close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY9770

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
BY (11) 9770
(13) C1
(19)
(46) 2007.10.30
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
C 07J 41/00
КОНЪЮГАТ 24-ЭПИКАСТАСТЕРОНА С БЫЧЬИМ
СЫВОРОТОЧНЫМ АЛЬБУМИНОМ В КАЧЕСТВЕ ИММУНОГЕНА
(21) Номер заявки: a 20050846
(22) 2005.08.26
(43) 2007.04.30
(71) Заявитель: Государственное научное учреждение "Институт биоорганической химии Национальной
академии наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Хрипач Владимир Александрович; Свиридов Олег Васильевич;
Литвиновская Раиса Павловна;
Прядко Андрей Георгиевич; Драч
Светлана Васильевна; Матвеенцев
Виталий Демидович; Демченко Наталья Ивановна (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(56) YOKOTA T. et al. J. Plant Growth
Regul., 1990, v. 9, p. 151-159.
SCHLAGNHAUFER C.D. et al. Supplement to: Plant Physiology, 1988, v.
86, No 4, p. 113.
Теория и практика иммуноферментного анализа. - Москва: Высшая школа,
1991. - С. 176-183.
Хрипач В.А. и др. Брассиностероиды. Минск: Навука i тэхнiка, 1993. - С. 1521.
(57)
Конъюгат 24-эпикастастерона с бычьим сывороточным альбумином формулы:
BY 9770 C1 2007.10.30
OH
HO
,
HO
HO
NOCH2CONH-БСА
где БСА - бычий сывороточный альбумин в качестве иммуногена.
Изобретение относится к области иммунохимического анализа фитогормонов брассиностероидов, а именно к конъюгату 24-эпикастастерона с бычьим сывороточным альбумином формулы I:
BY 9770 C1 2007.10.30
OH
OH
HO
,
HO
NOCH2CONH-БСА
где БСА - бычий сывороточный альбумин, который может быть использован в качестве
иммуногена для получения антител, специфичных к 24R-метилбрассиностероидам.
Брассиностероиды - природные низкомолекулярные биорегуляторы, которые являются гормонами растений [1]. Они присутствуют во всех растительных объектах и обладают
ростмодулирующим и адаптогенным действием. Содержание брассиностероидов в растениях очень низко – 10-5-10-9 % и менее. В очень малых концентрациях они проявляют и
свое биологическое действие, поэтому методы анализа брассиностероидов должны обладать высокой чувствительностью, избирательностью, простотой в исполнении и быть доступными. Развитие в последнее время методов, основанных на использовании антител, в
частности иммуноферментного анализа, требует наличия иммуногена. Брассиностероиды
сами по себе не обладают иммуногенностью, поэтому для получения иммунного ответа у
животных они могут быть использованы для иммунизации в виде конъюгатов с белками
(через соответствующие гаптены).
Известен конъюгат брассинолида с БСА формулы:
OH
OH
HO
,
O
O
O
O
O
БСА
в котором связь брассиностероида с белком осуществляется через 3-гидроксигруппу [8]. К
недостаткам данного конъюгата следует отнести, прежде всего, связывание 3-гидроксигруппы, которая относится к группам, ответственным за биологическую активность брассиностероидов, что может сказаться отрицательно на специфичности вырабатываемых
животными антител. Кроме того, наличие в молекуле лабильной сложноэфирной связи
между молекулой стероида и остатком янтарной кислоты делает этот конъюгат нестабильным [3].
Наиболее близким к заявляемому является конъюгат кастастерона с БСА формулы:
2
BY 9770 C1 2007.10.30
OH
OH
HO
,
HO
NOCH2CONH-БСА
который предложен авторами для радиоиммуноанализа брассиностероидов [4]. Конъюгат
получен на основе 24S-метилбрассиностероида - кастастерона, но не позволил получить
антитела, специфичные даже к этой группе брассиностероидов.
В научной и патентной литературе отсутствуют упоминания о конъюгатах брассиностероидов, которые были получены и могли бы быть использованы для получения антител, специфичных к 24R-метилбрассиностероидам, конкретно к 24-эпикастастерону и
эпибрассинолиду.
Целью изобретения является конъюгат 24-эпикастастерона и бычьего сывороточного
альбумина, позволяющий получить высокоспецифические антитела к 24R-метилбрассиностероидам.
Поставленная цель достигается заявляемым соединением I, которое получают взаимодействием N-оксисукцинимидного эфира 6-O-карбоксиметоксиламиноксима 24-эпикастастерона
(гаптена) с бычьим сывороточным альбумином в водно-диоксановом растворе (рН 8,5),
очисткой путем диализа и лиофилизацией конъюгата.
Сущность изобретения подтверждается примерами конкретного выполнения.
Пример 1
Растворяют 0,11 г (0,21 ммоль) {[(22R,23R,24R)-2α,3α,22,23-тетрагидрокси-24-метил5α-холест-6-илиденамино]окси} уксусной кислоты и 0,019 г (0,165 ммоль) N-оксисукцинимида в 2 мл абсолютного диоксана, охлаждают до 5 °C и при перемешивании добавляют раствор 0,029 г (0,14 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 0,5 мл абсолютного
диоксана. Реакционную смесь перемешивают 30 мин при 5 °C и 20 часов при комнатной
температуре. Выпавшую в осадок дициклогексилкарбомочевину отфильтровывают,
фильтрат упаривают. Остаток растворяют в этилацетате, промывают водой, сушат безводным Na2SO4, упаривают. Выход N-сукцинимидного эфира 6-О-КМО-эпикастастерон-NOS
0,105 г (92 %). Маслообразный продукт, спектр 1H NMR: 0,66 (с, 3Н, 18-Me), 0,74 (с, 3Н,
19-Me), 0,8-1,00 (m, 12Н, 21-, 26-, 27- и 28-Me), 2,88 (с, 4Н, -C(O)-CH2-CH2-C(O)-), 3,063,24 (m, 2H), 3,28-3,38 (m, 2H), 3,78 (m, 1H), 3,92-4,00 (m, 1H), 4,88 (m, 2Н, -О-СН2-СО).
ИК спектр (пленка): 3440, 2950, 2880, 1755, 1730, 1725, 1390, 1215, 1090.
Растворяют 72 мг (101,55 мкмоль) N-оксисукцинимидного эфира 6-О-карбоксиметоксиламиноксима 24-эпикастастерона в 7 мл диоксана и добавляют 0,1 г (1,4 мкмоль)
БСА в 7 мл 0,1 M раствора бикарбоната натрия (рН 8.3). Перемешивают в течение 20 часов при комнатной температуре.
Реакционную смесь подвергают диализу при 20 °C против дистиллированной воды в
течение 36 часов, затем против 1 % суспензии активированного угля в воде 20 часов, лиофилизуют и замораживают при температуре -20 °C.
Содержание гаптена в конъюгате, определенное спектрофотометрически, составляло
около 25 моль гаптена на 1 моль белка.
3
BY 9770 C1 2007.10.30
Заявляемый конъюгат получают с практически количественным выходом и высокой
степенью посадки антигена, что обусловлено стабильностью соединения как в процессе
синтеза, так и очистки и выделения.
Синтезированный конъюгат используют для получения антител, специфичных к 24Rметилбрассиностероидам (24-эпибрассинолид и 24-эпикастастерон), что подтверждается
примером конкретного выполнения.
Пример 2
Группу из десяти кроликов иммунизируют конъюгатом эпикастастерон-БСА с плотностью посадки 25 молекул стероида на 1 молекулу белка. Каждому кролику вводят подкожно в 10-15 точек спины по 1 мг конъюгата, предварительно растворенного в 0,5 мл
фосфатно-буферного раствора поваренной соли (рН 7,4) и эмульгированного в равном
объеме полного адъюванта Фрейнда. Интервалы между инъекциями составляли 3 недели.
Иммунизацию продолжают в течение 6 месяцев, осуществляя периодический отбор проб
крови из ушной вены животных. Полученные образцы сыворотки тестируют на наличие
связывающей способности в отношении 24-эпикастастерона и определяют их титры и
значения констант ассоциации (Ка). Титр определяют как рабочее разведение антисыворотки, обеспечивающее максимальную чувствительность тест-системы при таком связывании конъюгата, которое позволяет построить калибровочный график в диапазоне 2,50,2 OE.
Таблица 1
Характеристики антисывороток, полученных при иммунизации животных
конъюгатом 24-эпикастастерона с БСА
Антисыворотка
Титр
Ка × 109 М-1
Al
1,5
1:10000
А2
1,9
1:20000
Определение оптимального титра антисыворотки для применения в ИФА показало,
что ее разбавление в 20000 раз позволяет обеспечить приемлемые условия определения
как эпикастастерона, так и эпибрассинолида, проявивших, как и предполагалось, сравнимые параметры связывания с антителами.
Специфичность. Перекрестная реакция антител к 24-эпикастастерону с брассиностероидами и стероидами других классов приведена в табл. 2.
Таблица 2
Кросс-реактивность антисыворотки А2 с различными стероидами
Стероид
Связывание по отношению к Э (%)
1. Эпикастастерон
100
2. Эпибрассинолид
80-100
3. Гомокастастерон
15,0
4. 22S,23S-эпикастастерон
7,2
5. 22S,23S-эпибрассинолид
6,4
6. Кастастерон
3,0
7. Брассинолид
0,45
8. Гомобрассинолид
0,37
9. Экдистерон
0,3
10. (22R,23R)-22,23-дигидроксистигмаст-2-ен-6-он
0,05
11. 22S,23S-гомокастастерон
0,04
12. Стигмастерин
<0,01
13. 24-эпиэргост-2-ен-6-он
<0,01
<0,01
14. 2α,3α-дигидроксиэргост-6-он
15. Кампастерин
<0,01
4
BY 9770 C1 2007.10.30
Стероид
16. Эргостерин
17. (22R,23R)-22,23-дигидрокси-3α,5-цикло-5αстигмастан-6-он
18. (22S,23S)-22,23-дигидрокси-3α,5-цикло-5α-стигмастан-6-он
19. Холестерин
20. Прегненолон
21. Андростенолон
Продолжение табл. 2
Связывание по отношению к Э (%)
<0,01
<0,01
<0,01
<0,01
<0,01
<0,01
Заявляемый конъюгат получается с высоким выходом, стабильностью, высокой степенью посадки гаптена на белок, обеспечивает необходимую иммуногенность и позволяет
получать антитела, специфичные к 24-эпибрассинолиду и 24-эпикастастерону.
Источники информации:
1. Хрипач В.А., Лахвич Ф.А., Жабинский В.Н. Брассиностероиды. - Минск: Навука i
тэхнiка, 1993. - 288 с.
2. Carl D. Schlagnhaufer, Richard N. Arteca and Allen T. Phillips. Monoclonal antibodies
against brassinosteroid a new plant growth regulating compound. Plant Physiol. (Suppl.) - 1988. Vol. 86. - P. 113.
3. Carter M.C., Meyerhoff M.E. // J. Immunol. Methods. -1985. - Vol. 81. - P.245.
4. Yokota T., Wanabe S., Ogino Y., Yamaguchi I., Takahashi N. // J. Plant Growth Regul. 1990. - Vol. 9. - P. 151.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
5
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
2
Размер файла
96 Кб
Теги
by9770, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа