводят экстракцию фермента из верхнего
и среднего слоя слабощелочным раствором.
2.1. Обработка толуольного слоя.
Для экстракции фермента к верхнему слою приливают 20 мл 1 % раствора бикарбоната аммония (pH 7,9), взбалтывают 15 мин на качалке и оставляют для разделения. Получают два слоя: верхний - толуольный и нижний - водный ("смыв"), где предположительно
должен находиться фермент. С толуольным слоем повторяют процедуру с промыванием
15 мл 1 % раствора бикарбоната аммония (pH 7,9). Полученный второй "смыв" объединяют с предыдущим и отфильтровывают, доводят pH 1 М соляной кислотой до 4,4 и выдерживают в вакуум-эксикаторе над щелочью и парафином для удаления большей части воды
и остатков толуола. Концентрат (2 мл, pH 8,0) фракционируют на колонке с биогелем Р-4,
уравновешенной с 1 % бикарбонатом аммония. Из трех образовавшихся при разделении
пиков ферментативная активность была обнаружена только в первом - "А". Активные
фракции объединяют и проводят хроматографию на карбоксиметилцеллюлозе. В результате
такой обработки получают препарат фермента (Р-1). Однако характеристики УФ-спектра
Р-1 не были удовлетворительными: минимум при λ = 253 нм и максимум при λ = 278 нм
не были выражены. Электрофорез в полиакриламидном геле показал наличие одной широкой и одной узкой полосы.
2.2. Обработка среднего слоя.
Для экстракции фермента к среднему слою приливают 20 мл 1 % раствора бикарбоната аммония (pH 7,9), взбалтывают 15 мин на качалке и оставляют для разделения. Нижний
водный слой отделяют фильтрованием, вдвое упаривают в вакуум-эксикаторе над щелочью и фракционируют на колонке с биогелем Р-4, уравновешенной с 1 % бикарбонатом
аммония. Из пяти образовавшихся при разделении пиков два обладают ферментативной
активностью. Активные фракции в пределах каждого пика объединяют и проводят хроматографию каждого пика раздельно на карбоксиметилцеллюлозе. В результате разделения
фракций пика "А" получают препарат фермента (Р-2), обладающий высокой ферментативной активностью, УФ-спектр которого имеет удовлетворительные характеристики.
Физико-химические характеристики полученного препарата представлены в таблице.
3
BY 8416 C1 2006.08.30
Молекулярная масса, кД Содержание основных аминокислот, нмоль
12,2 ± 0,5
Asp (30,0); Thr(4,5); Ser(8,95); Glu(62,2); Pro(3,5); Gly(16,3);
Ala(9,62); 1/2Cys(3,6); Val(9,3); Ile(2,4); Leu(3,0); Tyr(0,3);
Phe(1,0); Lys(2,4); His(2,0)
Источники информации:
1. Литвинко Н.М., Кисель М.А. Эндогенные фософолипазы А2. Структура и функция.
Мн., 1991.
2. Литвинко Н.М., Дрожденюк А.П. Комплексообразование фосфолипазы А2 с фрагментами нуклеиновых кислот и способы его устранения // Прикладная биохимия и микробиология. - 1996. - Т. 32. - № 6. - С. 650-655 (прототип).
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
4
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
79 Кб
Теги
by8416, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа