close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY9685

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2007.08.30
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
BY (11) 9685
(13) C1
(19)
A 01N 63/00
ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS PUMILUS БИМ В-263,
ОБЛАДАЮЩИЙ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ
К МИКРООРГАНИЗМАМ - ВОЗБУДИТЕЛЯМ БОЛЕЗНЕЙ
РАСТЕНИЙ И ЖИВОТНЫХ
(21) Номер заявки: a 20050240
(22) 2005.03.15
(43) 2006.11.30
(71) Заявитель: Государственное научное учреждение "Институт микробиологии Национальной академии
наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Коломиец Эмилия Ивановна; Сверчкова Наталья Владимировна; Романовская Татьяна Витальевна;
Беззубов Валентин Иванович (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт микробиологии Национальной академии
наук Беларуси" (BY)
(56) SU 1817875 А3, 1995.
BY 3962 С1, 2001.
RU 2084152 С1, 1997.
RU 2001129172 А, 2003.
US 6245551 В1, 2001.
BY 9685 C1 2007.08.30
(57)
Штамм бактерий Bacillus pumilus БИМ B-263, обладающий антагонистической активностью к микроорганизмам - возбудителям болезней растений и животных.
Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, в частности к получению биологических средств защиты растений и экологически безопасных дезинфектантов для животноводства и представляет собой новый штамм с широким спектром
антимикробного действия, обуславливающим его фотозащитный и дезинфицирующий
эффект.
Известен штамм Bacillus pumilus NRRL В-30087, активный в отношении грибных патогенов растений [1]. Однако данный штамм не обладает активностью против возбудителей болезней растений и животных бактериальной этиологии.
Известен штамм Bacillus subtilis М-22 ВИЗР, используемый для защиты растений от
фитопатогенных бактерий [2]. Недостатком штамма является узкий спектр антимикробного действия, потребность в дорогостоящих источниках питания, таких как кукурузный
экстракт и продолжительность выращивания трое суток, что негативно сказывается на
экономических показателях ферментационного процесса.
Известен штамм Bacillus subtilis КМБУ 30043 - антагонист фитопатогенных микроорганизмов [3]. Недостатками данного штамма являются подавление развития как фитопатогенной, так и полезной бактериальной и грибной почвенной микрофлоры, а также
использование в основе препарата живых клеток продуцента, а не спор, что негативно
сказывается на сохранности и качестве биопрепарата.
BY 9685 C1 2007.08.30
Известен штамм Bacillus sp. OYK-01-600 [4], активный в отношении токсических и
патогенных бактерий Escherichia coli, Staphylococcus aureus. Однако данный штамм не обладает активностью против бактериальных и грибных инфекций растений.
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является
штамм Bacillus pumilus BKM CR-333D, рекомендованный для получения препарата против фитопатогенных микроорганизмов [5]. Данный штамм использован в качестве прототипа. Показана его активность против фитопатогенных бактерий родов Erwinia,
Pseudomonas, Agrobacterium. Недостатками данного штамма являются:
1. Невысокая антагонистическая активность в отношении указанных бактериальных
фитопатогенов.
2. Узкий спектр антифунгального действия.
3. Отсутствие антагонистической активности в отношении бактериальных патогенов
животных.
4. Вызывает сомнение перспективность использования штамма в производственных
условиях, поскольку основу препарата составляют живые клетки продуцента, а не споры,
что негативно влияет на качество и сохранность препарата, а для культивирования штамма используют дорогостоящие источники питания - дрожжевой экстракт, гидролизат казеина, сахарозу, что экономически невыгодно.
Задачей изобретения является получение нового штамма бактерий Bacillus pumilus
комплексного действия с высокой антагонистической активностью к возбудителям бактериальных болезней растений и животных, способного к росту и продукции антимикробных метаболитов на относительно дешевых и простых по составу питательных средах.
Предлагаемый штамм Bacillus pumilus БИМ В-263 выделен из филлопланы виноградной лозы, депонирован в Коллекции непатогенных микроорганизмов ГНУ "Институт
микробиологии НАН Беларуси" под регистрационным номером БИМ В-263. Культура
также поддерживается в коллекции лаборатории биометода защиты растений ГНУ "Институт микробиологии НАН Беларуси".
Штамм хранится при +4 °С на мясо-пептонном агаре, рН 6,8-7,2; перевивка - 1 раз в 6
месяцев.
Культурально-морфологические свойства
При поверхностном культивировании на мясо-пептонном агаре образует округлые колонии с зубчатым краем, поверхность гладкая, консистенция вязкая, профиль плоский,
чуть приподнятый по краям. Образует по краям ареол ризоидного роста. Клетки подвижные, представляют собой палочки бациллярной формы размером 0,6-0,7 × 1,0-1,3 мкм.
Споры эллипсовидные, расположены центрально или терминально. Спорангиум не раздут. Клетки расположены преимущественно одиночно и в парах, цепочек нет. Окраска по
Граму положительная.
Физиолого-биохимические признаки
Аэроб. Растет при температуре 20-50 °С. Оптимум 30-37 °С.
Отношение к источникам углерода: утилизирует глюкозу, сахарозу, галактозу, маннозу, рамнозу, фруктозу, лактозу, мальтозу, целлобиозу, трегалозу, рафинозу, маннит, инозит, дульцит, разжижает желатину, гидролизует казеин, не утилизирует арабинозу,
глицерин, ксилозу, сорбит, не гидролизует крахмал.
Отношение к источникам азота: ассимилирует сульфат аммония, нитрат аммония, нитрат калия, пептон, кукурузный и дрожжевой экстракт, не ассимилирует мочевину, не восстанавливает нитраты до нитритов.
Другие особенности: характеризуется каталазной активностью, образует ацетоин, не
разлагает тирозин, растет на среде Мейнелла и в 7 % NaCl, не растет на среде Чапека.
Штамм не является патогенным и токсикогенным. Токсикологические исследования
штамма проводились на белых мышах. Установлено, что штамм при внутрижелудочном и
внутрибрюшинном введении его суспензии во всех исследуемых концентрациях от 105 до
2
BY 9685 C1 2007.08.30
1010 не вызывает гибели животных. Отклонений в поведении, поедаемости корма, состоянии шерстного покрова, двигательной активности опытных животных по сравнению с
контрольными не выявлено. При введении фильтрата 7-суточной жидкой культуры
В. pumilus БИМ В-263 подкожно в заднюю лапку в количестве 0,5 мл гибели опытных
животных и некроза тканей на месте введения не выявлено. Проведенные исследования
позволяют сделать заключение, что штамм может использоваться в микробиологическом
производстве.
Штамм В. pumilus БИМ В-263 не фитотоксичен. Фитотоксичность проверяли на растениях редиса. Эта культура является традиционным биотестом, так как обладает высокой
чувствительностью к фитотоксическим препаратам, что обусловлено высокой энергией
прорастания его семян и скороспелостью культуры. Для проведения анализа кончики корня проростков редиса помещают на 1 ч в культуральную жидкость бактерий. Контрольные
проростки помещают в воду и стерильную питательную среду. После этого проростки
раскладывают в чашки Петри на влажную фильтровальную бумагу, помещают в термостат (22-24 °С) и выдерживают несколько дней. Отсутствие задержки в развитии, некротических пятен, ожогов и других изменений по сравнению с контролем свидетельствует о
нетоксичности бактерий В. pumilus БИМ В-263 для высших растений.
Штамм характеризуется широким спектром антагонистического действия, что позволяет использовать его для контроля болезней растений и в качестве дезинфектанта в животноводстве.
Суть предлагаемого изобретения иллюстрируют следующие примеры.
Пример 1
Для изучения спектра антимикробного действия штамма В. pumilus БИМ В-263 использовали метод лунок. Для этого чашки Петри с 2 % агаризованным бульоном Хоттингера заливают вторым 1,2 % агаризованным слоем бульона Хоттингера с тест-культурой
патогена, выросшей до экспоненциальной фазы роста в жидкой питательной среде. Затем
сверлом (диаметром 8 мм) делают лунки, в которые вносили исследуемый антагонист. Результаты оценивали через 1-3 суток после инкубации при 28-30 °С по зонам лизиса или
зонам задержки роста патогенных тест-культур (табл. 1, 2).
Таблица 1
Спектр антибактериальной активности штамма В. pumilus БИМ В-263
В. pumilus BKM CRB. pumilus БИМ В-263
333D (прототип)
Виды бактерий
метод лунок, (ради- метод реплик, (стерадиус зоны подавления
ус зоны подавления пень подавления
роста, мм
роста, мм)
роста, %)
Патогены растений
Erwinia caroto-vora
10
85
1,5
Pseudomonas lachry10
85
10
mans
Pseudomonas syringae
12-14
100
3-5
Xanthomonas beticola
13-15
100
Нет данных
Xanthomonas campes10-12
98
8-10
tris
Патогены животных
Escherichia coli
9
95
Staphylococcus aureus
10
98
Streptococcus sp.
10-11
92
-
3
BY 9685 C1 2007.08.30
Таблица 2
Спектр антифунгальной активности штамма В. pumilus БИМ В-263
B. pumilus
В. pumilus BKM
БИМ В-263
CR-333D (прототип)
Виды грибов
метод лунок (радиус метод реплик (стерадиус зоны подавзоны подавления пень подавления росления роста, мм
роста, мм)
та, %)
Alternaria alternata
121
85
Alternaria brassica
12.52
75
2
Botrycis cinerea
13
94,6
20
3
Colletotrichum gloeo19
86,5
sporioides
Fusarium culmorum
122
68
Fusarium oxysporum
102
60
20
Fusicladium dendriticum
102
65
2
Helminthosporium sati8
51
10
vum
Nectria galligena
71
58
Phytophthora cinnamomi
233
85
3
Pleiochaeta setosa
11
75
3
Rhizoctonia solani
12-16
96
* 1Зона лизиса тест-культур; 2зона ослабленного роста тест-культур; 3зона нарастания
бактерий В. pumilus БИМ В-263 на тест культуры.
Методом лунок определяли также антагонистическую активность штамма В. pumilus
БИМ В-263 в отношении сапрофитой микрофлоры (табл. 3).
Таблица 3
Антагонистическая активность штамма В. pumilus БИМ В-263
в отношении сапрофитной микрофлоры
Сапрофитные микроРадиус зоны подавления роста, мм
организмы
В. pumilus БИМ В-263
В. pumilus BKM CR-333D
(прототип)
Виды бактерий
Pseudomonas fluores-cens
нет данных
Bacillus subtilis
нет данных
Bacillus thuringiensis
нет данных
Виды грибов
Trichoderma viride
нет данных
Sacchoromyces cere-visiae
нет данных
Для определения степени подавления патогенных микроорганизмов исследуемой
культурой использовали метод реплик. Для этого чашки Петри с 2 % агаризованным
бульоном Хоттингера заливают вторым 1,2 % агаризованным слоем бульона Хоттингера с
антагонистом В. pumilus БИМ В-263 (титр -5,4*109 клеток, мл) в количестве 1 мл антагониста и 4 мл среды. На поверхность подготовленных таким образом чашек Петри с антагонистом репликатором наносят бактериальные и грибные патогенны. Совместное
инкубирование проводят при 28-30 °С. Степень подавления роста тест-объектов оценивали через 1-5 суток (табл. 1, 2).
Анализ полученных данных свидетельствует о том, что исследуемый штамм имеет
широкий спектр действия: ингибирует развитие фитопатогенных грибов и бактериальных
4
BY 9685 C1 2007.08.30
возбудителей болезней растений и животных, не оказывая негативного влияния на полезную микрофлору, что является преимуществом заявляемого штамма В. pumilus БИМ В263 по сравнению с прототипом.
Пример 2
Бактерии штамма В. pumilus БИМ В-263 выращивают в условиях глубинной ферментации в течение 36-48 часов при 28-30 °С на питательных средах, основу которых составляют соли среды Мейнелла (г/л: K2HPO4·3H2O - 7,0; KH2PO4 - 3,0; MgSO4·7H2O - 0,1;
NH4NO3 - 1,0; Na-цитрат - 0,5), а в качестве источников углерода используют мелассу, как
более дешевый субстрат, или сахарозу. Оценивают титр клеток и спор. Согласно полученным данным (табл. 4) заявляемый штамм В. pumilus БИМ В-263 способен к росту на среде
с более дешевыми источниками углеводного и азотного питания - мелассой и аммонием
азотнокислым, а также характеризуется активным спорообразованием, что положительно
влияет на качество и сохранность препарата, в отличие от прототипа, где для приготовления препарата путем выращивания штамма на агаризованной среде используется сахароза,
дрожжевой экстракт, гидролизат казеина, что экономически невыгодно.
Таблица 4
Показатели роста и спорообразования штамма В. pumilus БИМ В-263
Продолжительность выращивания
В. pumilus БИМ В-263
Источник углерода
36 ч
48 ч
Меласса
Титр, клеток/мл
3,9*109
5,4*109
Доля спор, %
65-70
75-80
Сахароза
Титр, клеток/мл
4,1*109
5,5*109
Доля спор, %
60-65
75-78
Пример 3
В модельных экосистемах с почвой оценен фитозащитный эффект (на проростках ячменя) жидкого препарата на основе штамма В. pumilus БИМ В-263. Снижение инфекционного фона способствовало более активному развитию проростков ячменя (Hordeum
vulgare L.) (табл. 5).
Статистически достоверный фитозащитный эффект биопрепарата на основе штамма
наблюдался при норме внесения препарата в почву 2,0-4,0 %. При этом средняя масса
проростков на почве, предварительно инфицированной F. culmorum F - 55043 или P. syringae 181, увеличивается соответственно на 17-23 % и 10-24 %. Наряду с фитозащитным отмечено ростстимулирующее действие препарата на развитие растений (табл. 5).
Таблица 5
Влияние биопрепарата на основе штамма В. pumilus БИМ В-263 на развитие
проростков ячменя в модельных экосистемах
Масса проростков
Концентрация
(в пересчете на 1 растение)
№
Варианты
биопрепарата, %
п/п
% к контролю
от веса почвы
мг
К1
К2
К3
1. Почва (К1)
12,9±0,6
100,0
2. Почва +F. culmorum
12,1 ±0,4
93,8
100,0
УКМ F-55043 (К2)
3. Почва +P. syringae 181 (К3)
12,2±0,4
94,6
100,0
4. Почва +В. pumilus
1
13,0±0,6
100,8
БИМ В-263
2
14,0±0,7
108,5
4
14,7±0,7
114,0
5
BY 9685 C1 2007.08.30
№
п/п
5.
6.
Варианты
Почва +В. pumilus
БИМ В-263
+F. culmorum УКМ F-55043
Почва +В. pumilus
БИМ В-263
+P. syringae 181
НСР 0,05
Продолжение табл. 5
Масса проростков
Концентрация
(в пересчете на 1 растение)
биопрепарата, %
% к контролю
от веса почвы
мг
К1
К2
К3
1
13,7±0,6
106,2
113,2
2
14,9±0,7
115,5
123,1
4
14,2±0,6
110,1
117,4
1
13,1±0,5
101,6
107,4
2
13,4±0,5
103,9
109,8
4
15,1±0,7
117,1
123,8
0,6
4,5
2,0
3,5
Результаты лабораторных исследований подтверждены полевыми опытами, проведенными сотрудниками РУП "БелИЗР" НАН Беларуси в саду интенсивного типа колхоза "Узденский" Узденского района Минской области против возбудителей раковых болезней
яблони (Pseudomonas siryngae pv. syringae, Nectria galligena Bres.), в которых показана эффективность использования биопрепарата на основе штамма В. pumilus БИМ В-263 в составе замазок для залечивания раковых ран яблони. Так, при нанесении препарата
непосредственно на рану с последующим использованием лечебной замазки биологическая эффективность составила 54 %, что в 2,6 раза выше, чем при использовании лечебной
замазки без препарата. В контрольном варианте без лечения наблюдали увеличение площади ран (на 55,4 %) (табл. 6).
Таблица 6
Биологическая эффективность штамма В. pumilus БИМ В-263
при лечении раковых ран плодовых
Размер ран
Площадь за- Биологическая
Вариант
живления ран, эффективность,
После
До лечения
см2
%
лечения
Контроль
44,6
69,3
-24,7
Лечебная замазка
21,7
17,0
4,7
21,7
(глина-коровяк 1:1)
ЛЗ + Байлетон
37,8
27,7
10,1
26,7
(5 г/кг)
ЛЗ + Пентафаг
43,2
29,5
13,7
31,7
(20 мл/кг)
КЖ В. pumilus БИМ В-263
21,9
10,0
11,9
54,3
(20 мл/кг) + ЛЗ
Пример 4
Эффективность действия биологического препарата на основе штамма В. pumilus
БИМ В-263, используемого в качестве дезинфектанта, была оценена по его влиянию на
инфекционный фон животноводческих помещений после содержания в них животных.
Испытания опытного образца препарата проводили на свинокомплексе "Борисовский" Борисовского района Минской области в секциях поросят на доращивании. Опытную секцию после содержания в ней молодняка до 106-ти дневного возраста обрабатывали
биопрепаратом в концентрации 3,0x108 клеток/мл и 2,4x107 спор/мл аэрозольным методом. Наполнение животноводческой секции аэрозолью биопрепарата было хорошим при
видимости несколько метров. Пробы воздуха брали до распыления препарата, а затем через двое, семеро, четырнадцать суток после обработки.
6
BY 9685 C1 2007.08.30
Результаты исследования микробного обсеменения воздуха животноводческой секции
до и после дезинфекционной обработки биопрепаратом представлены в таблице 7.
Таблица 7
Рост общей и санитарно-показательной микрофлоры после обработки
биопрепаратом на основе штамма В. pumilus БИМ В-263
Группа кишечной
Группа стафилококкоОбщая микрофлора
палочки
стрептококковая
Пробы
эффективэффективэффектив3
3
3
тыс/м
ность обтыс/м
ность обратыс/м
ность обраработки, %
ботки, %
ботки, %
До обработки
120
4,69
8,3
После обработки
через:
2 суток
26,4
78
100
1,34
84
7 суток
50,1
58
0,12
87,5
2,7
68
14 суток
119
0,75
84
16,6
Таким образом, использование биопрепарата на основе штамма В. pumilus БИМ В-263
в качестве дезинфектанта позволило снизить обсемененность воздуха секции для молодняка свиней бактериями группы кишечной палочки на 100-87 %, бактериями группы стафилококко-стрептококковой на 84-68 %, общей микрофлорой на 78-58 % (через двое и
семеро суток после обработки соответственно). При этом рост бактерий группы кишечной
палочки практически отсутствовал и на 14-е сутки после обработки.
Полученные данные свидетельствуют о перспективности использования штамма В.
pumilus БИМ В-263 с широким спектром антимикробного действия для биологического
контроля патогенов сельскохозяйственных растений и животных.
Источники информации:
1. Патент US № 6245551 В1, МПК С 12N 1/20, 2001.
2. Патент RU № 2084152 С1, МПК А 01N 63/00, С 12N 1/20// (С 12N 1/20, С 12R
1:125), 1997.
3. Патент BY № 3962 С1, МПК A 01N 63/00, 2001.
4. Патент US № 6399056 В1, МПК A 01N 63/00, 2002.
5. А.с. SU № 1817875 A3, МПК A 01N 63/00, С 12N 1/20, 1995 (прототип).
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
7
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
128 Кб
Теги
by9685, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа