close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY9646

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2007.08.30
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
BY (11) 9646
(13) C1
(19)
C 12N 1/20
A 01N 63/00
ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS CIRCULANS БИМ В-376Д
ДЛЯ БАКТЕРИЗАЦИИ СЕМЯН ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР
(21) Номер заявки: a 20050228
(22) 2005.03.10
(43) 2006.11.30
(71) Заявитель: Республиканское научное
дочернее унитарное предприятие
"Институт почвоведения и агрохимии" (BY)
(72) Авторы: Михайловская Наталья Алексеевна; Богдевич Иосиф Михайлович; Лученок Людмила Николаевна;
Журавлева Ольга Викторовна; Барашенко Таисия Брониславовна;
Курилович Нина Николаевна; Дюсова Светлана Васильевна (BY)
(73) Патентообладатель: Республиканское
научное дочернее унитарное предприятие "Институт почвоведения и агрохимии" (BY)
(56) BY 4632 С1, 2002.
RU 2072691 С1, 1997.
RU 2035507 С1, 1995.
RU 2081867 С1, 1997.
RU 2216173 С2, 2003.
BY 9646 C1 2007.08.30
(57)
Штамм бактерий Bacillus circulans БИМ В-376Д, способный использовать калий почвенных минералов, для бактеризации семян зерновых культур.
Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, в
частности для получения биопрепарата.
Известны штаммы Bacillus mucilaginosus, например штамм 4 с фосфатмобилизующей
активностью из коллекции Всероссийского НИИ сельскохозяйственной микробиологии
[1], или штамм Bacillus mucilaginosus B-5987, способный трансформировать нерастворимые фосфаты в доступную для растений форму и синтезировать экзополисахариды, из
Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов [2]. Известен также штамм
Bacillus polymyxa B-324D с фосфатмобилизующей активностью [3].
Недостатком известных штаммов Bacillus mucilaginosus и Bacillus polymyxa является
ограниченный спектр действия - овощные, плодовые и декоративные культуры. У известных штаммов В. mucilaginosus и В. polymyxa не отмечена способность к биологической
мобилизации калия.
Целью изобретения является получение штамма Bacillus circulans с высокой активностью мобилизации почвенного калия из труднодоступных форм, способного улучшать калийное питание и стимулировать рост и повышать урожай зерновых культур.
Указанная цель достигнута тем, что методом отбора природных изолятов из ризосферы овса, ячменя, ржи и пшеницы на окультуренных дерново-подзолистых почвах, был по-
BY 9646 C1 2007.08.30
лучен новый штамм, отличающийся высокой и стабильной активностью по мобилизации
калия и стимуляции роста ячменя и овса.
Сущность изобретения заключается в том, что штамм Bacillus circulans K-81, выделенный из ризосферы пшеницы на окультуренной дерново-подзолистой супесчаной почве, может быть использован для изготовления биопрепарата с целью улучшения
калийного питания, стимуляции роста и повышения урожая зерновых культур. Для получения бактериального препарата штамм выращивают на силикатном агаре (pH 6,8-7,2) при
температуре 28 °С в течение 5-7 суток, смывают стерильной водой или физиологическим
раствором и доводят до концентрации 108-109 кл/мл.
Штамм Bacillus circulans K-81 имеет следующие культурально-морфологические признаки: клетки палочковидные, 0,8-1,0 х 2,0-3,0 мкм, грамположительные, каталазоположительные и оксидазоотрицательные, образуют термоустойчивые споры.
На мясопептонном агаре (МПА) с дрожжевым экстрактом через сутки инкубации при
36 °С образуют слизистые, выпуклые, непрозрачные блестящие колонии молочно-белого
цвета диаметром 3-4 мм. На вторые сутки в центре колонии образуется складчатость.
Диаметр колоний 5-6 мм. На 5 сутки колонии принимают складчатую форму.
На картофельном агаре (КА) через сутки инкубации при 36 °С образуют слизистые,
сильно выпуклые, блестящие непрозрачные грязно-белые колонии диаметром 4-5 мм. На
вторые сутки четко выделяется центр колонии. На пятые сутки колонии желтовато-белые
с диаметром 8-10 мм. В растворе NaCl (7,7 %) образуют мелкодисперсный белый осадок.
Не нуждается в витаминах для роста, не образует индола, не выделяет сероводород и
аммиак. На средах с глюкозой, сахарозой и лактозой образует кислоту. Гидролизует крахмал.
Аэроб. Хорошо растет в интервале температур 28-30 °С. Оптимальное значение pH
6,8-7,2.
Отношение к источникам углерода: хорошо использует глюкозу, сахарозу, крахмал,
маннит, арабинозу, ксилозу. Не используют солей органических кислот в качестве единственного источника углерода.
Отношение к нерастворимым соединениям фосфора: штамм характеризуется способностью к растворению трехзамещенного фосфата кальция.
Отношение к нерастворимым соединениям калия: штамм отличается способностью
использовать калий почвенных минералов: слюд (биотита, мусковита) и гидрослюд (гидромусковита).
Хранение штамма Bacillus circulans K-81 на твердой питательной среде следующего
состава (г/л): сахароза - 5; (NH4)SO4 - 1; Na2HPO4 - 2; MgSO4 - 0,5; FeCl3 - следы; алюмосиликат - 1; агар - 20. Температура инкубации 28-30 °С, длительность выращивания - 7296 ч. Хранение в пробирках на скошенной агаризованной среде при температуре 4 ± 2 °С
до 0,5 года или на МПА при температуре 4 ± 2 °С до 1 года.
Характерными особенностями штамма Bacillus circulans K-81 являются: высокая и стабильная активность мобилизации калия, стимуляция роста и улучшение режима питания
зерновых культур.
Пример 1.
Способность штамма Bacillus circulans K-81 использовать калий почвенных минералов
Для определения активности мобилизации калия, штамм Bacillus circulans K-81 высевали в колбы, содержащие по 100 мл жидкой питательной среды следующего состава
(г/л): 0,75 г сахарозы, 0,15 г (NH4)2SO4, 0,3 г Na2HPO4, 0,075 г MgSO4, FeCl3 - следы, 1 г
минерала. Для минимизации содержания подвижного калия в жидкой питательной среде
использовали бидистиллят и многократно перекристаллизованные и очищенные от примесей калия реактивы. В качестве единственного источника калия использованы предварительно отмытые водой калийсодержащие почвенные минералы - слюды (биотит и
мусковит) и гидрослюды (гидромусковит и глауконит). Количество калия в культуральной
2
BY 9646 C1 2007.08.30
жидкости определяли методом пламенной фотометрии после 7-дневной инкубации бактериальной культуры в термостате при 28 °С.
Количественная оценка активности штамма Bacillus circulans K-81 по мобилизации
калия почвенных минералов показала, что при одинаковой степени измельчения минералов штамм К-81 более активно использовал калий мусковита, гидромусковита и биотита
(в убывающем порядке). При этом бактерии не использовали калий глауконита (фиг. 1).
Пример 2.
Способность штамма Bacillus circulans K-81 использовать разные фракции калия из
мусковита
Эксперимент был проведен с мусковитом, который наиболее активно использовал
штамм К-81 по результатам примера 1 (фиг. 1). Целью эксперимента была оценка доступности для бактерий разных по степени подвижности форм калия в мусковите. Перед внесением мусковита в питательную среду с бактериями его предварительно обрабатывали
следующими реагентами по Пчелкину [4]: вода, 1н раствор уксуснокислого аммония, 0,2 н
соляная кислота, 2 н соляная кислота, 20 % соляная кислота. Установлено, что после обработки мусковита дистиллированной водой в течение 2-суток (удаление водорастворимых форм калия) бактерии за 7 суток переводили в раствор примерно в 2 раза больше
калия, чем в контроле с минералом без бактерий (фиг. 2). После обработки мусковита 1н
раствором уксуснокислого аммония в течение 2-х суток для извлечения обменных форм
калия минерал вновь подвергали действию штамма К-81 в течение 7 суток [4]. Установлено, что и после удаления обменных форм калия из мусковита, бактерии переводили калий
в раствор, но его количество было в 1,6 раза меньше по сравнению с водной вытяжкой
(фиг. 2). Таким образом, установлено, что бактерии способны использовать и менее подвижные формы калия мусковита.
После обработки мусковита растворами соляной кислоты разной концентрации (0,2 н,
2 н и 20 %) минерал также подвергали воздействию бактерий в течение 7 суток. Эксперимент показал, что бактерии способны переводить в раствор калий и после обработки минерала растворами соляной кислоты. Содержание подвижного калия в культуральной
жидкости было в 3,6 раза выше после обработки минерала 0,2 н кислотой, в 5,2 раза выше
после обработки 2 н соляной кислотой и в 3,4 раза выше после обработки мусковита 20 %
кислотой по сравнению с соответствующими контрольными вариантами с питательной
средой без внесения силикатных бактерий (фиг. 2).
По степени подвижности калий в минералах представлен в водорастворимой, обменной, труднообменной и необменной формах [4]. Эксперименты показали, что штамм К-81
использует калий не только из наиболее подвижных его форм в минералах, но и калий из
трудноподвижных форм.
Пример 3.
Эффективность бактеризации ячменя сорта Дзивосны в вегетационном опыте
Почва - дерново-подзолистая легкосуглинистая. Агрохимические параметры: гумус 2,5 %; pH (KCl) - 5,49; Р2О5 - 307 мг/кг; К2О - 160 мг/кг почвы. Емкость вегетационных
сосудов - 5,5 кг почвы. Количество растений на сосуд - 20. Повторность в опыте пятикратная. Действие штамма В. circulans К-81 изучали на двух фонах минерального питания - K0NP и K1NP (N - 150. Р - 100, K1 - 120 мг д.в./кг почвы).
Семена стерилизовали перекисью водорода в смеси с этиловым спиртом (1:1) в течение 30 мин, проращивали и затем инокулировали жидкой культурой В. circulans К-81
(титр 109 кл/мл).
Влияние бактерий на растения ячменя оценивали по динамике накопления биомассы в
фазах кущения, колошения, молочной и восковой спелости. Штамм В. circulans К-81 оказывал стимулирующее действие на накопление биомассы ячменя (фиг. 3). На фоне NPудобрений действие штамма К-81 на накопление биомассы ячменя превышало по эффек-
3
BY 9646 C1 2007.08.30
тивности действие калийных удобрений. Установленная закономерность сохранялась в
фазах молочной и восковой спелости (фиг. 3).
Под действием бактерий отмечено повышение массы зерна в колосе ячменя (табл. 1).
Применение штамма К-81 приводило к увеличению урожая зерна на 11 % на фоне NPудобрений и 14 % на фоне NPK-удобрений. Масса 1000 зерен за счет бактеризации увеличивалась на 10 % (табл. 1).
Показано, что бактеризация ячменя штаммом К-81 на фоне NP по эффективности превышала действие калийных удобрений по влиянию на урожай зерна и массу 1000 зерен.
Варианты для сравнения выделены в табл. 1.
Таблица 1
Структура урожая ячменя Дзивосны под действием штамма К-81
Вариант
Масса зерна в колосе, г
Урожай зерна, г/сосуд
Масса 1000 зерен, г
NP
NPK
NP
NPK
НСР
без бактеризации
0,53
17,0
0,56
18,5(8 %)
Бактеризация проростков B. circulans К-81
0,57
18,8(11 %)
0,62
21,1 (14 %)
0,05
0,63
38,3
39,6 (3 %)
42,2(10 %)
43,6(10 %)
2,4
Пример 4.
Эффективность бактеризации овса сорта Эрбграф в вегетационном опыте
Почва - дерново-подзолистая легкосуглинистая. Агрохимические параметры: содержание гумуса - 2,9 %; рН (KCl) - 5,8; Р2О5 - 280 мг/кг; К2О - 200 мг/кг почвы. Емкость вегетационных сосудов - 5,5 кг почвы. Количество растений на сосуд - 20. Повторность в
опыте пятикратная. Семена стерилизовали перекисью водорода в смеси этиловым спиртом (1:1) в течение 30 мин, проращивали и затем инокулировали жидкой культурой B. circulans K-81 (титр 109 кл/мл).
Действие бактерий К-81 изучали на двух фонах минерального питания - K0NP и K1NP
(N - 140, Р - 100, К1 - 96 мг д.в./кг почвы).
Влияние штамма К-81 на растения оценивали по следующим показателям: динамика
численности внесенных В. circulans К-81 на корнях по фазам развития растений урожай
зерна и масса 1000 зерен.
Установлено, что внесенные при инокуляции бактерии способны заселять ризоплану
овса и поддерживать достаточно высокую плотность популяции (табл. 2), что оказывало
значительный положительный эффект на формирование урожая овса.
Таблица 2
Численность клеток В. circulans К-81 на корнях овса
Фенологические фазы развития овса
Дозы удобрений
кущение
колошение
молочная спелость
численность, тыс./г корней
NP
3200
270
23
NPK
7200
680
53
Установлено положительное влияние бактерий на урожай овса Эрбграф. Внесение
штамма В. circulans K-81 приводило к увеличению массы зерна в метелке на 16-19 % и
массы 1000 зерен на 7-8 % на фонах NP- и NPK-удобрений (табл. 3).
За счет применения В. circulans К-81 урожай зерна повышался до 29,3 и 36,8 г/сосуд
(на 11 и 18 %) на фонах внесения NP и NPK соответственно при урожае на фонах NP и
NPK без бактеризации - 26,5 и 31,1 г/сосуд. Экспериментальные данные показывают, что
4
BY 9646 C1 2007.08.30
бактеризация овса В. circulans K-81 была наиболее эффективна на фоне внесения NPKудобрений (табл. 3).
Таблица 3
Структура урожая овса Эрбграф под действием В. circulans K-81
Вариант
NP
NPK
NP
NPK
НСР05
Масса зерна в меУрожай зерна,
телке, г
г/сосуд
без бактеризации
0,87
26,5
0,89
31,1
Бактеризация проростков A circulans K-81
1,01
29,3(11 %)
1,06
36,8(18 %)
0,04
0,83
Масса 1000 зерен, г
26,2
25,8
27,9 (7 %)
27,8 (8 %)
1,2
Таким образом:
Бактерии Bacillus circulans K-81 способны активно использовать калий из слюд (мусковита и биотита) и гидрослюд (гидромусковита), при этом бактерии не используют калий
глауконита.
Штамм Bacillus circulans K-81 способен использовать различные по степени доступности формы калия в мусковите - не только водорастворимые и обменные, но и труднообменные и необменные формы.
Бактерии Bacillus circulans K-81 значительно стимулируют рост растений, улучшают
структуру урожая, что обеспечивает повышение урожая зерна ячменя на 11-14 %, овса - на
11-18 %.
Бактеризация ячменя Bacillus circulans K-81 на фоне NP-удобрений по эффективности
превышала действие калийных удобрений.
Штамм Bacillus circulans K-81 может быть использован для изготовления биопрепарата, обеспечивающего улучшение калийного питания, стимуляцию роста и повышение урожайности зерновых культур. Для получения биопрепарата бактерии выращивают на
силикатном агаре (pH 6,8-7,2) при температуре 28 °С в течение 5-7 суток, смывают стерильной водой или физиологическим раствором и доводят до концентрации 108-109 кл/мл.
Для использования биопрепарата в условиях сельскохозяйственного производства не требуется дополнительных приспособлений, а производство препарата возможно на предприятиях микробиологического профиля Республики Беларусь.
Применение бактерий Bacillus circulans K-81 экологически обосновано и не оказывает
негативного действия на окружающую среду.
Источники информации:
1. Паспорт штамма бактерий Bacillus mucilaginosus, штамм 4 (музей культур микроорганизмов ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии), 1983.
2. Патент Российской Федерации 2081867, 1997.
3. Патент Российской Федерации 2035507, 1995.
4. Пчелкин В.У. Почвенный калий и калийные удобрения. - М.: Колос, 1966. - С. 336.
5
BY 9646 C1 2007.08.30
Фиг. 1
Фиг. 2
Фиг. 3
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
6
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
271 Кб
Теги
by9646, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа