close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY9975

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2007.12.30
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
C 07H 19/00
C 12P 19/00
C 12P 1/04
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 9-(β
β-D-АРАБИНОФУРАНОЗИЛ)2-ФТОРАДЕНИНА
(21) Номер заявки: a 20041245
(22) 2004.12.29
(43) 2006.06.30
(71) Заявители: Государственное научное
учреждение "Институт микробиологии Национальной академии наук
Беларуси"; Государственное научное учреждение "Институт биоорганической химии Национальной
академии наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Ерошевская Людмила Анатольевна; Барай Владимир Николаевич; Калиниченко Елена Николаевна; Михайлопуло Игорь Александрович; Зинченко Анатолий Иванович
(BY)
BY 9975 C1 2007.12.30
BY (11) 9975
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатели: Государственное
научное учреждение "Институт микробиологии Национальной академии
наук Беларуси"; Государственное научное учреждение "Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(56) US 4210745, 1980.
JP 7138280, 1995.
JP 59013800, 1984.
(57)
Способ получения 9-(β-D-арабинофуранозил)-2-фтораденина, заключающийся в том,
что готовят реакционную смесь, содержащую в 0,03-0,05 М фосфатном буфере 55-65 мМ
2-фтораденина, 110-130 мМ урациларабинозида и 2-2,5 мас. % клеток Escherichia coli БМ21, и инкубируют ее при рН 6,8-7,2 и температуре 58-62 °С в течение 4 суток с
последующим выделением целевого продукта.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к ферментативным способам
получения 9-(β-D-арабинофуранозил)-2-фтораденина (2-фтор-ара-А) - модифицированного нуклеозида, который в фосфорилированной форме (в виде 5'-монофосфата) применяется для терапии ряда онкогематологических заболеваний [1-3] и может быть использован
для получения активной субстанции при производстве соответствующих лекарственных
препаратов.
Известен химический способ получения 2-фтор-ара-А соединением 2,6-дихлорпурина
(азотистое основание) с 2,3,5-три-О-бензил-В-арабинозилхлоридом (донор арабинофуранозы) в 9-(2,3,5-три-О-бензил-β-D-арабинофуранозил)-2,6-дихлорпурин с последующей
трансформацией в 2 стадии в 9-(2,3,5-три-О-бензил-β-D-арабинофуранозил)-2,6-диаминопурин и далее реакцией Шиманна в соответствующий 2-фтор-6-амино-арабинофура-
BY 9975 C1 2007.12.30
нозилпурин. Удаление О-бензильных групп приводит к 2-фтор-ара-А с суммарным выходом 4,6 % [4].
Недостатками указанного способа получения 2-фтор-ара-А являются трудоемкость
процесса и низкий выход целевого продукта.
Наиболее близким к заявляемому является способ получения 2-фтор-ара-А [5] (прототип) соединением 2,6-диаминопурина с 2,3,5-три-О-бензил-D-арабинозилхлоридом в
9-(2,3,5-три-О-бензил-β-D-арабинофуранозил)-2,6-диаминопурин и далее реакцией Шиманна в соответствующий 2-фтор-6-амино-арабинофуранозилпурин. Удаление О-бензильных
групп приводит к 2-фтор-ара-А с выходом 17,5 %. В этом способе модифицированы две
заключительные стадии предыдущего способа-аналога [4], что позволило увеличить выход вдвое, однако, из-за низкого выхода при соединении 2,6-диаминопурина с 2,3,5-триО-бензил-D-арабинозилхлоридом (азотистого основания с донором арабинозы) (40 %)
суммарный выход не превышает 17,5 %.
Недостатками способа-прототипа получения 2-фтор-ара-А являются многостадийность и трудоемкость процесса, а также низкий выход целевого продукта, что обусловлено недостаточной специфичностью химической стадии арабинозилирования (соединения
использованных азотистых оснований с донором арабинофуранозы), приводящей к образованию побочных продуктов.
Задачей предполагаемого изобретения является повышение выхода целевого продукта
и упрощение процесса его получения.
Поставленная задача решается путем воздействия биокатализатора в виде бактериальных клеток на смесь 2-фтораденина (азотистое основание) и урациларабинозида (донор
арабинофуранозы) в 0,03-0,05 М фосфатном буфере (pH 6,8-7,2) при 58-62 °С в течение 4
суток, причем концентрация 2-фтораденина в исходной смеси составляет 55-65 мМ, а урациларабинозида - 110-130 мМ. В качестве бактериальных клеток используют клетки
Escherichia coli БМ-21 в концентрации 2-2,5 мас. %.
Целевой продукт выделяют из реакционной смеси известными приемами.
Заявляемый способ описывается следующим уравнением реакции:
2-Фтораденин
NH2
N
N
N
N
H
Урацил
O
N
F
N
H
O
Клетки Escherichia
coli БМ-21
O
NH2
N
HO
O
N
N
N
O
HO
HO
O
N
N
F
HO
OH
OH
Ара-У
2-Фтор-ара-А
Штамм Escherichia coli БМ-21 депонирован в Коллекции непатогенных микроорганизмов Института микробиологии НАН Беларуси под коллекционным номером БИМ
В-200 Д.
2
BY 9975 C1 2007.12.30
Процесс ведут в фосфатном буфере (pH 6,8-7,2) в связи с тем, что присутствующий в
бактериальных клетках фермент - уридинфосфорилаза, действие которого необходимо для
замещения урацила в молекуле ара-У на 2-фтораденин с образованием 2-фтор-ара-А, проявляет свою активность только в присутствии ионов неорганического фосфата.
Таким образом, поставленная задача решается путем замены химической стадии арабинозилирования азотистого основания на ферментативную (причем в качестве исходного
азотистого основания берется 2-фтораденин). Следует отметить, что ферментативные способы получения 2-фтор-ара-А в литературе не описаны, а возможность использования
бактериальных клеток, в т.ч. клеток Escherichia coli БМ-21, для синтеза 2-фтор-ара-А из
неприродного субстрата - 2-фтораденина - не является очевидной.
По мнению авторов, только сочетание указанных выше признаков способа приводит к
решению поставленной задачи. Это сочетание признаков является новым, так как не является очевидным для специалистов и не встречается в общедоступной патентной и научнотехнической литературе.
Заявляемый способ иллюстрируют нижеприведенные примеры его конкретного осуществления.
Пример 1.
Получение 2-фтор-ара-А в оптимальных условиях проведения процесса.
Реакционную смесь (1 л), содержащую 9,19 г 2-фтораденина (60,0 ммоль), 29,3 г ара-У
(120,0 ммоль), 0,04 М К-фосфатный буфер (pH 7,0) и 2,25 мас. % (в расчете на сухую массу) клеток Е. coli БМ-21, инкубируют 4 суток при 60 °С с перемешиванием. За приростом
количества целевого продукта в смеси следят с помощью тонкослойной хроматографии.
После прекращения прироста 2-фтор-ара-А в реакционной смеси ее для растворения
целевого продукта разводят в 3 раза горячей дистиллированной водой, добавляют для коагуляции клеток 1 М раствор CaCl2 до конечной концентрации 15 мМ и полученную суспензию подвергают горячему фильтрованию через бумажный фильтр. В фильтрат вносят
70 мл 0,5 М раствора этилендиаминтетрауксусной кислоты и помещают его на холод (бытовой холодильник) на 24 ч.
Сформировавшийся осадок собирают на стеклянном фильтре под вакуумом, промывают 50 мл охлажденной дистиллированной воды и высушивают в суховоздушном сушильном шкафу при температуре 60 °С в течение 5 ч. Получают 13,69 г (48 ммоль)
2-фтор-ара-А, что соответствует 80 %-ому выходу в расчете на взятый в реакцию
2-фтораденин.
При хроматографировании на тонкослойных пластинках "Silufol-UV254" фирмы
"Serva" (Германия) в системе растворителей изопропанол:25 %-ный водный аммиак (7:2;
об/об) подвижность целевого продукта совпадала с Rf контрольного препарата 2-фторара-А.
Т. пл. целевого продукта 259-260 °С.
УФ-спектр: (pH 1), λмакс нм (ε): 262 (13200); (pH 7 и pH 13), λмакс нм (ε): 261 (15300).
ЯМР: 3,7(м, Н4' и 2Н5'), 4,15 (м, Н2' и Н3'), 5,1 (т, 5'-ОН), 5,55 и 5,65 (2д, 2'-ОН и 3'-ОН),
6,14 (д,J1'2' 3 Hz, Н1'), 7,8 (уш. с, NH2), 8,2 (с, Н8).
Пример 2.
Условия примера соответствуют описанным в примере 1 за исключением того, что
процесс ведут при 58 °С и концентрациях 2-фтораденина и ара-У в исходной реакционной
смеси, равных 55 и 110 мМ соответственно.
После выделения из реакционной смеси получают 12,87 г (75,2 мол. %) 2-фтор-ара-А.
Пример 3.
Условия примера соответствуют описанным в примере 1 за исключением того, что
процесс ведут при 62 °С и концентрациях 2-фтораденина и ара-У в исходной реакционной
смеси, равных 65 и 130 мМ, соответственно.
После выделения из реакционной смеси получают 12,83 г (75,0 мол. %) 2-фтор-ара-А.
3
BY 9975 C1 2007.12.30
Пример 4.
Получение фтор-ара-А при использовании клеток различных бактерий.
Условия примера соответствуют описанным в примере 1 за исключением того, что в
качестве биокатализатора используют клетки различных штаммов бактерий. Достигнутые
выходы реакции синтеза 2-фтор-ара-А (без выделения целевого продукта) представлены в
табл. 1.
Из данных табл. 1 следует, что эффективность штамма Escherichia coli БМ-21 намного
выше эффективности любого из проверенных штаммов бактерий.
Таблица 1
Сравнительная оценка эффективности использования клеток различных штаммов
бактерий в качестве биокатализатора
Выход фтор-ара-А,
Относительная
Штамм бактерий
мол. %
эффективность, %
Escherichia coli БМ-21
92
100
Е. соli БМТ-1Д/1А
60
65
Enterobacter amnigenus БИМ В-245
54
59
Е. coli MRE-600
50
54
Е. coli НВ-101
51
55
Е. соli ЦМПМ В-2039
43
47
Е. coli ЦМПМ В-2035
28
30
Erwinia herbicola BKM-1216
28
30
Erw. herbicola ЦМПМ В-2927
27
29
Пример 5.
Получение 2-фтор-ара-А при использовании различных концентраций клеток бактерий в реакционной смеси.
Условия примера соответствуют описанным в примере 1 за исключением того, что
процесс ведут при различных концентрациях бактериальных клеток в реакционной смеси.
Достигнутые выходы целевого продукта представлены в табл. 2.
Таблица 2
Влияние концентрации клеток бактерий в реакционной среде на выход целевого
продукта
Концентрация клеток бактеПродолжительность
Выход фтор-ара-А, мол. %
рий в реакционной среде, %
процесса, сут.
1,0
50
10
2,0
77
5
2,25
80
4
2,5
80
3,5
Результаты, приведенные в табл. 2, свидетельствуют о том, что оптимальной является
концентрация клеток бактерий, находящаяся в пределах 2-2,5 %, и дальнейшее ее повышение нерационально. С другой стороны, снижение концентрации клеток бактерий приводит к значительному снижению выхода продукта и в несколько раз замедляет процесс.
Представленные материалы свидетельствуют о том, что использование предлагаемого
способа получения 2-фтор-ара-А обеспечивает по сравнению с известным химическим
способом преимущество в виде увеличения выхода целевого продукта в расчете на исходное азотистое основание с 17,5 до 75-80 мол. % и упрощения процесса.
4
BY 9975 C1 2007.12.30
Источники информации:
1. Пивник А.В., Кременецкая A.M., Яхнина Е.И., Романова М.И., Воробьев А.И. Первый опыт лечения зрелоклеточных лимфопролиферативных заболеваний аналогами пурина // Проблемы гематологии и переливания крови. - 1996. - № 2. - С. 55-62.
2. Patent 4357324 US. Prodrug derivatives of 9-β-D-arabinofuranosyl-2-fluoroadenine /
J.A. Montgomery, A.T. Shortnacy.
3. Plosker G., Figgitt D. Oral fludarabine // Drug. 2003. - Vol. 63. - N 21. - P. 2317-2323.
4. Montgomery J., Hewson K. Nucleosides of 2-fluoroadenine // J. Med. Chem. - 1969. Vol. 12. - P. 498-509.
5. Patent 4210745 US. Procedure for the preparation of 9-β-D-arabinofuranosyl-2fluoroadenine / J.A. Montgomery (прототип).
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
5
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
92 Кб
Теги
патент, by9975
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа