close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY9771

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
BY (11) 9771
(13) C1
(19)
(46) 2007.10.30
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
C 07J 41/00
КОНЪЮГАТ 24-ЭПИКАСТАСТЕРОНА С ПЕРОКСИДАЗОЙ
ХРЕНА В КАЧЕСТВЕ МЕЧЕНОГО АНТИГЕНА
ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ
24R-МЕТИЛБРАССИНОСТЕРОИДОВ
(21) Номер заявки: a 20050845
(22) 2005.08.26
(43) 2007.04.30
(71) Заявитель: Государственное научное учреждение "Институт биоорганической химии Национальной
академии наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Хрипач Владимир Александрович; Свиридов Олег Васильевич;
Литвиновская Раиса Павловна;
Прядко Андрей Георгиевич; Драч
Светлана Васильевна; Матвеенцев
Виталий Демидович; Новик Татьяна
Валентиновна (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(56) YOKOTA T. et al. J. Plant Growth Regul. 1990. - V. 9. - P. 151-159.
Теория и практика иммуноферментного анализа. - Москва: Высшая школа,
1991. - С. 176-183.
Хрипач В.А. и др. Брассиностероиды. Минск: Навука i тэхнiка, 1993. - С. 1521.
(57)
Конъюгат 24-эпикастастерона с пероксидазой хрена формулы:
BY 9771 C1 2007.10.30
OH
HO
HO
,
HO
NOCH2CONH-ПХ
где ПХ - пероксидаза хрена,
в качестве меченого антигена для иммуноферментного определения 24R-метилбрассиностероидов.
Изобретение относится к области иммунохимического анализа фитогормонов брассиностероидов, а именно к конъюгату 24-эпикастастерона с пероксидазой хрена формулы I:
BY 9771 C1 2007.10.30
OH
OH
HO
,
HO
NOCH2CONH-ПХ
где ПХ - пероксидаза хрена,
который может быть использован в качестве меченого антигена в аналитической тестсистеме для иммуноферментного определения 24R-метилбрассиностероидов - 24-эпикастастерона и 24-эпибрассинолида.
Брассиностероиды - природные низкомолекулярные биорегуляторы, которые являются гормонами растений [1]. Они присутствуют во всех растительных объектах и обладают
ростмодулирующим и адаптогенным действием. Содержание брассиностероидов в растениях очень низко - 10-5-10-9 % и менее. В очень малых концентрациях они проявляют и
свое биологическое действие.
В настоящее время неизвестны конъюгаты брассиностероидов с пероксидазой хрена
(или другой иммуноферментной меткой), которые были получены и могли бы быть использованы в иммуноаналитических системах для определения 24-эпикастастерона и эпибрассинолида.
Целью изобретения является ранее неизвестный конъюгат 24-эпикастастерона и пероксидазы хрена, который может быть использован в качестве меченого антигена в иммуноферментном анализе 24R-метилбрассиностероидов - 24-эпикастастерона и 24-эпибрассинолида.
Поставленная цель достигается заявляемым конъюгатом I, который получают взаимодействием 6-О-карбоксиметоксиламиноксима 24-эпикастастерона через N-оксисукцинимидный эфир с пероксидазой хрена в водной среде в присутствии гидрокарбоната калия
(рН 8,5), очисткой на сефадексе и замораживанием раствора в глицерине.
Сущность изобретения подтверждается примерами конкретного выполнения.
Пример 1
Растворяют 0,11 г (0,21 ммоль) {[(22R,23R,24R)-2α,3α,22,23-тетрагидрокси-24-метил5α-холест-6-илиденамино]окси}уксусной кислоты и 0,019 г (0,165 ммоль) N-оксисукцинимида в 2 мл абсолютного диоксана, охлаждают до 5 °C и при перемешивании добавляют раствор 0,029 г (0,14 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 0,5 мл абсолютного
диоксана. Реакционную смесь перемешивают 30 мин при 5 °C и 20 ч при комнатной температуре. Выпавшую в осадок дициклогексилкарбомочевину отфильтровывают, фильтрат
упаривают. Остаток растворяют в этилацетате, промывают водой, сушат безводным
Na2SO4, упаривают. Выход N-сукцинимидного эфира 6-О-КМО-эпикастастерон-NOS
0,105 г (92 %). Маслообразный продукт, спектр 1H NMR: 0,66 (с, 3Н, 18-Me), 0,74 (с, 3Н,
19-Me), 0,8-1,00 (m, 12H, 21-, 26-, 27- и 28-Me), 2,88 (с, 4Н, -C(O)-CH2-CH2-C(O)-), 3,063,24 (m, 2H), 3,28-3,38 (m, 2H), 3,78 (m, 1H), 3,92-4,00 (m, 1H), 4,88 (m, 2Н, -О-СН2-СО).
ИК-спектр (пленка): 3440, 2950, 2880, 1755, 1730, 1725, 1390, 1215, 1090.
К раствору 6 мг пероксидазы хрена в 600 мл дистиллированной воды в присутствии
2-3 капель 0,1 М раствора гидрокарбоната натрия (рН 8,35) добавляют раствор 2 мг
(0,003 ммоль) N-сукцинимидного эфира 6-О-КМО-эпикастастерон-NOS, перемешивают
при комнатной температуре в течение 1,5 ч. Очищают на колонке с сефадексом, элюент 2
BY 9771 C1 2007.10.30
дистиллированная вода. Собирают окрашенную фракцию (желто-коричневая), затем разбавляют глицерином (1:2) и хранят в морозильнике (при -18 °C).
Синтезированный конъюгат используют в качестве меченого антигена в иммуноаналитической системе для количественного определения 24R-метилбрассиностероидов (24эпибрассинолида и 24-эпикастастерона), что подтверждается примером конкретного выполнения.
Пример 2
Для проведения анализа в лунки планшета с иммобилизованными антителами вносят
по 50 мкл калибровочных проб или исследуемых растворов брассиностероидов и 100 мкл
рабочего раствора конъюгата 24-эпикастастеронпероксидаза хрена. Планшеты инкубируют в течение 2 ч при 37 °C без встряхивания, затем удаляют жидкость из лунок и промывают их 1 % раствором NaCl, содержащим 0,02 % Tween 20. Для проведения цветной
реакции в лунки немедленно вносят по 150 мкл раствора 3,3', 5,5'-тетраметилбензидина в
субстратном буфере и инкубируют планшет в течение 15 мин при 37 °C без доступа света.
Реакцию останавливают добавлением в каждую лунку по 50 мкл стоп-реагента и не позже
чем через 30 мин проводят измерение оптической плотности на ИФА-ридере при длине
волны 450 нм. Результаты анализа рассчитывают методом интерполяции по калибровочной кривой [2].
Концентрация нативного антигена, при которой достигается замещение половины меченого антигена в комплексе антитело-антиген, составила 7 нмоль/л в случае 24-эпикастастерона и 11 нмоль/л в случае 24-эпибрассинолида.
Заявляемый конъюгат 24-эпикастастерона с пероксидазой хрена получается с высоким
выходом, обладает стабильностью, обеспечивает необходимую иммуногенность метки и
позволяет проводить количественное определение 24-эпибрассинолида и 24-эпикастастерона методом иммуноферментного анализа.
Источники информации:
1. Хрипач В.А., Лахвич Ф.А., Жабинский В.Н. Брассиностероиды. - Минск: Навука i
тэхнiка, 1993. - 288 с.
2. Егоров A.M. Теория и практика иммуноферментного анализа. - M.: Высш. шк.,
1991.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
3
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
73 Кб
Теги
by9771, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа