close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY9080

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
BY (11) 9080
(13) C1
(19)
(46) 2007.04.30
(12)
7
(51) G 01N 33/531
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА 24 кДа
ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА
(21) Номер заявки: a 20031078
(22) 2003.11.24
(43) 2005.06.30
(71) Заявитель: Государственное учреждение "Республиканский научнопрактический центр гигиены" (BY)
(72) Авторы: Яковлева Людмила Федоровна; Соколов Сергей Михайлович; Федорович Сергей Владимирович; Лысенко Александр Павлович;
Максименко Алла Анатольевна (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
учреждение "Республиканский научно-практический центр гигиены" (BY)
(56) FIFIS T. et al. Infection and Immunity. 1991. - Vol.59. - No.3. - P. 800-807.
RU 2118538 С1, 1998.
RU 2143280 С1, 1999.
RU 2035914 С1, 1995.
BY 9080 C1 2007.04.30
(57)
Способ получения антигена 24 кДа для иммуноферментной диагностики туберкулеза,
включающий осаждение и фракционирование антигена из культурального фильтрата Mycobacterium tuberculosis или Mycobacterium bovis, отличающийся тем, что культуральный
фильтрат, содержащий 3 % фенола, выдерживают при температуре 2-8 °С до выпадения
осадка легкокристаллизующихся антигенов, осадок растворяют в веронал-мединаловом
буфере рН 8,6, обрабатывают в течение 25-30 мин ультразвуком с частотой 15-35 кГц
мощностью 100 Вт/см2, очищают гель-фильтрацией и отбирают фракции, содержащие антиген 24 кДа.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности медицинской и ветеринарной
иммунологии и лабораторной диагностике.
Известен способ получения антигена, характерного для возбудителей туберкулеза
бычьего и человеческого вида и не встречающегося у атипичных микобактерий, заключающийся в выделении из культурального фильтрата возбудителя туберкулеза антигена
путем осаждения белков сульфатом аммония в 75 % насыщении, диализа для удаления
солей, хроматофокусировании на МоnоР колонке, аффинной хроматографии на сефарозе с
Конканавалином А и гель-фильтрации на Биогеле Р100 [1]. Указанный способ является
прототипом к заявляемому.
Общими признаками для заявляемого способа и прототипа являются использование
культурального фильтрата в качестве исходного материала, осаждение фракции, содержащей целевой продукт.
Однако способ-прототип обладает недостаточно высокой специфической активностью, в силу которой возникают проблемы с частичной денатурацией и снижением активности микобактериальных антигенов.
BY 9080 C1 2007.04.30
Задачей заявляемого способа является повышение видоспецифичности указанного антигена.
Поставленная задача достигается путем того, что предложен способ получения антигена 24 кДа для иммуноферментной диагностики туберкулеза, включающий осаждение и
фракционирование антигена из культурального фильтрата Mycobacterium tuberculosis или
Mycobacterium bovis, когда культуральный фильтрат, содержащий 3 % фенола, выдерживают при температуре 2-80 °С до выпадения осадка легкокристаллизующихся антигенов,
осадок растворяют в веронал-мединаловом буфере рН 8,6, обрабатывают в течение 2530 мин ультразвуком с частотой 15-35 кГц мощностью 100 Вт/см2, очищают гельфильтрацией и отбирают фракции, содержащие антиген 24 кДа.
Пример.
Штаммы Mycobacterium tuberculosis H37Rv, Mycobacterium bovis Vallee, Mycobacterium
bovis 8 выращивают на среде Сотона в течение 8 недель при 370 °С, инактивируют внесением в посевы фенола до конечной концентрации 3 %. Бактериальную массу удаляют центрифугированием при 3000 g, 20 мин, культуральную жидкость пропускают через
стерилизующий фильтр. По 500 мл культуральных фильтратов помещают в холодильник с
температурой +2...+ 80 °С до выпадения легкого осадка, который обрабатывают ультразвуком 15-35 кгц в течение 15-20 мин, центрифугируют 5-7 мин при 500G. Полученный
осадок удаляют, а надосадочную культуральную жидкость повторно центрифугируют и
обрабатывают ультразвуком.
Полученные антигенные фракции дополнительно очищают гель-фильтрацией на колонке LKB 2137 (2,6×65 см) с ультрогелем АсА 54, откалиброванной по элюции белков с
известной молекулярной массой. Скорость элюции поддерживают на уровне 3,5-3,8 см/ч.
Оптическую плотность элюатов определяют на проточном спетрофотометре Uvicord S-2
при 267 нм.
Специфичность фракций исследуют в ИФА (табл. 1, степень очистки определяют в
перекрестном иммуноэлектрофорезе с промежуточным гелем).
Таблица 1
Фракции культурального фильтрата М. tuberculosis H37Rv
Исходные антигенные фракции
Очищенные антигенные фракции
М. tuberculosis H37Rv
М. tuberculosis H37Rv
Разведения анантисыворотка к ан- антисыворотка антисыворотка к антисыворотка
тисывороток
тигенам атипичных M. tuberculosis антигенам атипич- к М. tuberculoмикобактерий
H37Rv
ных микобактерий
sis H37Rv
х
х
х
х
1:200
2,3
2,5
1,7
2,4
1:400
2,3
2,6
1,8
2,3
1:800
2,0
2,2
1,5
2,8
1:1600
2,0
2,3
1,2
2,0
М±m
2,15 ± 0,07
2,4±0,07
1,55±0,11
1,93 ± 0,14
ИСА
1,12
1,3
Примечание х- отношение оптической плотности (ОП) с антисыворотками к антигенам
атипичных микобактерий или к возбудителю туберкулеза к ОП нормальной сыворотки
крови.
ИСА - индекс специфической активности, показывающий отношение среднего превышения ОП с антисывороткой к среднему превышению ОП с антисывороткой к смеси
антигенов атипичных микобактерий; курсивом показаны отрицательные реакции.
Как видно из табл. 1, очищенные фракции культуральных фильтратов штаммов
М. tuberculosis H37Rv практически не реагируют в иммуноферментном анализе, т.е. не
вступают в реакции с антисывороткой к смеси антигенов атипичных микобактерий (пре2
BY 9080 C1 2007.04.30
вышение ОП в сравнении с нормальной сывороткой менее 2,0) и достаточно интенсивно
реагируют с гомологичными антисыворотками.
Таблица 2
Показатели перекрестной и специфической активности в ИФА элюатов фракции
M.bovis Vallee, полученных при гель-фильтрации на ультрогеле АсА 54
ИсходНомера элюатов с ультрогеля АсА 54 фракции M.bovis Vallee,
ный
выпадавшей в осадок с 3 % фенола, и показатели перекрестной
Покакультуспецифической активности
затель
ральный
10
13
17
18
20
21
25
28
фильтрат
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
ИПАx
5,8
1,8
2,8
2,0
1,6
1,7
1,2
1,3
1,5
x
ИСА
1,2
2,5
1,0
1,1
2,6
3,9
5,2
2,1
1,5
1,2
х
- ИПА - индекс перекрестной активности, ИСА - индекс специфической активности;
ИПА = (средний показатель ОП с антисывороткой к антигенам атипичных микобактерий):(ОП нормальной сыворотки);
ИСА = (средний показатель с антисывороткой к антигенам возбудителя туберкулеза):(средний показатель ОП с антисывороткой к антигенам атипичных микобактерий).
Как видно из таблицы 2, элюаты № 17-21 не реагируют в ИФА (в разведениях 1:100 и
выше) с антисывороткой к антигенам атипичных микобактерий (ИПА ниже 2,0), но дают
выраженные реакции с гомологичной антисывороткой (ИСА больше 2,0).
Анализ антигенной нагрузки показывает, что в диапазоне фракций № 17-21 с колонки
элюируется только иммунохимически чистый антиген со средней массой 24 кДА.
Аналогичным образом получают антигены штаммов М. tuberculosis H37Rv.
Таким образом, по сравнению с прототипом заявляемый способ обладает следующими
преимуществами: позволяет получать активный и высокоспецифичный антиген, пригодный для иммуноферментной диагностики туберкулеза, существенно упростить его получение.
Источники информации:
1. Adams L.G. In vivo and in vitro diagnosis of Mycobacterium bovis infection // Rev. sci.
tech. Off. int. Epiz. - 2001, 20 (1). - P. 304-324 (прототип).
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
3
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
82 Кб
Теги
патент, by9080
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа