close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY9321

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2007.06.30
(12)
(51)7 C 07K 7/23,
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
BY (11) 9321
(13) C1
(19)
A 61K 38/09,
A 61P 35/00
АНТАГОНИСТЫ LHRH, ИХ ПОЛУЧЕНИЕ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ
В КАЧЕСТВЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
(21) Номер заявки: a 20020811
(22) 2001.03.12
(31) 09/525,007 (32) 2000.03.14 (33) US
(85) 2002.10.14
(86) PCT/EP01/02719, 2001.03.12
(87) WO 01/68676, 2001.09.20
(43) 2003.03.30
(71) Заявитель: ЗЕНТАРИС ГМБХ (DE)
(72) Авторы: БЕРНД, Майкл; КУЧЕР, Бернхард; ГЮНТЕР, Экхард; РОМАЙС,
Петер; РАЙССМАНН, Томас; БЕКЕРС, Томас (DE)
(73) Патентообладатель: ЗЕНТАРИС ГМБХ
(DE)
(56) RU 2123499 C1, 1998.
RU 2074191 C1, 1997.
RU 2130464 C1, 1999.
WO 97/19953 A2.
WO 89/07450 A1.
(57)
1. Соединения, обладающие антагонистической активностью в отношении LHRH, общей формулы I:
BY 9321 C1 2007.06.30
А-Ххх1-Ххх2-Ххх3-Ххх4-Ххх5-Ххх6-Ххх7-Ххх8-Ххх9-Ххх10-NH2,
(I)
где А - ацетильная группа;
Ххх1 - D-Nal(2);
Ххх2 - D-Cpa;
Ххх3 - D-Pal(3);
Ххх4 - Ser;
Ххх5 - N-Me-Tyr;
Ххх6 - D-Cit, D-Hci или D-Lys(B), где D-Lys(B) представляет собой D-[ε-N'-4-(4амидинофелин)амино-1,4-диоксобутил]-Lys;
Ххх7 - Leu или Nle;
Ххх8 - Arg или Lys(iPr);
Ххх9 - Pro и
Ххх10 - D-Ala или Sar,
или их соли с фармацевтически приемлемыми кислотами, при условии, что если Ххх6 - DLys(B), то Ххх7 - Nle, если Ххх6 - D-Cit, то Ххх7 - Nle и Ххх10 - D-Ala, или если Ххх6 - D-Hci,
то Ххх7 - Leu и Ххх10 - D-Ala.
2. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что представляет собой
Ac-D-Nal(2)-D-Cpa-D-Pal(3)-Ser-N-Me-Tyr-D-Lys(B)-Nle-Arg-Pro-Sar-NH2 или его соль с
фармацевтически приемлемой кислотой.
3. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что представляет собой
Ac-D-Nal(2)-D-Cpa-D-Pal(3)-Ser-N-Me-Tyr-D-Lys(B)-Nle-Arg-Pro-D-Ala-NH2 или его соль
с фармацевтически приемлемой кислотой.
BY 9321 C1 2007.06.30
4. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что представляет собой
Ac-D-Nal(2)-D-Cpa-D-Pal(3)-Ser-N-Me-Tyr-D-Lys(B)-Nle-Lys(iPr)-Pro-Sar-NH2 или его соль
с фармацевтически приемлемой кислотой.
5. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что представляет собой
Ac-D-Nal(2)-D-Cpa-D-Pal(3)-Ser-N-Me-Tyr-D-Lys(B)-Nle-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2 или его
соль с фармацевтически приемлемой кислотой.
6. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что представляет собой
Ac-D-Nal(2)-D-Cpa-D-Pal(3)-Ser-N-Me-Tyr-D-Cit-Nle-Arg-Pro-D-Ala-NH2 или его соль с
фармацевтически приемлемой кислотой.
7. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что представляет собой
Ac-D-Nal(2)-D-Cpa-D-Pal(3)-Ser-N-Me-Tyr-D-Hci-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 или его соль с
фармацевтически приемлемой кислотой.
8. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что представляет собой
Ac-D-Nal(2)-D-Cpa-D-Pal(3)-Ser-N-Me-Tyr-D-Cit-Nle-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2 или его соль
с фармацевтически приемлемой кислотой.
9. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что представляет собой
Ac-D-Nal(2)-D-Cpa-D-Pal(3)-Ser-N-Me-Tyr-D-Hci-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2 или его соль
с фармацевтически приемлемой кислотой.
10. Соединение по любому из пп. 1-9, отличающееся тем, что соль представляет собой ацетат, трифторацетат или эмбонат.
11. Фармацевтическая композиция, обладающая антагонистической активностью в отношении LHRH, содержащая, по крайней мере, одно соединение по любому из пп. 1-10 в
терапевтически эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель.
12. Способ получения соединения по любому из пп. 1-9, заключающийся в том, что
последовательность аминокислотных остатков, состоящую из Хххm с соответствующими
защитными группами, где m означает целое число от 1 до 10 и Ххх1 ацетилирован, синтезируют на твердом носителе или в растворе, затем конденсируют на носителе и отщепляют от твердого носителя путем амидирования по остатку Ххх10.
13. Способ получения фармацевтической композиции по п. 11, заключающийся в том,
что, по крайней мере, одно соединение по любому из пп. 1-10 смешивают с фармацевтически приемлемым носителем и суспендируют или лиофилизируют.
14. Способ лечения млекопитающих, включая человека, больных гормонозависимыми
опухолями, в частности карциномой предстательной железы, раком молочной железы или
миомой матки, или незлокачественными заболеваниями, при лечении которых требуется
подавление LHRH, в частности эндомитриозом, доброкачественной гиперплазией предстательной железы или бесплодием у женщин или мужчин, заключающийся в том, что
млекопитающему вводят терапевтически эффективное количество, по крайней мере, одного соединения по любому из пп. 1-10.
Изобретение относится к антагонистам LHRH с улучшенной растворимостью, способам
получения этих соединений, лекарственным средствам, в которых содержатся указанные
соединения, а также к применению лекарственного средства при лечении гормонзависимых опухолей и незлокачественных гормонзависимых заболеваний, таких как доброкачественная гиперплазия простаты (ВРН) и эндометриоз. Номенклатура, используемая при
описании пептидов, совпадает с номенклатурой, которая вошла в состав Биохимической
Номенклатуры, утвержденной комиссией ИЮПАК-ИЮБ (European J. Biochem. (1984), т.
138, стр. 9-37), в соответствии с которой является общепринятым, что N-концевая аминогруппа располагается слева, а С-концевая карбоксильная группа располагается справа.
Антагонисты LHRH, также как и пептиды по настоящему изобретению, включают в себя
как природные, так и синтетические аминокислоты, причем первые включают Ala, Val,
Leu, lle, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp и His. Сокращенные
2
BY 9321 C1 2007.06.30
названия отдельных аминокислотных остатков основаны на тривиальных названиях аминокислот, например Ala = аланин, Arg = аргинин, Gly = глицин, Leu = лейцин, Lys = лизин,
Pal(3) = 3-(3-пиридил)аланин, Nal(2) = 3-(2-нафтил)аланин), Phe = фенилаланин, Сра = 4-хлорфенилаланин, Pro = пролин, Ser = серин, Thr = треонин, Тrр = триптофан, Туr = тирозин и
Sar = саркозин. Если не указано иное, все описанные в заявке аминокислоты относятся к Lряду. Например, сокращенное название D-Nal(2) означает 3-(2-нафтил)-0-аланин, а сокращенное название Ser означает L-серин.
Заместители по ε-аминогруппе боковой цепи лизина приведены после термина "Lys" в
скобках, по выбору в сокращенной форме.
Прочие сокращения, использованные в тексте заявки:
Ас
ацетил
В
4-(4-амидинофенил)амино-1,4-диоксобутил
Вое
трет-бутилоксикарбонил
Вор
гексафторфосфатбензотриазол-1-окситрис(диметиламино)фосфония
DCC
дициклогексилкарбодиимид
ДХМ
дихлорметан
Ddz
диметоксифенилдиметилметиленоксикарбонил(диметоксидиметил-Z)
DIC
диизопропилкарбодиимид
DIPEA
N,N-диизопропилэтиламин
ДМФ
диметилформамид
Fmoc
флуоренилметилоксикарбонил
HF
фтористоводородная кислота
HOBt
1-гидроксибензотриазол
ВЭЖХ
высокоэффективная жидкостная хроматография
Me
метил
ТФУ
трифторуксусная кислота
Z
бензилоксикарбонил.
Пептиды по настоящему изобретению представляют собой аналоги релизинг-фактора
лютеинизирующего гормона (LH-RH), как показано на следующей структуре:
p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, (LH-RH, гонадорелин).
Селективные потенциальные антагонисты декапептида LHRHB исследуют уже более
20 лет (статья М. Karten, J.E. Rivier, Endocrine Reviews (1986), т.7, стр. 44-66). Большой
интерес к таким антагонистам обусловлен необходимостью их использования в области
эндокринологии, гинекологии, предупреждения беременности и терапии онкологических
заболеваний. В качестве потенциальных антагонистов LHRH получено множество соединений. Наиболее интересными соединениями, которые найдены к настоящему времени,
являются такие соединения, структура которых является модификацией структуры LHRH.
Первую серию потенциальных антагонистов получали введением ароматических аминокислот в положения 1, 2, 3, и 6 или 2, 3 и 6 полипептидной цепи. Принятый способ описания таких соединений заключается в следующем: прежде всего указывают аминокислоты,
на которые заменены первоначальные аминокислоты в пептидной цепи LHRH, причем
положения, в которых произошли замены, обозначают цифрами, расположенными в верхнем индексе. Затем указывают термин "LHRH", обозначающий тот факт, что речь идет об
аналоге LHRH, содержащем указанные замены.
Известными антагонистами являются следующие соединения:
[Ac-D-Cpa1,2, D-Trp3,6]LHRH (статья D.H. Coy и соавт., "Peptides; Proceedings of the 6th
American Peptid Symposium" (Пептиды: Материалы 6-го американского симпозиума по
пептидам), стр. 775-779, ред. Gross E., Meienhofer J., Pierce Chem. Co., Rocckville III (1979);
[Ac-Pro1, D-Cpa2, D-Nal(2)3,6]LH-RH (патент США № 4419347) и
[Ac-Pro1, D-Cpa2, D-Trp3,6]LH-RH (статья J.L Pineda и соавт., J. Clin. Endocrinol. Metab.
(1983), т. 56, стр. 420).
3
BY 9321 C1 2007.06.30
Для усиления действия антагонистов позднее в положение 6 стали вводить основные аминокислоты, например D-Arg. Например, получены: [Ас-D-Cpa1,2, D-Trp3, D-Arg6,
D-Ala10]LH-RH (ORG-30276) (статья D.H. Coy и соавт., Endocrinology (1982), т. 100, стр.
1445), и
[Ac-D-Nal(2)1, D-Phe(4-F)2, D-Trp3, D-Arg6]LH-RH (ORF 18260) (статья J.E. Rivier и соавт., в книге: "LHRH and its Analogs" (LHRH и его аналоги), стр. 11-12, ред. Vickery B.H.,
Nestor Jr. J.J., Hafez E.S.E., MTS Press, Lancaster, UK, (1984)).
Прочие потенциальные антагонисты LH-RH описаны в заявках WO 92/19651, WO
94/19370, WO 92/17025, WO 94/14841, WO 94/13313, US-A 5300492, US-A 5140009,
EP 0413209 A1 и DE 19544212 A1.
Позднее описаны соединения с модифицированными остатками орнитина и лизина в
положении 6, представленные следующей формулой: Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4Tyr5-D-Xxx6-Leu7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2, где D-Xxx является аминокислотным остатком
общей формулы (VI):
HN CH
CO
(CH2)n
NH
.
CO
R
Другими известными антагонистами LH-RH являются антареликс, ганиреликс и цетрореликс.
Антареликс® (INN: Тевереликс):
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-Tyr5-D-Hci6-Leu7-Lys(iPr)8-Pro9-D-Ala10-NH2.
Ганиреликс:
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-Tyr5-D-hArg(Et)26-Leu7-hArg(Et)28-Pro9-D-Ala10-NH2,
Цетрореликс:
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-Tyr5-D-Cit6-Leu7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2.
Задачей изобретения является разработка новых антагонистов LHRH, обладающих повышенной устойчивостью к действию ферментов и значительно более высокой растворимостью в воде.
Для решения поставленной задачи предлагаются соединения, обладающие антагонистической активностью в отношении LHRH, общей формулы (I):
A-Xxxl-Xxx2-Xxx3-Xxx4-Xxx5-Xxx6-Xxx7-Xxx8-Xxx9-Xxx10-NH2,
(I)
где А означает ацетильную группу,
Ххх1 означает D-Nal(2),
Ххх2 означает D-Cpa,
Ххх3 означает D-Pal(3),
Ххх4 означает Ser,
Ххх5 означает N-Me-Tyr,
Ххх6 означает D-Cit, D-Hci или D-[ε-N'-4-(4-амидинофенил)амино-1,4-диоксобутил]Lys (сокращенно: D-Lys(B)),
Ххх7 означает Leu или Nle,
Ххх8 означает Arg или Lys(iPr),
Ххх9 означает Pro и
Ххх10 означает D-Ala или Sar, при условии, что если Ххх6 означает D-Lys(B), то Ххх7
означает Nle, если Ххх6 означает D-Cit, то Ххх7 означает Nle и Ххх10 означает D-Ala, или
если Ххх6 означает D-Hci, то Ххх7 означает Leu и Ххх10 означает D-Ala, или их соли с фармацевтически приемлемыми кислотами, прежде всего ацетаты, эмбонаты и трифторацетаты.
4
BY 9321 C1 2007.06.30
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предпочтительными соединениями
или их солями с фармацевтически приемлемыми кислотами являются следующие соединения:
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(B)6-Nle7-Arg8-Pro9-Sar10-NH2,
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(B)6-Nle7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2,
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(B)6-Nle7-Lys(iPr)8-Pro9-Sar10-NH2,
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(B)6-Nle7-Lys(iPr)8-Pro9-D-Ala10-NH2>
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Cit6-Nle7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2,
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Hci6-Leu7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2,
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Cit6-Nle7-Lys(iPr)8-Pro9-D-Ala10-NH2J
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Hci6-Leu7-Lys(iPr)8-Pro9-D-Ala10-NH2.
Объектами изобретения также являются:
Фармацевтическая композиция, обладающая антагонистической активностью в отношении LHRH, содержащая, по крайней мере, одно соединение по изобретению в терапевтически эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель.
Способ получения соединения по изобретению, заключающийся в том, что последовательность аминокислотных остатков, состоящую из Хххm с соответствующими защитными группами, где m означает целое число от 1 до 10 и Ххх1 ацетилирован, синтезируют на
твердом носителе или в растворе, затем конденсируют на носителе и отщепляют от твердого носителя путем амидирования по остатку Ххх10.
Способ получения фармацевтической композиции, заключающийся в том, что, по
крайней мере, одно соединение по изобретению смешивают с фармацевтически приемлемым носителем и суспендируют или лиофилизируют.
Способ лечения млекопитающих, включая человека, больных гормонозависимыми
опухолями, в частности карциномой предстательной железы, раком молочной железы или
миомой матки, или незлокачественными заболеваниями, при лечении которых требуется
подавление LHRH, в частности эндомитриозом, доброкачественной гиперплазией предстательной железы или бесплодием у женщин или мужчин, заключающийся в том, что
млекопитающему вводят терапевтически эффективное количество, по крайней мере, одного соединения по изобретению.
Синтез соединений формулы (I) можно осуществлять как с помощью классической
конденсации фрагментов, так и твердофазным синтезом по Меррифильду с последовательным наращиванием цепи с использованием D-лизина, ацилированного по боковой цепи карбоновой кислотой общей формулы R1-COOH, а также посредством модификации
декапептидного фрагмента соответствующими карбоновыми кислотами за счет образования амидной связи с боковой цепью D-лизина6. Благодаря этому введение R1-СО-группы
можно осуществлять на трех различных стадиях синтеза: перед конденсацией отдельных
фрагментов с образованием пептида, после введения в цепь лизина или орнитина, но перед конденсацией последующих фрагментов или после конденсации всех фрагментов.
Соединения формулы (I) синтезируют известными методами, например исключительно твердофазным методом, с частичным использованием твердофазного метода (так называемой конденсацией фрагментов) или с помощью классического синтеза в растворе [см. в
книге М.Bodanszky, "Principles of Peptide Synthesis" (Принципы пептидного синтеза),
Springer Verlag, (1984)].
Например, методы твердофазного синтеза описаны в руководстве J.M. Stewart,
J.D. Young "Solid Phase Peptide Synthesis" ("Твердофазный синтез пептидов"), Pierce Chem.
Company, Rockford, III, (1984) и в книге G. Barany, R.B. Merrifield, "The peptides" ("Пептиды"),
гл.1, стр. 1-285 (1979), Academic Press Inc. Классический синтез в растворе подробно описан в руководстве "Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl), Synthese von Peptiden" ("Методы органической химии (Губен-Вейль), синтез пептидов"), ред. Е. Wunsch,
(1974), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, BRD.
5
BY 9321 C1 2007.06.30
Ступенчатый синтез проводят, например, следующим образом, прежде всего Сконцевую аминокислоту с защищенной α-аминогруппой ковалентно присоединяют к одному из обычных нерастворимых носителей, затем от этой аминокислоты отщепляют αаминозащитную группу, и к образовавшейся свободной аминогруппе присоединяют по
карбоксильной группе следующую аминокислоту с защищенной аминогруппой, и таким
образом к синтезируемому пептиду стадия за стадией присоединяют в правильной последовательности остальные аминокислоты, а после присоединения всех аминокислот готовый пептид отщепляют от носителя и по выбору отщепляют остальные присутствующие
защитные группы боковых цепей аминокислот.
Ступенчатую конденсацию проводят обычным способом из соответствующих, должным образом защищенных аминокислот.
Конденсацию отдельных аминокислот друг с другом проводят обычными методами,
которые прежде всего включают:
метод с использованием симметричного ангидрида в присутствии дициклогексилкарбодиимида или диизопропилкарбодиимида (DCC, DIC),
общий карбодиимидный метод,
карбодиимид-гидроксибензотриазольный метод (см. в книге "The Peptides" (Пептиды),
т. 2, ред. Е. Gross, J. Meienhofer).
При конденсации фрагментов предпочтительно используют не сопровождающийся
рацемизацией азидный метод или метод с использованием DCC-1-гидроксибензотриазола
или, соответственно, DCC-3-гидрокси-4-оксо-3,4-дигидро-1,2,3-бензотриазина. Кроме того,
можно использовать активированный эфир фрагмента.
Для ступенчатой конденсации аминокислот наиболее всего подходят активированные
эфиры N-защищенных аминокислот, например N-гидроксисукцинимидный эфир или 2,4,5трихлорфениловый эфир. Для эффективного катализа аминолиза используют N-гидроксисоединения, обладающие кислотностью, приблизительно равной кислотности уксусной
кислоты, например 1-гидроксибензотриазол.
В качестве промежуточных аминозащитных групп предложены группы, удаляемые
гидрированием, например бензилоксикарбонильный остаток (= Z-остаток) или группы,
отщепляемые в слабой кислоте. В качестве защитных групп для α-аминогруппы используют,
например, следующие группы: третбутилоксикарбонил, флуоренилметилоксикарбонил,
карбобензокси, соответственно, карбобензтио (по выбору с п-бром- или п-нитробензильным
остатком), трифторацетил, фталильный остаток, о-нитрофеноксиацетил, тритил, п-толуолсульфонил, бензил, бензил, имеющий заместители в бензольном кольце (п-бром- или
п-нитробензильный остаток) и α-фенилэтил. Кроме того, методы защиты аминогрупп описаны в следующих книгах: Jesse P. Greenstein, Milton Winitz, "Chemistry of Amino Acids"
(Химия аминокислот), New York, (1961), John Wiley and Sons, Inc., т. 2, например, стр. 883
и др., "Principles of Peptide Synthesis" (Принципы пептидного синтеза), Springer Verlag
(1984), "Solid Phase Peptide Synthesis" (Твердофазный синтез пептидов), J.M. Stewart,
J.D. Young, Pierce Chem. Company, Rockford, III, (1984), G. Barany, R.B. Merrifield, "The
Peptides" (Пептиды), гл.1, стр. 1-285, (1979), Academic Press Inc., а также The Peptides
(Пептиды), т. 2, ред. Е. Gross, J.M. Meienhofer, Academic Press, New York. В основном эти
же защитные группы используют и для защиты других функциональных боковых групп
(ОН-групп, NH2-rpупп) соответствующих аминокислот.
Имеющиеся гидроксигруппы (серина и треонина) предпочтительно защищают с помощью бензильных групп и аналогичных групп. Прочие не α-аминогруппы (например
аминогруппы в ω-положении, гуанидиногруппы аргинина) предпочтительно защищают
ортогонально.
Отдельные производные аминокислот, за исключением лизина, модифицированного
R1-CO-группами, имеются в продаже.
Возможная схема процесса получения лизина, модифицированного R1-СО-группами,
является следующей:
6
BY 9321 C1 2007.06.30
1. α-Карбоксильную группу блокируют подходящим методом, например с помощью
этерификации.
2. ε-Аминогруппу блокируют, например, с использованием Z-группы.
3. α-Аминогруппу блокируют таким образом (например с использованием Вос-группы),
чтобы обеспечить селективность относительно последующего отщепления аминозащитной группы.
4. От ε-аминогруппы отщепляют Z-группу.
5. К ε-аминогруппе присоединяют требуемую группу R1-CO-.
6. От α-аминогруппы отщепляют защитную группу.
7. α-Аминогруппу при необходимости обратимо модифицируют, например, с использованием Z-группы.
Для введения R1-CO-группы с целью модификации аминогруппы лизина соответствующей карбоновой кислотой или производным карбоновой кислоты в основном используют
способы, описанные для конденсации аминокислот. Однако наиболее предпочтительна
конденсация с использованием карбодиимида, например, 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида, и 1-гидроксибензотриазола.
Реакцию конденсации аминокислот проводят в обычных нейтральных растворителях
и суспендирующих средствах (например в дихлорметане), причем по выбору для повышения растворимости может быть добавлен диметилформамид.
В качестве синтетических материалов-носителей используют нерастворимые полимеры, например набухающую в органическом растворителе полистирольную смолу в форме
гранул (например сополимеризат полистирола и 1 % дивинилбензола). Синтез защищенного декапептидамида, имеющего после отщепления от носителя в присутствии HF требуемую С-концевую амидную группу, на метилбензгидриламидной смоле (МВНА-смола,
т.е. полистирольная смола, содержащая метилбензгидриламидные группы) может быть
осуществлен по следующей постадийной схеме.
Протокол пептидного синтеза с использованием Вос-защищенных аминокислот
Стадия
Функция
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Промывка
Промывка
Отщепление
Промывка
Промывка
Промывка
Нейтрализация
Промывка
Промывка
Остановка
11
12
13
Конденсация
Промывка
Промывка
Растворитель/реагент об./об.
Метанол
ДХМ
ДХМ/ТФУ(1:1)
Изопропанол
Метанол
ДХМ
ДХМ/DIPEA (9:1)
Метанол
ДХМ
Добавление Вос-аминокислоты
в ДХМ + DIC + HOBt
ДХМ, по выбору ДХМ/DCF
Метанол
ДХМ
Время
2×2 мин
3×3 мин
1×30 мин
2×2 мин
2×2 мин
2×3 мин
3×5 мин
2×2 мин
3×3 мин
прибл. 90 мин
3×2 мин
2×3 мин
Nα-Boс-защищенные аминокислоты обычно конденсируют в присутствии трехкратного молярного избытка диизопропилкарбодиимида (DIC) и 1-гидроксибензотриазола
(HOBt) в СН2Сl2/ДМФ в течение 90 мин, а Вос-защитную группу отщепляют под действием 50 %-ной трифторуксусной кислоты (ТФУ) в СН2Сl2. Для контроля полноты прохождения реакции используют хлоранильный тест по Кристенсену и нингидриновый тест по
Кайзеру. Остаток свободной аминогруппы блокируют ацетилированием в присутствии
7
BY 9321 C1 2007.06.30
пятикратного избытка ацетилимидазола в CH2Cl2. Последовательность реакционных стадий наращивания пептидной цепи на смоле приведена на постадийной схеме. Для отщепления связанного со смолой пептида конечный продукт твердофазного синтеза сушат в
вакууме над Р2О5 и обрабатывают 500-кратным избытком смеси HF/анизол 10:1/об.:об. в
течение 60 мин при 0 °С.
После упаривания HF и анизола в вакууме пептидамид выпадает в осадок при перемешивании с безводным этиловым эфиром в виде твердого вещества белого цвета; отделение от осадка полимерного носителя осуществляют промыванием 50 %-ной водной
уксусной кислотой. После осторожного концентрирования раствора в уксусной кислоте в
вакууме пептид может быть получен в виде очень вязкого масла, которое при добавлении
абсолютного эфира на холоде превращается в твердое вещество белого цвета.
Дальнейшую очистку проводят известным методом высокоэффективной жидкостной
хроматографии (ВЭЖХ).
Перевод пептида в его кислотно-аддитивную соль может быть осуществлен взаимодействием с кислотами по известному способу. И наоборот, свободный пептид может
быть получен взаимодействием его кислотно-аддитивной соли с основанием. Эмбонат
пептида может быть получен взаимодействием соли пептида и трифторуксусной кислоты (соль с ТФУ) с эмбоновой кислотой (памовой кислотой) или соответствующей динатриевой солью эмбоновой кислоты. Для этого соль пептида с ТФУ в водном растворе
обрабатывают раствором динатриевой соли эмбоновой кислоты в полярном апротонном
растворителе, предпочтительно диметилацетамиде, и выделяют образующийся осадок
светло-желтого цвета.
Следующие примеры приведены для пояснения изобретения без ограничения объема
притязаний изобретения.
Пример 1 (D-68968)
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(B)6-Nle7-Arg8-Pro9-Sar10-NH2.
Синтез декапептида осуществляют на полимерном носителе, причем нагрузка составляет 0,55 ммоль/г (смола, содержащая аминометильные группы, защитные Fmoc-группы,
тип D-1675, производство фирмы Bachem). Лизин присоединяют в виде Fmoc-D-Lys(Boc)-OH,
защитные Fmoc-группы отщепляют в смеси 20 % пиперидин/ДМФ. После одновременного отщепления всех защитных групп боковых цепей и отделения от полимерного носителя
выделенный неочищенный пептид очищают с использованием препаративной ВЭЖХ. После лиофильного высушивания получают декапептид с чистотой 98,5 %.
Замещение D-лизина по атому ε-азота с использованием 4-(4-аминофенил)амино-1,4диоксомасляной кислоты проводят в присутствии РуВор в ДМФ и в смеси с DIPEA. Очистку выделенного неочищенного пептида осуществляют с использованием препаративной
ВЭЖХ. После лиофильного высушивания получают продукт в виде трифторацетата, чистота составляет приблизительно 99 %, брутто-формула C82H106CIN19O15, скорректированный MC-FAB 1633 (М + Н) (рассчит. 1631,78096).
Пример 2 (D-68969)
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(B)6-Nle7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2.
Синтез декапептида осуществляют на полимерном носителе, причем нагрузка составляет 0,55 ммоль/г (смола, содержащая аминометильные группы, защитные Fmoc-группы,
тип D-1675, производство фирмы Bachem). Лизин присоединяют в виде Fmoc-D-Lys(Boc)-OH,
защитные Fmoc-группы отщепляют в смеси 20 % пиперидин/ДМФ. После одновременного отщепления всех защитных групп боковых цепей и отделения от полимерного носителя
выделенный неочищенный пептид, содержание которого составляет 71 % (ВЭЖХ), в
дальнейшем используют без очистки.
Замещение боковых цепей D-лизина с использованием 4-(4-аминофенил)амино-1,4диоксомасляной кислоты проводят в присутствии РуВор в ДМФ и в смеси с DIPEA. Очистку выделенного неочищенного пептида осуществляют с использованием препаративной
8
BY 9321 C1 2007.06.30
ВЭЖХ. После лиофильного высушивания получают продукт в виде трифторацетата, чистота которого составляет приблизительно 98,8 %, брутто-формула C82H106CIN19Ol5, скорректированный MC-FAB 1633 (М + Н) (рассчит. 1631, 78096).
Пример 3 (D-68971)
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(B)6-Nle7-Lys(iPr)8-Pro9-Sar10-NH2.
Синтез декапептида осуществляют на полимерном носителе, причем нагрузка составляет 0,55 ммоль/г (смола, содержащая аминометильные группы, защитные Fmoc-группы,
тип D-1675, производство фирмы Bachem). Лизин присоединяют в виде Fmoc-D-Lys(Boc)-OH,
защитные Fmoc-rpyппы отщепляют в смеси 20 % пиперидин/ДМФ. После одновременного отщепления всех защитных групп боковых цепей и отделения от полимерного носителя
выделенный неочищенный декапептид, содержание которого составляет приблизительно
59 % (ВЭЖХ), очищают методом препаративной ВЭЖХ. После лиофильного высушивания получают декапептид с чистотой 95 %.
Замещение боковых цепей D-лизина с использованием 4-(4-аминофенил)амино-1,4диоксомасляной кислоты проводят в присутствии РуВор в ДМФ и в смеси с DIPEA. Очистку выделенного неочищенного пептида осуществляют с использованием препаративной
ВЭЖХ. После лиофильного высушивания получают продукт в виде трифторацетата, чистота составляет приблизительно 96,6 %, брутто-формула C85H112CIN17O15, скорректированный MC-FAB 1648 (М + Н) (рассчит. 1645, 8218).
Пример 4 (D-68987)
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(B)6-Nle7-Lys(iPr)8-Pro9-D-AIa10-NH2.
Синтез D-Lys-6-незамещенных декапептидов осуществляют с использованием 9,09 г
полимерного носителя, причем нагрузка составляет 0,55 ммоль/г, лизин6 присоединяют в
виде Fmoc-D-Lys(Boc)-OH. После отщепления смолы выделяют 8,15 г неочищенного пептида. Очистку неочищенного пептида осуществляют с использованием препаративной ВЭЖХ.
Замещение боковых цепей D-лизина с использованием 4-(4-аминофенил) амино-1,4диоксомасляной кислоты проводят в присутствии РуВор в ДМФ и в смеси с DIPEA. Очистку выделенного неочищенного пептида осуществляют с использованием препаративной
ВЭЖХ. После лиофильного высушивания получают продукт в виде трифторацетата, чистота составляет 94,6 %, брутто-формула C85H112CIN17O15, соответственный MC-FAB
1646,8 (М + Н) (рассчит. 1645,82).
Пример 5
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Cit6-Nle7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2
Пример 6
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Hci6-Leu7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2
Пример 7
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Cit6-Nle7-Lys(iPr)8-Pro9-D-Ala10-NH2.
Пример 8
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Hci6-Leu7-Lys(iPr)8-Pro9-D-Ala10-NH2.
Общие рабочие методики получения пептида согласно примерам 5-8.
Декапептиды могут быть получены как методом твердофазного синтеза Меррифилда,
а также классическим методом конденсации фрагментов в растворе. С экономической
точки зрения предпочтительным является синтез пептидной цепи на полимерном носителе
и, в основном, для присоединения D-аланина по С-концевой группе может быть по выбору использована 1) стратегия с защитными Вос-группами или 2) стратегия с защитными
Fmoc-группами; соответственным образом может быть использована смола с метилбензгидриламиногруппами (для стратегии 1) или смола с Fmoc-2,4-диметокси-4'-(карбоксиметилокси)бензгидриламиногруппами (для статегии 2).
9
BY 9321 C1 2007.06.30
Твердофазный синтез Меррифилда
Декапептид синтезируют в стандартных условиях (постадийная схема, табл. 1) твердофазного синтеза с использованием стратегии с защитными Fmoc-группами и с использованием 5 г полимерного носителя, а именно смолы с Fmoc-2,4-диметокси-4'-(карбоксиметилокси)бензгидриламиногруппами типа D1675 производства фирмы Bachem, нагрузка
составляет 0,55 ммоль/г, размер гранул смолы 200-400 меш.
Ступенчатый синтез пептидной цепи на смоле осуществляют с использованием аминокислот, содержащих Na-Fmoc-защитные группы, согласно следующей постадийной схеме:
Таблица 1
Число повторов
2х
2х
2х
1х
2х
1х
2х
1х
1х
1х
1х
1х
1х
1х
Стадия
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Функция
Растворитель
Время
Промывка
ДМФ
2 мин
Отщепление 20 % пиперидин в ДМФ
5 мин
Промывка
ДМФ
2 мин
Промывка
Изопропанол
2 мин
Промывка
ДМФ
2 мин
Промывка
Изопропанол
2 мин
Промывка
ДМФ
2 мин
Конденсация Вос-АК-ОН, HOBT, DIC в ДМФ 90 мин
Промывка
ДМФ
2 мин
Промывка
Изопропанол
2 мин
Промывка
ДМФ
2 мин
Промывка
Изопропанол
2 мин
Промывка
ДМФ
2 мин
Промывка
Изопропанол
2 мин
Контрольное Хлоранильный тест*
испытание
(* по методике, описанной в статье T.Christensen, Acta Chem. Scand. (1979) т. В 33,
стр. 763-766).
Ниже приведены типичные (повторяемые) параметры условий реакции твердофазного
синтеза декапептида по вышеуказанной схеме.
Отщепление защитных Fmoc-групп в 20 % пиперидине в ДМФ, 2×5 мин при комнатной температуре (стадия 2).
Конденсация в использованием трехкратного молярного избытка Fmoc-аминокислоты
в присутствии диизопропилкарбодиимида (DIC) и гидроксибензотриазола (HOBt) (стадия 8).
Отщепление по С-концевому остатку от полимерного носителя, включая удаление защитных групп боковых цепей аминокислот в присутствии трифторуксусной кислоты (ТФУ).
После отделения полимерного носителя при использовании 5 г смолы получают приблизительно 5-6 г неочищенной пептидной смеси, в которой содержание требуемого компонента составляет приблизительно 70-80 %, который выделяют с использованием
препаративной ВЭЖХ.
Очистка декапептида методом препаративной ВЭЖХ. условия хроматографии.
Препаративная ВЭЖХ, колонка Dynamax RP18, производства фирмы Shimadzu, 12 мкм,
300 Å, длина 250 мм, внутр. диаметр 41,4 мм.
Система градиента с временной программой, 40 % В → 90 % В, 50 мин.
Растворитель А: 970 мл Н2О + 30 мл CH3CN + 1 мл CF3COOH.
Расворитель В: 300 мл Н2О + 700 мл CH3CN + 1 мл CF3COOH.
УФ-детектирование, λ = 220 нм, скорость потока 60 мл/мин.
Полученные фракции концентрируют в вакууме и высушивают лиофильно. Декапептид получают в виде легкого бесцветного материала.
10
BY 9321 C1 2007.06.30
В заключение превращение продукта в требуемую для фармакологического применения ацетатную соль проводят с помощью ионнообменной хроматографии.
Исследование биологического действия
Соединения по настоящему изобретению формулы I исследуют по их связыванию с
рецептором. Использованные способы относятся к известным методам, описанным в статье Beckers et al., Eur.J. Biochem., (1995) т. 231, стр. 535-543. Цетрореликс, синтезированный,
как описано выше, йодируют [125I] (производства фирмы Amersham, удельная активность 80,5 Бк/фмоль) с использованием реагента lodoGen (производства фирмы Pierce).
Реакционную смесь очищают методом обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии, при этом получают монойодированный цетрореликс без примеси немеченного пептида. При необходимости приблизительно 80 % [125I]-цетрореликса и
немеченного соединения по изобретению являются пригодными для специфического связывания с рецептором.
Соединения по настоящему изобретению могут быть исследованы по их действию in
vitro с использованием следующих методов 1 и 2, причем аффинность связывания определяют методом анализа связывания с [125I]-цетрореликсом (метод 1), а функциональную
активность определяют с использованием трипторелина в качестве агонистического стимулятора (метод 2).
Метод 1 (Определение KD на примере цетрореликса):
Анализ связывания с рецептором по статье Beckers Т., Marheineke К., Reilander H., Hilgard P. "Selection and characterization of mammalian cell lines with stable overexpression of
human pituitary receptors for gonadoliberin (GnRH)" (Отбор и характеристика линий клеток
млекопитающих, обладающих устойчивой сверхэкспрессией рецепторов гонадолиберина
(GnRH) гипофиза человека) Eur. J.Biochem. (1995), т. 231, стр. 535-543.
Для исследования связывания с рецептором цетрореликс йодируют [125I] (производства
фирмы Amersham, удельная активность 80,5 Бк/фмоль) с использованием реагента lodoGen
(производства фирмы Pierce). Реакционную смесь очищают методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии с замещенными фазами, причем получают монойодированный
цетрореликс без примеси немеченного пептида. Приблизительно 80 % [125I]-цетрореликса
являются пригодными для специфического связывания с рецептором.
Анализ связывания с рецептором проводят с использованием интактных клеток в физиологических условиях по описанной методике (Beckers et al. 1995). Субконфлюентные
культуры стабильных трансфектных клеток LTK, которые экспрессируют на поверхности
рецептор LHRH человека, отделяют инкубированием в присутствии NaCl/Pi, (137 мМ
NaCl, 2,7 мМ KCI, 8,1 мМ Na2HPO4, 11,47 мМ КН2РО4)/1 мМ ЭДТУ и собирают центрифугированием. Осадок клеток ресуспендируют в буфере для связывания (DMEM без Н2СО3, содержащая 4,5 г/л глюкозы, 10 мМ Hepes pH 7,5, 0,5 мас./об. % БСА, 1 г/л бацитрацина, 0,1 г/л
SBTI, 0,1 мас./об. % NaN3. Для анализа по механизму замещения суспензию 0,25×106 клеток/100 мкл, содержащую приблизительно 225 пМ [125I]-цетрореликс (удельная активность 5-10×105 импульс/мин/пмоль), инкубируют в присутствии различных концентраций
немеченного соединения по настоящему изобретению в качестве конкурирующего соединения. Суспензию клеток в 100 мкл среды для связывания наслаивают в пробирки для исследования объемом 400 мкл на 200 мкл смеси 84 об. % силиконового масла (Merck Тур
550)/16 об. % парафинового масла. После инкубирования в течение 1 ч при 37 °С при непрерывном медленном встряхивании клетки отделяют от инкубационной среды путем
центрифугирования в течение 2 мин при 9000 об/мин (центрифуга Rototyp HTA 13,8, производства Heraeus Sepatec, Osterode, Германия). Верхние части пробирок, содержащие
осадок клеток, отрезают. Затем в осадке клеток и надосадочной жидкости определяют
число импульсов γ-излучения. Затем определяют количество неспецифически связанных
соединений по включению немеченного цетрореликса при конечной концентрации 1 мкМ,
которое в типичном случае составляет ≤ 10 % от общего количества связанных соединений.
11
BY 9321 C1 2007.06.30
Для анализа данных по связыванию используют аналитическую программу EBDA/Ligand
(Biosoft V3,0). Величина KD для цетрореликса составляет 170 пмоль/л (пМ) (число проведенных независимых экспериментов составляет 21).
Метод 2 (Функциональный анализ для определения антагонистического действия (величина IC50)):
Анализ проводят с некоторыми модификациями, как описано в статье Beckers Т.,
Reilander H., Hilgard P. "Characterization of gonadotropin-releasing hormone analogs based on
a sensitive cellular luciferase reporter gene assay" (Характеристика аналогов релизинг-гормона
гонадотропина, основанная на чувствительном анализе репортерного гена клеточной люциферазы) (1997), Analyt. Biochem., т. 251, стр. 17-23 (Beckers et al. 1997). Клетки (по
10000 клеток в лунке), которые содержат на поверхности LHRH-рецептор человека и репортерный ген люциферазы человека, культивируют в микропланшете в течение 24 ч с
использованием среды DMEM с добавками и 1 об./об. % эмбриональной сыворотки коров
(FCS). Затем клетки стимулируют в течение 6 ч 1 нМ раствором [D-Trp6] LHRH. Перед
стимулированием добавляют антагонистические соединения по настоящему изобретению и
наконец клетки лизируют для количественного определения активности клеточной люциферазы. Рассчет величины IC 50 проводят с использованием кривой дозо-зависимого
действия и нелинейного регрессионного анализа Hill-Modells (программа EDX 2,0,
C.Grunwald, Arzneimittelwerk, Dresden).
Количественное определение активности люциферазы в основном определяют по известному методу (Promega Technical Bulletins, No 101/161) с использованием повторных
экспериментов и современных систем для анализа люциферазы (Promega E4030). При добавлении коэнзима А (СоА) происходит окисление люциферил-СоА с благоприятной кинетикой. После удаления культуральной среды из микропланшета клетки лизируют путем
добавления 100 мкл буфера для лизиса (25 мМ трис-фосфат, рН 7,8, 2 мМ дитиотреитол,
2 мМ 1,2-диаминоциклогексан-N,N,N',N'-тетрауксусная кислота (CDTA), 10 об./об. % глицерин, 1 об./об. % тритон Х-100). После инкубирования в течение 15 мин при комнатной
температуре 10 мкл клеточного лизата переносят в микропланшет белого цвета, пригодный для люминометрического определения (Dynatech). Ферментативную реакцию инициируют путем добавления 50 мкл буфера для анализа (20 мМ трицин, рН 7,8, 1,07 мМ
(MgCO3)4 Mg(OH)2, 2,67 мМ MgSO4, 0,1 мМ этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТУ),
33,3 мМ дитиотреитол, 270 мкМ коэнзим А, 470 мкМ люциферин из светляков Photinus
pyralis, 530 мкМ rATPNa2). Через 1 мин определяют люминесценцию в течение общего
времени 1 сек, причем длительность сигнала на половине высоты амплитуды составляет
5 мин, при использовании MicroLumat LB 96 Р, EG&G Berthold.
В табл. 2 представлены физико-химические данные и данные действия соединений по
настоящему изобретению in vitro. IC50 означает функциональную активность, а термин
"пМ" означает пикомоль в литре. Растворимость в воде определяют методом, описанным
в примечании 2.
Таблица 2
Соединение
Растворимость в воде2 [мг/мл]
IC50 [пМ]
Цетрореликс
0,002
198 (5)1
Пример 1 (D-68968)
1,03
1300 (1)1
Пример 2 (D-68969)
1,11
1400 (1)1
Пример 3 (D-68971)
1,36
4700 (1)1
Пример 4 (D-68987)
1,18
700 (1)1
Примечания:
1) В скобках представлено число независимых друг от друга экспериментов.
2) Растворимость в воде определяют по описанному ниже методу. Растворимость в
растворе Рингера, определенная по стандартному методу.
12
BY 9321 C1 2007.06.30
Для определения растворимости по стандартному методу исследуемое соединение в
избытке смешивают с инертным носителем, например песком, и смесью заполняют стеклянную колонку (объемом приблизительно 10 мл). Перед этой операцией на дно колонки
помещают слой из ваты и стекловолоконный фильтр. Смесь исследуемого соединения и
песка пропитывают 1,0 мл растворителя, растворимость в котором следует определить, в
течение 1 ч. Затем в колонку наносят 10 мл растворителя и раствор прокачивают в циклическом режиме с помощью перистальтического насоса. Данный метод определения проводят при комнатной температуре (приблизительно 20 °С). Растворимость определяют,
когда массовая концентрация в последовательно полученных фракциях составляет постоянную величину. Массовую концентрацию определяют с помощью описанного ниже метода ВЭЖХ.
Метод ВЭЖХ.
Оборудование
Система ВЭЖХ Hewlett Packard 1100, детектор Hewlett Packard DAD, серия 1100.
Колонка:
носитель
Nucleosil® 120-3 С18
Размер частиц
3 мкм
Размеры колонки
125×4 мм
Фирма-производитель
Macherey&Nagel.
Параметры оборудования: объем ввода образца 15 мкл.
Поток
1,0 мл/мин
Температура термостата
45 °С
Длина волны
226 нм
Время завершения цикла
15 мин.
55 % Мобильная фаза А: смешивают 970 мл Н2О Milli-Q, 30 мл ацетонитрила и 1 мл
трифторуксусной кислоты. Величина рН составляет приблизительно 1,9.
45 % Мобильная фаза В: смешивают 300 мл Н2О Milli-Q, 700 мл ацетонитрила и 1 мл
трифторуксусной кислоты. Величина рН составляет приблизительно 1,8.
Введение соединений по настоящему изобретению можно осуществлять в различной
форме, подходящей для активного пептида. Подходящие способы введения известны специалистам в данной области техники. Например, введение можно осуществлять с помощью инъекции. Введение можно осуществлять также парентеральным способом. При
этом предпочтительными являются подкожный (п.к.), внутримышечный (в.м.), внутривенный (в.в.), буккальный (например подъязычный) или ректальный способы. Наиболее
предпочтительными являются в.в. и в.м..
Соединения по настоящему изобретению подходят для изготовления различных форм
применения, например лиофильно высушенных препаратов, растворов или суспензий.
Подходящие формы применения и способы их получения известны специалистам в данной области техники. В качестве вспомогательных веществ и носителей пригодными являются, например, гекситы, такие как маннит, прежде всего D-маннит, L-маннит или D,Lманнит, сорбит, такой как D-сорбит, D- или L-альтрит, идит, глюцит и дульцит. Изготовление осуществялют по известным методам, например с помощью смешивания, суспендирования или лиофилизации.
Пример А: лиофилизированный препарат для получения раствора для п.к. инъекции. 1 мг
соединения согласно примеру 1 (0,26-0,27 мг ацетата соответственно); 0-16,9 мас.частей
D-маннита, предпочтительно 0,1-7 мас.частей, при необходимости соотнесенные к примеру 1, и вода для инъекций (для приготовления инъекционных растворов из лиофилизированных препаратов). Получение: 1,62 г соединения согласно примеру 1 растворяют в
30 %-ном растворе уксусной кислоты (приблизительно 1,5 л воды для инъекций и 91,17 г
уксусной кислоты). Раствор разбавляют 1,5 л воды. Добавляют 82,2 г маннита, стерилизуют и разливают по 2 мл в стерильные флаконы для инъекций в асептических условиях,
13
BY 9321 C1 2007.06.30
высушивают лиофильно. В каждом флаконе содержится 1 мг лиофилизированного препарата соединения согласно примеру 1.
Соединения по настоящему изобретению, например, подходят для лечения злокачественных или доброкачественных гормонально-зависимых заболеваний, например для лечения карциномы молочной железы, карциномы предстательной железы, эндометриоза,
миомы матки, доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ГПЖ), а также
для лечения бесплодия у женщин или мужчин, например для профилактики преждевременного отторжения яйцеклетки у пациенток, которые происходят при контролируемой
овариальной стимуляции, при которой у пациенток извлекают яйцеклетки и используют
вспомогательные методы воспроизводства. Упомянутые методы лечения могут быть использованы для лечения млекопитающих, прежде всего человека.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
14
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
185 Кб
Теги
by9321, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа